Summary
星状細胞は、中枢神経系（CNS）において最も重要な主要なプレーヤーの一つです。ここでは、 インビトロ虚血後の男性と女性の新生児の仔にアストロサイト機能の基礎となるメカニズムを研究するために、有性海馬アストロサイト培養プロトコルの実用的な方法を報告しています。
Abstract
低酸素症/虚血（HI）関連脳損傷後のアストログリオーシスは、新生児における罹患率及び死亡率の増加に役割を果たしています。最近の臨床研究では、脳損傷の重症度は、セックスは依存しているように表示されていることを示しており、男性の新生児は、同等の脳損傷で、女性に比べて、 より深刻な神経学的転帰が得られ、HI-関連の脳損傷の影響をより受けやすいこと。有性海馬アストロサイトの高度に濃縮された集団を分離し、維持するための信頼性の高い方法の開発は、新生児HIの病理学的結果における性差の細胞の基礎を理解することが不可欠です。本研究では、再酸素化に続くインビトロ虚血、酸素-グルコース欠乏のモデルに供される性別特定海馬星状細胞培養物を作成するための方法を記載します。その後の反応性アストログリオーシスはimmunostaiで調べましたグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）とS100BのためのNing。この方法は、個別に、新生児HI以下の男性と女性の海馬アストロサイトの役割を研究するための有用なツールを提供しています。
Introduction
星状細胞は、中枢神経系（CNS）において最も重要な主要なプレーヤーの一つです。証拠の成長体は、アストロサイトの役割は、ニューロンのサポートを提供するよりもあることを示しています。実際には、生理的条件下でアストロサイトの役割は、このような、中枢神経系の血流2を規制、開発軸索1の移動を案内するシナプス間質液3のpHホメオスタシスを維持し、血液脳関門に参加するように、非常に複雑になることがあります4とシナプス伝達5。病理学的条件の下では、アストロサイトは、反応性アストログリオーシス（傷害からの距離に対する）における形態、数、位置、地形と呼ばれるプロセスで傷害に応答し、アストロサイトの機能は、異種の方法6,7に変更されることがあります。多分新生児の罹患率と死亡率に貢献する新生児低酸素性虚血性脳症後に見られる星膠症 最近の臨床と実験研究は、脳損傷の重症度に比べて男性の新生児は、より深刻な神経学的転帰が得られ、低酸素/虚血（HI）関連脳損傷の影響をより受けやすいこと、セックス依存性であることが表示され、ことを示しています同程度の脳損傷9-11とメス。傷害の局在は妊娠期間と期間と侮辱の重症度に依存するが、海馬は用語新生児HI後にCNSにおいて最も一般的に行なわ地域の一つであり、海馬アストログリオーシスを増加させたアップレギュレーションのによって確認されていますグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）新生児HI 7,10,12,13後の3日間。アストロサイトの機能における性差は、脳虚血14,15後の両方の新生児と成人の齧歯類に示しました。また、 インビトロ虚血にオスアストロサイト感受性は増加セル画によって示されました文化16の女性皮質アストロサイトと比較してリットル死。 セックスの違いは、 子宮内開始し、死亡17まで継続します。過去10年間、細胞培養およびin vivoでの研究の実験条件で男女を含むことの重要性は、医学およびNIHの研究所の重点は生理学的および病理学的条件17,18に見られる性差に基本的な知識を求めるようになっています。有性海馬アストロサイトの集団を分離し、維持するための信頼できる方法の開発が新生児HIの病理学的結果における性差の細胞の基礎を理解することが不可欠です。本研究は、誘導、酸素/グルコース欠乏（OGD）と再酸素化（REOX）以下のGFAP免疫反応性アストロサイトの役割を評価するために、新生児マウスからの濃縮された性特異的海馬星状細胞培養物を準備する技術を提供するように設計されました細胞培養環境でHI。この技術は、正常酸素および虚血条件下新生児男性および女性における海馬アストロサイトに関連する任意の仮説を試験するために使用することができます。
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Protocol
注：この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の勧告に従って行きました。動物プロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン、施設内動物管理使用委員会の大学によって承認されました。ここで提示された初代星状細胞培養プロトコルは、張Y 19 らとCengiz P 20 らによって提示されたプロトコルから採用されている。いくつかの変更を加えて。
