Abstract
الخيطية بروتين الأكتين (F-الأكتين) يلعب دورا رئيسيا في spinogenesis، اللدونة متشابك، والاستقرار متشابك. تغييرات في الهياكل الغنية شجيري-F الأكتين تشير التعديلات في سلامة متشابك والاتصال. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لزراعة الفئران الأساسي العصبونات القشرية، تلطيخ Phalloidin للنقاط وF-أكتين، وتقنيات القياس الكمي لاحقة. أولا، وفصل القشرة الأمامية من أجنة الفئران E18 في زراعة الخلايا منخفض الكثافة، ثم الخلايا العصبية المزروعة في المختبر ل12-14 يوما على الأقل. بعد العلاج التجريبية، هي ملطخة الخلايا العصبية القشرية مع AlexaFluor 488 Phalloidin (لتسمية نقاط وF-أكتين شجيري) والمرتبطة أنيبيب بروتين 2 (MAP2، للتحقق من صحة الخلايا العصبية وسلامة شجيري). وأخيرا، يتم استخدام برنامج خاص لتحليل وتحديد التشعبات العصبية تم اختيارها عشوائيا. F-الأكتين هياكل الغنية التي تم تحديدها في الدرجة الثانية الفروع الشجيرية (مدى طول 25-75 و# 181؛ م) مع المناعي MAP2 المستمر. فإن بروتوكول المعروضة هنا تكون وسيلة مفيدة لتحقيق تغييرات في هياكل المشبك الجذعية لاحقة لعلاجات تجريبية.
Introduction
الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لقياس (تقدير) من سلامة متشابك من شبكة الجذعية العصبية. نحن هنا وصف الكمي من نقاط وF-أكتين في الخلايا العصبية مثقف الفئران الأساسي باستخدام مزيج من تلطيخ Phalloidin وكشف immunocytochemical (ICC) من التشعبات مع تحليل لاحقة باستخدام (NIS-عناصر) البرمجيات المتخصصة.
phallotoxins المسمى يكون تقارب مماثلة لخيوط الكبيرة والصغيرة (F-الأكتين) ولكن لا ربط أحادى الأكتين كروية (G-الأكتين)، خلافا لبعض الأجسام المضادة الأكتين 1. غير محددة ملزمة من Phalloidin لا يكاد يذكر، وبالتالي توفير الحد الأدنى من الخلفية أثناء التصوير الخلوي. Phalloidin هو أصغر بكثير من الأجسام المضادة التي من شأنها عادة أن تستخدم لتسمية البروتينات الخلوية للفحص المجهري الفلورسنت، والذي يسمح لوضع العلامات أكثر كثافة بكثير من F-الأكتين من قبل Phalloidin. وهكذا، صورا تفصيلية للتوطين F-الأكتين في الخلايا العصبية يمكن أن يكونالحصول عليها من خلال استخدام Phalloidin المسمى.
Phalloidin (F-الأكتين) تلطيخ من التشعبات العصبية يولد "النقاط الساخنة" منفصلة أو مشرق "نقاط و"، التي تمثل مجموعة متنوعة من هياكل الجذعية، بما في ذلك العمود الفقري ناضجة، نقاط الاشتباك العصبي غير شائك 2 والعمود الفقري غير ناضجة. وتشمل العمود الفقري غير ناضجة أرجل كاذبة خيطية رفيعة وبعض أشكال التصحيح التشكل، وربما تمثل بدء spinogenesis 3. العمود الفقري غير ناضجة وبقع غير شائك تفتقر PSD95 4. التغيرات في إنتاج الرصاص F-الأكتين لتغييرات لاحقة في العمود الفقري فحسب، بل أيضا الهياكل شجيري إضافية، مما يجعل Phalloidin أداة هامة لتحقيق سلامة synaptodendritic 5-7. بشكل عام، عدد Phalloidin إيجابية (F-الأكتين) نقاط وتعكس التوازن بين نقاط الاشتباك العصبي نشطة (مثير والمثبطة)، وديناميات الأكتين والاستقرار المشبك 8.
