Abstract
（F-アクチン）繊維状アクチンタンパク質はspinogenesis、シナプス可塑性、およびシナプスの安定性に大きな役割を果たしています。樹状F-アクチン豊富な構造の変化は、シナプスの完全性と接続性の変化を示唆しています。ここでは、初代ラット皮質ニューロン、F-アクチン斑点のためのファロイジン染色、およびその後の定量化手法を培養するための詳細なプロトコルを提供します。まず、E18ラット胚の前頭皮質は、その後、低密度の細胞培養物中に少なくとも12〜14日間、in vitroで増殖させた神経細胞を解離します。実験的治療に続いて、皮質ニューロンがのAlexaFluor 488ファロイジンで染色され、微小管結合タンパク質2（樹状F-アクチン斑点標識する）（MAP2を、神経細胞や樹状突起の整合性を検証するために）。最後に、特別なソフトウェアがランダムに選択された神経細胞の樹状突起を分析し、定量化するために使用されます。 F-アクチン豊富な構造は、二次樹枝状の枝に識別されます（長さの範囲25-75＆＃181; m）を連続MAP2免疫蛍光を持ちます。ここで紹介するプロトコルは、実験処理に続いて、樹状シナプス構造の変化を調査するための有用な方法となります。
Introduction
この研究の主な目的は、ニューロンの樹状突起ネットワークのシナプス完全性の測定（推定）の信頼性の高い方法を開発することです。ここでは、ファロイジン染色および特殊な（NIS-要素）ソフトウェアを使用して、その後の分析と樹状突起の免疫細胞化学（ICC）の検出の組み合わせを用いて、ラット初代培養神経細胞におけるF-アクチン涙点の定量化について説明します。
標識ファロトキシンは、大小両方のフィラメント（F-アクチン）に対して同様の親和性を有するが、いくつかのアクチン抗体1とは異なり、単量体の球状アクチン（G-アクチン）に結合しません。ファロイジンの非特異的結合は、このように細胞イメージングの間に最小限の背景を提供し、ごくわずかです。ファロイジンは、典型的には、ファロイジンによるF-アクチンのはるかに強い標識化を可能にする蛍光顕微鏡用の細胞タンパク質を標識するために使用される抗体よりもはるかに小さいです。このように、神経細胞におけるF-アクチンの局在の詳細な画像をすることができます標識されたファロイジンを使用することによって得られます。
神経細胞の樹状突起のファロイジン（F-アクチン）染色は、成熟した棘、非とげシナプス2と未熟棘を含む樹枝状構造の多様性を表す離散的「ホットスポット」や明るい「斑点」を生成します。未熟棘薄い糸状仮足及びパッチの形態のいくつかの形態を含み、そしてspinogenesis 3の開始を表すことができます。未熟棘と非とげ状のパッチがPSD95 4を欠いています 。のみならず、棘におけるその後の変化だけでなく、追加の樹枝状構造へのF-アクチンの鉛の生産の変化は、このようにsynaptodendritic整合性5-7を調査するための重要なツールファロイジンを作ります。一般的には、ファロイジン陽性（F-アクチン）涙点の数は、アクティブなシナプス（興奮性および抑制）、アクチンダイナミクスとシナプスの安定性8のバランスを反映しています。
特定のトンを研究することは重要であるが、シナプスのYPES（ すなわち 、興奮棘）、治療の標的が未知であるとき、最初の樹枝状構造体の種々の一般的な整合性を推定する必要があります。 F-アクチンは、抑制性シナプスを含む樹状突起棘および他の構造の主要な構成要素であるので、F-アクチン涙点の変更された数は、シナプス変性症を示すことができます。このシナプス変性症は、より具体的な変化についてさらに調査することができます。複数のシナプスのタイプ/構造を検出するための当社の定量方法は、様々な実験処置後の樹状シナプスの変化（増減）の全体的な推定値が得られます。
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Protocol
全ての動物プロトコルを見直し、サウスカロライナ大学の動物実験委員会（保証番号：A3049-01）によって承認されました。
1.低密度胚性神経文化
- 初代皮質神経細胞培養のための準備
- ソリューション：
- 10 mlのホウ酸緩衝液中のポリ-L-リジン5mgを溶解することによりポリ-L-リシンストック溶液を調製します。
- 49ミリリットルホウ酸緩衝液中で1ミリリットルポリ-L-リジンストックを希釈して使用液を調製します。
- 395ミリリットルのdH 2 Oで開始し、その後、全ての成分（ホウ砂の1.24グラムのホウ酸+ 1.9グラム）を加えることによりホウ酸緩衝液、pH 8.4を準備します。 1MのNaOHにより8.4にpHを調整します。 400ミリリットルに調整し、ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでろ過します。