1.海馬解剖とアストロサイトの文化
- 2 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）それぞれで満たされた氷の上で手術用はさみ、滑らかな細かい鉗子、平坦な先端の鉗子、ペーパータオル、廃棄バッグ、70％エタノールと2解剖皿（直径3.5cm）を含むすべての必要な試薬および材料を準備します。 + DMEM + 5％ウマ血清：手術用機器の事前手続きへ（オートクレーブ）滅菌されていることを確認し、他のすべての材料（アストロサイトメッキ媒体を用います1％ペニシリン-ストレプトマイシン、ウマ血清、HBSS、0.25％トリプシン、カバーガラス、ペトリ皿、15/50 mLチューブ、T25フラスコ、 など ）予め滅菌など。
- 静かに保持し、スプレー、マウスの子犬の頭と首を70％エタノールでシャープな滅菌ハサミを使って首をはねる[ 図1（1）]。
- 脳[ 図1（2-3）]を公開するために頭皮に沿って小さなハサミで頭蓋骨を前方ために後方から正中切開を行います。
- 小さなはさみで鼻に首から慎重に頭蓋骨をカットします。そして、頭蓋底から頭蓋を切断する小脳に嗅球と下に頭蓋前方をカット。
- 頭蓋底に小さな切開を行い、正中線に沿って切断。頭蓋骨を剥がすために滅菌フラット先端鉗子を使用してください。湾曲した鉗子の助けを借りて、脳幹を削除します。頭蓋から脳を削除し、最初の解剖皿に置く[ 図1（4-9）] 21。
- 湾曲した鉗子を使用すると、脳の腹面が上を向くように脳を反転した後、鋭利な無菌手術用刃[ 図1（10,11）]との両半球を分離します
- ピールバック大脳半球と慎重には、海馬、内側頭葉[ 図1（12-14）]の小さい、タツノオトシゴ状の構造を明らかにするために、無菌の平らな湾曲鉗子で膨らみ、中脳と視床組織を取り除きます。
- 海馬ローブ[ 図1（15,16）]の両方を取り外し、慎重に微細な鉗子で引いて、葉から髄膜を分析。このステップは、髄膜細胞および線維芽細胞によって最終的な星状細胞培養物の汚染を避けることができます。
- HBSSで充填された第2皿に準備された海馬のローブを移し、氷[ 図1（17,18）]の上にそれを返します。カバの製造方法 - 単一のマウスからプールの両方の海馬のローブ（P2 P0）campalの星状細胞培養物。これは、アストロサイト、適切な密度を提供します。鋭い無菌手術用ブレード（約4倍）を用いて、海馬葉をみじん切りに。
- 皿から吸引しHBSS 1 mLのピペットに取り付けられた滅菌チップを使用し、0.25％トリプシンの3 mLを加え混ぜ、15 mLの滅菌コニカルチューブに移し、穏やかに振盪しながら20分間37℃で組織をインキュベートします。
- 5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ラインに取り付けられた滅菌ガラスピペットを用いて上清を吸引。組織片が均質化するまで、火災研磨したガラスピペットを用いて - （30回20）メディアと粉砕物をメッキ10 mLのアストロサイトを追加します。
- 5分間、300×gで遠心分離管。上清を吸引し、メディアをメッキ新鮮予め温めアストロサイトの2 mLを加え。新しい50 mLコニカルチューブに70ミクロンメッシュフィルター（セルストレイナー）を介して細胞を渡します。
- の3 mLを含むポリ-D-リジン/ラミニンコーティングされた無菌のT25培養フラスコにプレート全体の細胞懸濁液メディアメッキアストロサイトは、その後、5％CO 2インキュベーター中、37℃でフラスコをインキュベートします。
- 昼間で吸引し、メディア全体I N-試験管内 （DIV）1、DIV 3およびDIV 7、新鮮なアストロサイトメッキ培地2mLで交換してください。アストロサイトメッキメディアを交換しながら、光学顕微鏡下たびに進行し、アストロサイトの合流を観察します。
注：DIV 1では、すべての実行可能な星状細胞は培養フラスコの表面に付着され、神経細胞を含む死亡または瀕死の細胞は、上清中に浮遊しています。 DIV 3では、付着した細胞は、星状細胞層を形成するために分裂し始めます。支持条件の非存在下で、培養物は、任意のニューロン成長のほとんどを欠いています。 DIV 7では、アストロサイト層は約80 - 90％コンフルエントといくつかのミクログリアだけでなく、オリゴデンドロサイト前駆細胞アストロサイト層の上に存在しています。 - 吸引除去し、フラスコからメッキ媒体、すすぎ、培地をメッキ新鮮予め温めアストロサイトの2 mLを加えNDアストロサイトがコンフルエント培養をサブするための準備ができているとき、DIV 11で再び削除します。