على الرغم من أنه من المهم دراسة ر محددةypes من نقاط الاشتباك العصبي (أي العمود الفقري مثير)، عندما يكون الهدف من العلاج هو معروف فإنه من الضروري تقدير أولا سلامة العامة من مجموعة متنوعة من هياكل الجذعية. منذ F-الأكتين عنصرا رئيسيا في العمود الفقري شجيري وغيرها من الهياكل، بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي المثبطة، عدد غيرت من نقاط وF-أكتين قد تشير إلى وجود synaptopathy. ويمكن بعد ذلك مزيد من التحقيق في هذا synaptopathy لإجراء تعديلات أكثر تحديدا. لدينا طريقة القياس الكمي للكشف عن عدة متشابك أنواع / الهياكل غلة تقدير عام للتغييرات متشابك شجيري (الزيادة والنقصان) في أعقاب العديد من العلاجات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استعراض جميع البروتوكولات الحيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام في جامعة ولاية كارولينا الجنوبية (رقم ضمان: A3049-01).
1. منخفضة الكثافة الجنينية العصبية الثقافة
- استعدادا للثقافة العصبية القشرية الأولية
- الحلول:
- إعداد بولي-L-ليسين حل الأسهم عن طريق إذابة 5 ملغ من بولي-L-ليسين في 10 مل العازلة بورات.
- يعد حل العاملة عن طريق تمييع 1 مل بولي-L-ليسين المالية في 49 مل بورات العازلة.
- إعداد بورات العازلة، ودرجة الحموضة 8.4 من خلال البدء مع 395 مل O 2 درهم ثم إضافة كافة المكونات (1.24 غ حمض البوريك + 1.9 غرام من البوراكس). ضبط درجة الحموضة إلى 8.4 من 1 M هيدروكسيد الصوديوم. ضبط 400 مل وتصفية مع 0.2 ميكرون تصفية غشاء النايلون تحت غطاء محرك السيارة.
- يعد حل HBSS، ودرجة الحموضة 7.2 من خلال البدء مع 445 مل درهم 2 O وإضافة جميع المكونات الأخرى (50 مل 10X HBSS المالية + 1.2 غرام HEPES). ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 من 1 N حمض الهيدروكلوريك، وبرينانوغرام إلى 500 مل وتصفية مع 0.2 ميكرون تصفية غشاء النايلون تحت غطاء محرك السيارة.
- إعداد المتوسطة تصفيح: DMEM / F12 مع 10٪ الجنين المصل البقري. مرشح مع 0.2 ميكرون تصفية غشاء النايلون تحت غطاء محرك السيارة.
- إعداد متوسط النمو الكامل: ل50 مل Neurobasal المتوسطة، إضافة المكملات الغذائية (500 ميكرولتر GlutaMax (100X) + 500 ميكرولتر الجلوكوز + 1 مل B-27 (50X) + 500 ميكرولتر من محلول مضاد حيوي، مضاد فطري (100X) + 100 ميكرولتر 7.5٪ بيكربونات الصوديوم. فلتر مع 0.2 ميكرون تصفية غشاء النايلون تحت غطاء محرك السيارة.
- قبل يومين الثقافة:
- معطف اثني عشر 35 ملم أطباق الزجاج السفلي مع 2 مل من محلول العمل بولي-L-ليسين، والحفاظ على تحت غطاء محرك السيارة O / N.
- قبل يوم واحد الثقافة:
- فارغة عامل طلاء من الأطباق وشطف مع ده 2 O. السماح للأطباق لتجف لمدة ساعة تحت غطاء محرك السيارة.
- إعداد المتوسطة الطلاء (DMEM / F12 مع 10٪ مصل بقري جنيني (10٪ من الحل الكلي). الماصة 2 مل المتوسطة فيكل طبق، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
ملاحظة: من المهم تجنب أطباق ثقافة البلاستيكية عند زراعة. استخدام الأطباق الزجاجية القاع (لالمجاهر المقلوب) أو coverslips الزجاج (لالمجهر تستقيم) ينتج صورا حادة وواضحة. بالمقارنة مع طبق من البلاستيك أسفل، وطبق من الزجاج السفلي يتجنب الأشكال غير المرغوب فيها أو وهج خلال المجهر الفلورسنت.
- الحلول:
- بروتوكول زراعة الخلايا:
- وطرح المبردة HBSS العازلة (100-150 مل)، 100 مم أطباق بتري، ملقط، مقص، 50 مل أنابيب، و 15 مل أنابيب تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة.
- الموت ببطء الفئران الحوامل مع استنشاق قاتلة من 5٪ سيفوفلوران تحت غطاء محرك السيارة خارج غرفة الثقافة.
- تعقيم مع 70٪ ETOH، خيمة جلد البطن باستخدام ملقط في حين خفض من الذيل يصل في منتصف البطن cavity.Open الرحم باستخدام مقص لفضح المشيمة.