- 静かに滅菌ガラスピペットを用いてフラスコを数回吸引トリプシンを回転させ、0.25％トリプシン2mLのを追加します。
- 0.25％トリプシンの2 mLを加え、フラスコが4のための組織培養フードに座ってみましょう - RTで5分。
- トリプシンを削除し、10分間、5％CO 2インキュベーター内で37℃でフラスコを保ちます。 5 mLの培地をメッキアストロサイトを予め温め追加し、あなたの手のひらに対してフラスコをタップして星状細胞層を切り離し（3から4回）完全な分離を達成し、15 mLのコニカルチューブにアストロサイトを収集するために、穏やかな粉砕しました。
- 遠心管は、5分間300×gで、上清を吸引し、1mLの新鮮なアストロサイトメッキ媒体を追加します。
- 血球計数器に細胞懸濁液の10μLを追加し、倒立位相差顕微鏡（10倍対物レンズ）を使用して、大きな中央グリッド面積（1ミリメートル2）で細胞を数えます。ムルtiply 10 4でミリリットル当たりの細胞数を推定します。 One T25フラスコは〜1×10 6合計解離した細胞が得られます。シード〜1×10 24ウェル培養皿のウェル中の12ミリメートル直径ポリ-D-リジンプレコーティングしたガラスカバースリップ上に2 mLのアストロサイトメッキ培地中で5個の細胞。
- 5％CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 14（セクション2） - DIV 12でOGD / REOXを実行します。
- ミクログリアを欠い海馬培養が望ましい場合DIV 11まで5 mMのL-ロイシンメチルエステル（LME）塩酸塩DIV 3で星状細胞培養物を扱います。 LMEのインキュベーションの後、対象の文化の汚染ミクログリアを除去するために（1時間300 rpm）し振とうします。
注：LMEが増殖ミクログリア22を除去する方法として広く使用されてきた小グリア細胞毒性剤です。
2. OGD / REOXトリートメント
- カバースリップから培地を吸引し、接着性アストロサイト培養物（DIV 12から14）を含有し、3回すすぎ静かにカバースリップを（mM単位）を含有する1mLの等張OGD液（pH7.4）で数回保持24ウェル培養皿回転させることによって：0グルコースを、21のNaHCO 3、120のNaCl、5.36のKCl、0.33のNa 2 HPO 4、 0.44 KH 2 PO 4、1.27のCaCl 2、および0.81のMgSO 4。
- カバースリップをカバーし、94％のN 2、1％O 2および5％CO 2を含有する低酸素培養器中で2時間インキュベートするウェルに0.2mLのOGDの溶液を加えます。静かにガス交換を容易にするために、低酸素状態の最初の30分間オービタルシェーカー（50回転）と混合。
- 5.5 mMグルコースの追加を除き、OGD液と同一の緩衝液中の5％CO 2および大気中で2時間の正常酸素対照細胞をインキュベートします。
- REOXについては、吸引OGD液と培地をメッキアストロサイトの2 mLを加え。 5時間、37℃で5％CO 2大気中でインキュベートします。
3.免疫細胞化学染色</ P>
- 真空ラインに取り付けられた滅菌ガラスピペットを用いて培地を吸引し、すぐに0.1 Mトリス緩衝生理食塩水（TBS）の1mLのを添加することによってカバースリップを一度リンス（154ミリモルのNaCl、16mMのトリズマ塩基、84 mMのトリス-HCl、pH7.4）でウェルに。吸引し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）を2mLを加えます。 RTで15分間インキュベートします。
- 吸引し、0.1 M TBSの1 mLを加え、次に2分間、ロッキングシェーカー上に置きます。 3回繰り返します。溶液（10％のヤギ血清、0.1 M TBS中10mg / mLのBSA、0.025％トリトンX-100）をブロック1ミリリットルを加え、ロッキングシェーカー上にて37℃で30分間インキュベートします。
- 60分間およびウサギポリクローナル抗S100B（1：500）またはウサギポリクローナル抗HIF1α（200 1）：吸引して溶液と一次マウスモノクローナルを追加抗GFAP抗体（ブロッキング溶液中で500倍希釈の0.2 ml）をブロックしますロッキングシェーカー上で37℃で。
- マウス月：あるいは、いくつかの星状細胞は、ウサギポリクローナル抗IBA1（200 1）とインキュベートします文化純度にアクセスするためのoclonal抗MAP2。
- 吸引した一次抗体および0.1 M TBS 1mLのを追加し、2分間、その後、吸引用のロッキングシェーカー上に置くことによってカバースリップをすすぎます。二回繰り返します。
- ロッキングシェーカー上にて37℃で60分間、ブロッキング溶液中で二次ヤギ抗ウサギ488結合抗マウス568結合抗体の200倍希釈1の0.2 mLを加え。
- 吸引した二次抗体と2分した後、吸引用のロッキングシェーカー上、0.1M TBSと場所の1ミリリットルを追加することにより、カバースリップをすすぎます。二回繰り返します。
- スライド乾燥機の上に位置するスライド上に配置することにより、ウェル・ドライからカバースリップを削除します。 VECTASHIELDの一滴に反転させることによって新しいスライドにマウントカバースリップは、DAPI（1.5 ngの/μL）でマウンティング培地をhardset。
- どちらか20X乾式または60X油浸対物レンズを用いた共焦点顕微鏡の画像カバースリップ。 DAPI用の画像（512×512）を取得（405 nmの元/ 450 nmのEM）と蛍光色素488（488 nmの元/ 515 nmのGFAP抗体をタグ付けしました。EM）。 20Xと60Xグループ内で一定収集パラメータを保管してください。
PCRを使用して4.セックス決意
- 50mMのNaOH中で45分間95℃で熱子犬つま先や指の切り抜きと1 Mトリス、pHを6.8等量の中和。
- MyogとSRY遺伝子のためのプライマーの5ピコモル、1×反応緩衝液、0.2mMの各デオキシヌクレオチドおよび8 UのTaqポリメラーゼ：以下の混合物の19μLに抽出したDNA溶液1μLを追加します。
- プライマー配列を使用します。 SRY 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 '、5'CATGACCACCACCACCACCAA3'とMyog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 '、5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3」23。
- 1分間、72℃で15秒間、58℃で15秒、アニーリング95℃で3分間の変性の後、30サイクルの95℃、伸び：以下のPCRプロトコールを実行します。この30サイクルの後、反応物を1分間の最後の72℃の伸長で終了します。
- 個別のPCR製品は、電気泳動、エチジウムブロマイドを含む2％アガロースゲル上で、紫外線照射下で可視化します。 （ 図2A）。 注意！臭化エチジウムは、潜在的な発がん性物質であり、慎重に処理し、金融機関の規制に従って適切に処分しなければなりません。
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Representative Results
生理学的または病態生理学的条件の下で有性アストロサイト機能の役割を理解することは非常にインビトロ条件下でこれらの細胞を培養することによって明らかにされています。有性培養を行うことの重要な態様は、使用前に、マウスの仔の性別を決定することです。我々は遺伝的PCRによって、および視覚的評価（ 図2）16によってマウスの性別を決定します。 PCRを用いセックス決意の方法論はMcCliveとシンクレアから修正を加えて採択された、迅速、簡単でかつ再現性の高い方法23である。 図2Aは 、PCRを使用してセックス決意の代表的な結果を示しています。 PCR産物は2つの代表的なP1男性と女性の尾切れ端から抽出したDNAを用いて作製しました。反応は441 bpおよび女性specifのオス特異的なバンドを生成SRYとMyog遺伝子のための多重プライマー対を含み、それぞれ245塩基対のICバンド。新生児の視覚決意（P 1から3）肉眼でマウスの性別は雄のみで肛門性器の開口部との間に小さな暗くスポット（ 図2B）16,24の存在を探すことによって設立されました。
アストロサイトの培養は便利で設定し、実験室の下に確立することは比較的容易である、が、この利点は、主により少ない程度にミクログリアまたはニューロンとその汚染によって妨げられることができます。アストロサイトの汚染が容易にミクログリア（IBA1）またはニューロンのいずれかのための細胞特異的なマーカー（MAP2）で培養した細胞の免疫標識によって決定することができます。 IBA1（ 図3）を発現し、いくつかの細胞により示唆されるように本研究では、一次単層培養で増殖海馬アストロサイトは、DIV 14に混入ミクログリアの〜6％を有することが観察されました。逆に、細胞のいずれも示唆しているMAP2を発現することが見出されませんでした文化は、任意の神経汚染（ 図3）を全く欠いていました。 