- إزالة 8-10 الأجنة E18. جيش التحرير الشعبى الصينىم 8-10 الأجنة في أطباق بتري تحتوي على حل HBSS.
- عقد الجزء الخلفي من رأس الجنين بالملقط، ثم استخدام مقص لقطع الرأس من الجسد. وضعه في طبق بتري أخرى مليئة 5-7 مل من HBSS. نقل طبق على غطاء محرك السيارة.
- ملء اثنين إضافيين طبق بتري 100 ملم مع HBSS الباردة.
- قشر جانبا الجمجمة، ومغرفة الدماغ في طبق بتري جديدة مليئة HBSS.
- استخدام ملقط منحنية حادة، المخيخ منفصل وجذع الدماغ من المخ، ثم نقل الدماغ على طبق بتري جديد مع HBSS الباردة في ذلك.
- استخدام ملاقط لتأمين فصل نصفي الكرة الأرضية مع ملقط المنحنية. إزالة السحايا. عزل القشرة الأمامية وقطع نقل إلى تميز أنابيب الطرد المركزي 15 مل.
- ملء أنبوب 15 مل مع الطازجة 2 مل HBSS وإضافة 20 ميكرولتر التربسين EDTA (10X مزيج مركزة مع 0.5٪ التربسين و 5.3 ملي EDTA) إلى كل أنبوب 15 مل.
- احتضان 10-15 دقيقة في RT. دوامة بلطف أنبوب كل بضع دقائق، لا تسمح تسوية.
- بالعربيةثالثا 10-15 دقيقة، واستخدام الزجاج ماصة لإزالة HBSS القديم وشطف مرتين مع HBSS الجديد.
- تزج في مثبط التربسين (1 ملغ / مل، 2 ملغ التربسين المانع في 2 مل HBSS)، وتخلط جيدا، والسماح لها الجلوس 5 دقائق. يغسل مرتين مع HBSS الطازجة.
- باستخدام ماصة الزجاج مع لمبة المطاط، وقطع الدماغ يسحن 10-15 مرات ببطء شديد وذلك لتجنب bubbles.Triturate مرة أخرى باستخدام ماصة معايرة وتلميح العقيمة التي يبلغ قطرها طرف انخفاض ببطء شديد حتى متجانسة.
- نقل فصل الخلايا في كثافة المطلوبة لأطباق ثقافة المغلفة (50 خلية / MM2) مستعدين قبل. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO2.
- بعد 24 ساعة، استبدال المتوسطة DMEM / F12 مع تقدم طازجة النمو الكامل المصل خالية Neurobasal المتوسطة.
- الحفاظ على الخلايا في جميع الأوقات في 5٪ CO 2/95٪ هواء الغرفة حاضنة مرطب لل12-14 يوما على الأقل قبل التجريب. استكمال خلايا كل 5-6 أيام مع Neurobasal متوسطة جديدة تحل محل ما يقرب من 50٪ من متوسط العمر.
2. بطاقات المواد الفلورية وسيتولوجية مناعية
ملاحظة: تم تنفيذ وسم مناعي من مزارع الخلايا القشرية الأولية في أسفل أطباق زراعة الخلايا الزجاج 35 ملم مع حجم العمل من 1 مل.
- غسل طبق من الزجاج السفلي مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة 7.4 درجة الحموضة (PBS).
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة في RT.
- غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وpermeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- علاج الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT مع وصمة عار محددة F-أكتين، AlexaFluor 488 Phalloidin (01:40، 25 ميكرولتر من Phalloidin في 1 مل PBS).
- شطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني ومنع مع 10٪ مصل الماعز العادي في RT لمدة 1-2 ساعة.
- تمييع الأجسام المضادة بولكلونل الدجاج مكافحة MAP2 (1: 2500) في برنامج تلفزيوني مع 2٪ مصل الماعز العادي واحتضان O / N عند 4 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، وشطف في برنامج تلفزيوني مرتين.
- تمييع الضد الثانوية (اليكسا Rإد الماعز 594 مترافق مفتش مكافحة الدجاج (1: 500) مع 2٪ مصل الماعز العادي واحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
- شطف مع برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولتر / طبق من Hoescht صبغ.
- احتضان 3 دقائق على RT ويغسل مع برنامج تلفزيوني مرتين.