3日齢の仔マウス25 -著者は1から派生し、その一次皮質星状細胞培養物に5％ミクログリア汚染を報告し、請求たちの培養で観察マイナーミクログリア汚染は、他の報告によるものです。アストロサイトは、彼らが低酸素症を含め、それらの微小環境の変化に対応することを可能にする特定の細胞構築を保有します。 インビトロ虚血に任意の性別固有のアストロサイトの応答を決定するために、我々はOGD / REOXに有性海馬アストロサイトを施しました。 OGD / REOXの成功誘導はHIF1αが正常酸素条件下での細胞中のHIF1α式（ 図4と比較して5時間REOX続いて2時間のOGDにかけGFAP +アストロサイトで観察された（低酸素誘導因子1αの増加核発現により決定しました）。
図5）が得られました。これらの細胞は、それらの神経幹細胞（NSC）26潜在能力を失う傾向がある場所GFAPおよびS100Bは、成熟した星状細胞の発達段階を特徴づける、アストロサイトの細胞質と細胞体に共局在しました。それぞれの正常酸素およびOGD / REOX治療群で観察されるような形態およびGFAPまたはS100Bの免疫反応性の密度は、両方の男性と女性の星状細胞培養物において同様でした。共焦点顕微鏡を用いて評価として、;正常酸素条件下では、海馬アストロサイトは紡錘形する多角形とフラット形態[（矢印60X酸素正常状態） 図5A、B]を発表しました。これらの細胞は、前OGD / REOXの誘導に約2週間のコンフルエントになるまで分割することができました。 2時間のOGDと5時間REOX後、アストロサイトは、古典をReactiを示しましたアストロサイト引き込ま主要なプロセスを表示する形態、ソーマとプロセスの肥大、およびGFAPの発現増加またはS100B VEの[ 図5（a）に、B（OGD / REOX、60X;矢印）]。 OGD / REOXに続いて、GFAP / S100Bの染色も男性と女性の海馬アストロサイトの両方で細胞質を横切って延びる大規模な網目構造を示しました。 GFAP欠損マウスから培養海馬アストロサイトで観察されたGFAP染色の欠如は、陰性対照（ 図5B、挿入図）を務めていました。上記の結果は、OGD-REOXにさらされたときGFAP / S100B免疫反応性アストロサイトの形態は有意な変化を受けることの直接的な証拠を提供します。
P1マウスから海馬除去技術の 図1. イラスト。1。頭を削除するには、子犬を刎ねます。2、3細かいハサミを使用して、皮膚の正中切開を行い、後方前方、およびフラット先端鉗子の助けを借りて、皮膚をバック剥離する。4、5、6。の基部に小切開を加えます頭蓋骨。正中線に沿って頭蓋骨をカットし、脳を露出させるために2つの半体を引き剥がす。7、8。湾曲した鉗子の助けを借りて、小脳を削除してください。9。慎重に滅菌ペトリ皿に頭蓋と場所から脳を削除します。10、11。脳の腹面が湾曲鉗子を使用して上を向いているように、その後、鋭い無菌の外科用ブレードを用いて両半球を分離し、脳を反転します。12、 13、14。膨らみ、中脳と視床組織無傷の基礎となる半球を残し、海馬を明らかに削除します。15、16。海馬（小C字型構造）を取り外します。17、18すぐの両方から得られた海馬ローブを置きますで半球滅菌HBSSを含む別のペトリ皿。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
新生児マウスの 図2. セックス決意。A。 （; M 1 F 1）マウスの性別は、遺伝的にMyog（X染色体）と指やつま先の切り抜きから抽出したDNAを用いて、SRY（Y染色体）の遺伝子に特異的なプライマーを用いたPCRによって決定しました。 PCRのバンドをUV照明の下で臭化エチジウムを有する2％アガロースゲル上で可視化しました。 F 2およびM 2はそれぞれ、女性と男性のための陽性対照とした。B。女性から男性の視覚決意は、肛門性器の開口部（矢印）との間に暗くなったスポットを識別することによって設立されました。urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
神経細胞のマーカーMAP2（赤）とミクログリアマーカーIBA1（緑）とアストロサイト培養物の初代マウス海馬アストロサイトの文化。免疫染色の 図3. 純度 。核は4 '、6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（青）で染色します。矢印は、ミクログリアの汚染を示しています。スケールバー：50μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.HIF1α 式がでました（A）酸素正常状態または（B）OGD（2時間）/ REOX（5時間）にかけアストロサイトにおけるGFAP（赤）とHIF1α（緑）の標識を示すOGD / REOXにさらされる培養海馬アストロサイトにしわ。代表的免疫蛍光画像。核は4 '、6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（青）で染色します。アロー、低HIF1αの発現;矢じりは、HIF1α核発現を上昇しました。スケールバー：25μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. アップレギュレーションOGD-REOXを次の有性海馬アストロサイト培養におけるS100BまたはGFAP発現の。有性培養海馬アストロサイトは正常酸素条件下でまたは2の後にS110BまたはGFAP発現について染色しました時間OGDはREOXの5時間（OGD / REOX）が続きます。挿入図は：海馬アストロサイトからの60Xの画像は、GFAP欠損マウスから培養しました。スケールバー：30μmです。
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Discussion
生理学的および病理学的条件の下での特性とアストロサイトの機能における性差を研究するために、細胞培養における有性初代星状細胞の調製は、利用するための重要なツールです。本研究では、in vitroで新生児から有性海馬アストロサイトの高濃縮均質な集団（P0-P2）C57BL / 6（野生型）またはK19F（GFAPヌル）仔マウス高効率と文化に再現性のある方法を報告しています。この方法論を確立することは、研究者は、 インビトロ虚血後有性海馬アストロサイトの生理学的および病理学的機能を理解するのに役立ちます。
単一細胞懸濁液を達成するために消化された組織の粉砕し、その後、トリプシン処理中に無菌性および海馬ローブの適切な消化の維持を含め、この方法論を確立する上で2つの重要なステップがあります。初代星状細胞の予防から汚染されたばかり培養プロセス全体を通じて最大の課題の一つです。細菌および/または真菌は、技術を実行しながら、適切なケアが採用されていない場合は無駄な培養細胞をレンダリングすることができ、汚染の2つの一般的なモードです。したがって、実験の成功を確保するためには、無菌の外科用器具および材料を用いて、使用前に職場を消毒含む滅菌作業の設定の下で処理を行うことが不可欠であり、Aを使用して、非滅菌表面を有する滅菌物質との接触を避けます層流フードと層状フードの外にキャップされていない培養フラスコを服用を避けます。また、酵素的解離の際に、大規模な物理的粉砕して、その後トリプシンで海馬組織のより長いインキュベーションは、貧しい細胞生存率及び培養フラスコに解離した細胞の非効率的な取り付け、その結果、その過剰消化につながることができます。
逆に、脳組織のunderdigestionが不十分提供しますこれにより、歩留まりが悪いと大きな塊のような細胞の播種の結果グリア細胞の解離。したがって、健康な星状細胞培養物を得るためには、海馬組織の最適な消化を達成するために、トリプシンの濃度、インキュベーション時間および粉砕を最適化する必要があります。私たちの手では、20のための穏やかな粉砕し、続いて室温で20分間、0.25％トリプシンの作用濃度と海馬ローブのインキュベーション - 30倍は強い接着性、健康的で再現性の高い星状細胞培養物が得られました。また、凍結およびその有効性を減少させることができるたびに、使用前に試薬の解凍を繰り返しました。したがって、それは小さな望ましい量と凍結で一定分量の試薬にとって非常に重要です。例えば、使用するまで-20℃での多数の滅菌コニカルチューブ中の50mLのアリコートとして5mLのアリコートとウシ胎児血清などの店舗トリプシン、ペニシリン/ストレプトマイシン。我々は、有効期限を超えて抗生物質を使用しないことをお勧めします。
GFAPはAWです反応性繊維状アストロサイトのマーカーをエル-特徴。 OGD / REOXに続いて、反応性アストログリオーシスに応答して、GFAPの発現のアップレギュレーションは、20を報告されています。それはGFAPの過剰発現は、神経修復戦略のための特定の標的として使用できることが提案されているが新生児HI後の海馬の損傷27の役割は依然として不明です。 GFAPとアストロサイトの免疫組織化学染色は、生理学的および病理学的条件の下でこれらの細胞を識別し、特徴付けるために私たちを可能にします。任意の他のマーカーのようなGFAP染色を認識する必要があるいくつかの制限があります。星状細胞のGFAP染色の制限の一つは、すべての星状細胞は、生理的条件下でGFAPを発現することです。特にGFAPの未成熟アストロサイトの発現率は、生理的条件下28の下で、40％を超えません。星状細胞の年齢およびタイプに固有の用途に応じて、任意の他のマーカーは、GLAST、ALDのように考えることができますH1L1、BLBP、アクアポリン4とS100B 29。