ملاحظة: الخلايا المسمى الآن جاهزة للخطوة 3 (F-الأكتين نقاط والعد مستمر). - الحفاظ على عينة الخلايا مع 100 ميكرولتر من antifade كاشف كعامل coverslipping والحفاظ على 4 درجة مئوية في الظلام لمدة التخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: Phalloidin مستقرة نسبيا في برنامج تلفزيوني في +4 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع ومضان يمكن الحفاظ عليها مع antifade الكواشف coverslipping. ومع ذلك، يتم الحصول على الصور المثالية 1-3 أيام بعد تلطيخ منذ Phalloidin قد تبدأ في نزع فتيل خارج مع التخزين الموسعة.
3. F-الأكتين عد نقاط و
- تشغيل المجهر الفلورسنت والتبديل إلى 20 × الهدف. برنامج المجهر فتح، وإنشاء برنامج في 1280 × 960 بكسل حجم الصورة، و 0.17 ميكرون دقة وضوح الصورة / بكسل في 1 × التكبير.
- الحصول على صور من وصفت المشارك F-الأكتين / الخلايا العصبية MAP2 تحت الأخضر (495 نانومتر) / أحمر (613 نانومتر) قنوات الفلورسنت.
- اختيار 5 الأخضر (F-الأكتين) / الأحمر (MAP2) immunolabeled / الأزرق (Hoescht) الصور الفلورسنت من الخلايا العصبية الفردية مع العرش شجيري محددة بوضوح.
- تحديد F-الأكتين هياكل الغنية في المرتبة الثانية قطاع شجيري (مدى طول 25-75 ميكرون) مع المناعي MAP2 المستمر.
- وتناوب على منطقة مختارة من الصور إلى المستوى الأفقي. نسخ ولصق كصورة جديدة.
- طرح الخلفية من الصور، وذلك باستخدام تعديلات متسقة لكل طبق.
- عد-F الأكتين الخضراء نقاط ومشرقة وتتبع طول الجزء شجيري اختيار يدويا من قبل مراقبين مستقلين المدربين. تصدير البيانات إلى ملف البيانات.
- حساب الكثافة بقسمة مجموع F-الأكتين نقاط والمسمى (N) من طول (L) من MAP2 المسمى التشعبات. البيانات كما أعرب عن عدد من F-ميلاننقاط والقصدير في 10 ميكرون من التغصنات
ملاحظة: نقاط و(حجم ≤1.5 ميكرون) من مضان F-أكتين مع كثافة الذروة لا يقل عن 50٪ أعلى من متوسط كثافة تلطيخ في رمح شجيري كانت مدرجة في كل جزء شجيري المحدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الأساليب الحالية، ونحن أول الفئران ثقافة العصبونات القشرية في منخفض الكثافة في أطباق الزجاج السفلي 35 مم، والذي يسمح لنا لتحديد التشعبات من الخلايا العصبية الفردية. في الشكل 1، وعلى النقيض تدخل الفرق (DIC) صور تظهر تغيرات شكلية في تطوير الفئران الجنين العصبونات القشرية في أيام 4 و 6 و 10 و 14 و 21 و 27 في المختبر. لاحظ أن طول وعدد من التشعبات تزداد مع نضوج الخلايا العصبية الفئران الابتدائي تربيتها. تستخدم الخلايا العصبية في التجارب إلا بعد 14 يوما النضج.
للكشف عن تغيرات الجذعية ومتشابك، ونحن الجمع بين العلامات Phalloidin F-أكتين مع الكشف عن الأجسام المضادة MAP2 من التشعبات. منذ Phalloidin وسم F-الأكتين سريع جدا (20-30 دقيقة)، فمن الممكن لتقدير بصريا على سلامة الشبكة synaptodendritic قبل الشروع في الأجسام المضادة للمحكمة الجنائية الدولية وصفها (الشكل 2
المقبل، ونحن الحصول على صور عالية الدقة من Phalloidin المسمى المشارك (F-الأكتين) / MAP2 الخلايا العصبية وتحليل الخلايا العصبية تم اختيارها عشوائيا. واعتبرت أرجل كاذبة خيطية على ما يرام، نتوءات العمود الفقري، وبقع F-أكتين الهياكل الغنية F-أكتين وأدرجت في دراساتنا (الشكل 3). وقد تم اختيار شرائح من التشعبات من الدرجة الثانية (MAP2 الإيجابية) لتحليل كثافة نقاط وF-أكتين. يستخدم MAP2 تلطيخ إيجابية لتأكيد توطين الخلايا العصبية من نقاط وF-أكتين. الكشف بمساعدة الحاسوب وفرز Phalloidin (F-الأكتين) المسمى (قناة مضان الخضراء) قد أنجز نقاط ومتشابك عبر استخدام البرمجيات المتخصصة. هناك خطوة خطوة بالتفصيل بروتوكول في الشكل (4) 2 = 0.97).
في السابق، كنا الكمي من نقاط وF-أكتين لتقييم إصابة synaptodendritic الناجمة عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 تات 9 و التعافي من synaptopathy يسببها تات-HIV-1 10. في الشكل (5)، وكانت الفئران الخلايا العصبية القشرية شارك في المسمى مع Phalloidin وMAP2 الأجسام المضادة بعد 50 نانومتر للعلاج HIV-1 تات. كشفت MAP2 تلطيخ أقل الفروع الشجيرية وتضاءلت F-الأكتين التالية HIV-1 تات المعالجة.
وجدنا أن نقاط وF-أكتين قد إما زيادة أو نقصان في استجابة للعلاجات تجريبية. في الشكل (6)، تم علاج الخلايا العصبية مثقف مع الالبريد NMDA غير قادرة على المنافسة مستقبلات ميمانتين، يتزايد بشكل ملحوظ نقاط وإيجابية F-أكتين. في المقابل، أدت المعاملة مع مزيج من الميثامفيتامين + HIV-1 تات في خسارة كبيرة في نقاط وF-أكتين.
الشكل 1. الفئران الجنينية الخلايا العصبية القشرية في زراعة الخلايا التفاضلية تدخل النقيض (DIC) صور من الفئران الجنين العصبونات القشرية بين 4 - 27 أيام في المختبر (20X). الخلايا العصبية تظهر نضجا في 14 يوما في المختبر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. Phalloidin / MAP2 شارك في وضع العلامات في العصبونات القشرية الفئران. الخلايا العصبية مثقف المسمى مع MAP2 الأضداد (الحمراء)، وPhalloidin (الخضراء). الصور المدمجة تسمح تقرير أن يتم ترجمة تلطيخ Phalloidin إلى التشعبات العصبية (20X). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم الهياكل متشابك 3. F-أكتين من العصبونات القشرية الفئران. (A) اليسار - هياكل إيجابية F-أكتين المسمى مع Phalloidin (60X). وتشير النصال وتشمل F-الأكتين هياكل المسمى العمود الفقري الفطر (البنفسجية)، مثل التصحيح التشكل (الأزرق) وأرجل كاذبة خيطية طويلة (برتقالي). يتم ترجمة صورة مدموجة مما يدل على هذه الهياكل-F الأكتين إلى التشعبات (20X) - الوسط. الصحيح - صندوق في الجزء الأسفل من اليمين يشير إلى الدرجة الثانية فرع شجيري المختارة للتحليل (20X) (ب) شرائح الجذعية من Phalloidin (F-الأكتين) (الأخضر) / MAP2. وتستخدم (الأحمر) المسمى شارك العصبونات القشرية (20X) للتحقق من منشأ الخلايا العصبية من نقاط وF-أكتين. تتم معالجة الصورة الوحيدة الخضراء (Phalloidin / F-الأكتين) أبعد من ذلك. الصور (C) Phalloidin / F-الأكتين (الخضراء) من ثلاثة أجزاء الجذعية المختارة لحساب نقاط و. يتم تحديد الكثافة بقسمة N / L. N = عدد من نقاط و، L = طول القطعة شجيري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. مظاهرة من حزمة البرامج: تعليمات خطوة بخطوة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
/53697fig5.jpg "/>
الرقم 5. HIV-1 تات بوساطة إصابة synaptodendritic في العصبونات القشرية الفئران. الثقافات خلية وشارك الملطخة لF-الأكتين وMAP2 بعد العلاج بروتين HIV-1 تات (50nM). وحات التحكم- العليا الخلايا العصبية غير المعالجة تظهر قوية F-الأكتين، وأنماط المتفرعة معقدة، والعمليات العصبية الدقيقة واسعة النطاق. لوحات أقل - بروتين HIV-1 تات تعامل الخلايا العصبية مع تقلص F-الأكتين وانخفاض المتفرعة شجيري. (20X) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. نقاط وF-أكتين في الخلايا العصبية القشرية الفئران: تأثيرات مختلفة التي تنتجها ميمانتين مقابل العلاج الميثامفيتامين + تات صور (20X) من الخلايا العصبية مثقف غير المعالجة، الخلايا العصبية تعامل مع ميمانتين (10 ميكرون)، والخلايا العصبية تعامل مع Methamphetamine (20 ميكرومتر) +10 نانومتر من تات (10nM). ارتفعت العلاج ميمانتين تلطيخ F-الأكتين، في حين أن العلاج الميثامفيتامين + HIV-1 تات انخفضت تلطيخ F-الأكتين وانخفضت المتفرعة شجيري. العلاج ميمانتين زيادة كبيرة في كثافة نقاط وF-أكتين، نسبة إلى الثقافات ضابطة. في المقابل، انخفضت العلاجات الميثامفيتامين + HIV-1 تات بشكل كبير كثافة نقاط وF-أكتين، نسبة إلى الثقافات ضابطة. يعني + ووزارة شؤون المرأة، * ف <0.05. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، وصفنا زراعة الفئران الخلايا العصبية القشرية في منخفض الكثافة في أطباق الزجاج السفلي 35 مم والتي تسمح لنا لتحديد التشعبات من الخلايا العصبية الفردية. التالي، ونحن نستخدم Phalloidin وتلطيخ MAP2 للكشف عن تغيرات الجذعية. ثم، استخدمنا برنامج خاص لقياس التغيرات في نقاط وF-أكتين.