また、初代培養におけるアストロサイトを装ったNSCの存在を除外することはできません。これらのNSCは、GFAPの発現を含むアストロサイトを成熟させる類似の表現型および超微細構造の特性を提示することが示されています。そのため、完全に分化し、成熟したアストロサイトに特異的な分子マーカーの同定は必見です。アストロサイトは、それらの後に完全に分化発達段階でのS100Bを発現することが報告されました。最近、新生児皮質GFAP +アストロサイトは、約DIV 15 26起こる S100B発現の開始との始原幹細胞の可能性を失うことが報告されている。同様に、DIV 14における我々の培養条件下で、GFAP発現細胞の91％がことがわかりました文化は主に最終分化成熟海馬アストロサイトから構成されていることを示唆している共発現S100B、。
星状細胞単層の上方および下方に存在するミクログリア細胞の混入を全く欠いている純粋な初代海馬星状細胞培養物を得ることはほとんど不可能です。したがって、アストログリア細胞の培養物においてミクログリアの汚染の割合を知ることが、また可能な限り低く、この比率を維持することが重要です。本研究において、我々は、潜在的な汚染物質のような任意の小膠細胞または神経細胞の存在を決定するために、小膠細胞特異的マーカーIBA1またはニューロンマーカーMAP2で星状細胞培養物を染色しました。げっ歯類の星状細胞培養におけるミクログリアの割合は、動物の年齢、種、部位、培地、方法を継代培養し、30振とうを含むいくつかの要因に依存して、1％から30％まで変化してもよいです。私たちの文化では、我々は他のレポート25に匹敵するミクログリア汚染の約6％を観察しました。アストロサイト培養物の意図された使用は、炎症における海馬アストロサイトの役割を研究することである場合、それは絶対に必要です星状細胞培養物DIV 3からLMEを開始するに可能ミクログリア汚染を除去するために10日間の5mM LMEで培養物を処理することは増殖ミクログリア20,22を除去する方法として広く使用されてきた小グリア細胞毒性剤です。また、LME処理培養物を振とうプロトコル（1時間毎分300回転）に供されるべきです。
OGD / REOXを行う際に他の技術的課題は、低酸素の十分にアストログリオーシスを誘導することが達成されたかどうかを決定することです。アストロサイトにおける低酸素のためのマーカーはGFAPのアップレギュレーションおよびHIF-1αの誘導を含みます。したがって、本研究において、低酸素は、GFAP免疫反応性の増加（データは示さず）およびHIF1-α染色の上方制御（ 図4）によって確認されました。
要約すると、有性新生児の海馬星状細胞培養物から得られた結果は、健康な均質な星状細胞層ジに成功した細胞付着を示しました。典型的なカバースリップ上の形態およびインビトロ虚血の誘導の際の主要な反応性アストロサイトマーカーGFAPおよびS100Bの発現を扇形に開きます。私たちは、ここで採用プロトコルは男性と女性の脳の開発にアストロサイトの役割に関連する重要な機構的および翻訳の質問に答えるために可能性を秘めていると信じています。既存の技術の大部分とは対照的に、全体の培養手順は、実験の迅速なターンアラウンドを付与する、2週間で成熟したコンフルエント有性海馬アストロサイトを生成し、技術のシンプルさは、セックスを研究するためのツールとしてアストロサイト培養方法の使用を容易にしますそれによって、脳研究の広い普及を可能にする脳の開発にグリア細胞の特異的な役割。
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Disclosures
著者のいずれも競合しないか、利害の対立しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | Cell-culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | Cell-culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | Rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
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