لتحديد التغيرات في نقاط وF-أكتين يجب أن تكون الشبكة العصبية كاملة من الخلايا العصبية الفردية واضحة للعيان، وهذا يسمح اختيار من الدرجة الثانية شرائح شجيري المناسبة من الخلايا العصبية واحدة. منخفض الكثافة الطلاء أمر بالغ الأهمية من أجل كل من تصور الخلايا العصبية الفردية وكذلك للحد من وجود خلايا الدبقية. تحتوي الخلايا النجمية أيضا F-الأكتين ودون علامة العصبية، يمكن أن تربك تحليل نقاط وإيجابية F-أكتين. الثقافات منخفض الكثافة واستخدام Neurobasal المتوسطة هي مفيدة في خفض انتشار نجمي الخلايا في مزارع الخلايا. ومع ذلك، وبالنظر إلى التحذير من أن البروتين F-الأكتين هوغير محددة إلى الخلايا العصبية، وعلامات البروتين العصبية محددة، مثل MAP2، ينبغي أن تستخدم جنبا إلى جنب مع Phalloidin. يمكن أيضا استخدام بروتين أجسام أخرى بالتزامن مع Phalloidin، مثل TH (هيدروكسيلاز التيروزين) لتحديد السكان العصبية محددة في مجال الثقافة.
أسلوب واحد العامة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي ومورفولوجيا متشابك هي مناعية (ICC). ICC شعبية منذ العديد من الأجسام المضادة للبروتينات متشابك متوفرة بسهولة بما في ذلك PSD 95، NMDAR (بعد متشابك) وكذلك synaptophysin وباسون وسينابسينات الأول (ما قبل متشابك) 11. ومع ذلك، فإن بعض الهياكل لا يمكن الكشف عنها من قبل للمحكمة الجنائية الدولية (مثل أرجل كاذبة خيطية رقيقة)، ولكن مجموعة من العلامات Phalloidin F-أكتين مع الكشف عن الأجسام المضادة (أو وضع العلامات مزدوج مع اثنين من الأجسام المضادة مختلفة) قد تسمح للتحقيق محددة ومعقدة من القطعان متشابك وردود الأفعال المختلفة للعلاجات تجريبية.
قد تكون نقاط وF-أكتين particحساسية ularly إلى علاجات تجريبية. نحن ذكرت مؤخرا أن العلاج مع HIV-1 بروتين تات أنتجت انخفاض في نقاط وF-أكتين (24 ساعة) قبل أي دليل على وفاة الخلايا العصبية العلني (48 ساعة) 10. ومن الجدير بالملاحظة أن العلاجات التجريبية قد إما زيادة (ميمانتين) أو نقصان (الميثامفيتامين + HIV-1 تات) F-الأكتين نقاط و. كما وجدنا أن فقدان نقاط وF-أكتين هي استجابة عكسها التالية علاجات تجريبية محددة 10. على هذا النحو، F-الأكتين نقاط والكمي هو أداة قيمة لمراقبة ليس فقط synaptopathy الحادة، ولكن أيضا لدراسة الانتعاش متشابك والعمليات neurorestoration التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
- Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
- Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
- Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
- Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
- Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
- Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