- 445ミリリットルのdH 2 Oで始まるとすべての他の成分（50ミリリットル10X HBSS証券+ 1.2グラムHEPES）を追加することで、HBSS溶液、pHが7.2を準備します。 1NのHCl、BRIにより7.2にpHを調整しますNGに500ミリリットルとは、ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでろ過します。
- 10％ウシ胎児血清を含むDMEM / F12：メッキ培地を準備します。ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでフィルタリングします。
- 完全増殖培地を準備します50ミリリットルNeurobasal培地に、サプリメントを追加する（500μlのグルタマックス（100X）+ 500μlのグルコース抗生物質 - 抗真菌溶液（100Xの+ 1ミリリットルのB-27（50X）+500μlの）+100μlの7.5％炭酸水素ナトリウムはボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでフィルタリングします。
- 文化の前に二日：
- ポリ-L-リジンの2ミリリットルワーキング溶液でコート12 35ミリメートルのガラスボトムディッシュを、フードのO / Nの下におきます。
- 文化の一日前：
- 皿から空のコーティング剤とのddH 2 Oですすぎ料理はフードの下で時間乾燥することができます。
- 10％ウシ胎児血清（全溶液の10％）でメッキ培地（DMEM / F12を準備します。ピペット2ミリリットル培地に各皿、および37°Cの 、5％CO 2でO / Nインキュベートします。
注：培養する場合には、プラスチック培養皿を回避することが重要です。 （直立顕微鏡用）（倒立顕微鏡用）ガラスボトムディッシュの使用またはカバーガラスは、シャープでクリアな画像が得られます。プラスチックボトムディッシュに比べて、ガラスボトムディッシュは、蛍光顕微鏡検査の際に、不要な色合いやまぶしさを避けることができます。
- ソリューション：
- 細胞培養プロトコル：
- HBSSバッファー（100〜150ミリリットル）を、冷蔵置く100ミリメートルペトリ皿、鉗子、はさみ、50ミリリットルチューブ、およびフードでUV光の下で15 mlチューブ。
- 培養室の外でフードの下、5％セボフルランの致死吸入で妊娠ラットを安楽死させます。
- 70％エタノール、10トン胎盤を露出するようにハサミを使用して腹部cavity.Openの途中で尾から子宮をカットアップしながら、鉗子を使用して、下腹部の皮膚に滅菌します。
- 8-10 E18の胎児を削除します。プラHBSS溶液を含むペトリ皿中のCe 8-10胎児を。
- 鉗子で胎児の頭の後ろを持ち、その後、身体から頭部を切断するはさみを使用しています。 HBSS 5-7ミリリットルで満たされた別のペトリ皿に入れてください。フードに皿を転送します。
- 冷HBSSで2つの追加の100ミリメートルのペトリ皿を埋めます。
- ピールさておき頭蓋骨は、そしてHBSSで満たされた新しいペトリ皿に脳をスクープ。
- それに冷HBSSで新しいペトリ皿に脳を転送し、脳から鋭い湾曲鉗子、別々の小脳および脳幹を使用してください。
- 湾曲した鉗子で半球を分離、確保するためにピンセットを使用してください。髄膜を削除します。マークされた15ミリリットルの遠心管に前頭皮質および転送の部分を分離します。
- 新鮮な2ミリリットルHBSSで15ミリリットルチューブを記入し、各15ミリリットルチューブに20μlのトリプシンEDTA（0.5％トリプシンおよび5.3 mMのEDTAで10倍濃縮混合物を。）を追加します。
- RTで10〜15分間インキュベートします。ゆっくり、数分おきにチューブを旋回セトリングことはできません。
- Afター10-15分は、古いHBSSを削除し、新しいHBSSで二回リンスするためにガラスピペットを使用しています。
- （2ミリリットルHBSS中1mg / mlの、2mgのトリプシンインヒビター）トリプシン阻害剤に浸し、よく混ぜ、それは5分放置します。新鮮なHBSSで二回洗浄します。
- 均質になるまで非常にゆっくりと減少し、先端径較正ピペット及び滅菌チップを用いて再度bubbles.Triturateを回避するように非常にゆっくりとゴム球、磨砕脳片で10~15回ガラスピペットを使用して。
- 転送は、事前に準備コーティングした培養皿（50細胞/ mm2の）に所望の密度で細胞を解離しました。 37°Cの 、5％CO 2でO / Nインキュベートします。
- 24時間後に、新たに作られた完全増殖無血清Neurobasal培地を含むDMEM / F12培地を交換してください。
- 実験前の少なくとも12から14日間、5％CO 2/95％室内空気の加湿インキュベーター中ですべての回で細胞を維持します。新鮮なNeurobasal培地は、古い培地の約50％を交換しておき5-6日細胞を補います。
2.蛍光標識および免疫細胞化学
注：初代皮質細胞培養物の免疫蛍光標識を1 mlと作業容積を有するガラス底面35 mmの細胞培養皿で行いました。
- リン酸緩衝生理食塩水のpHが7.4（PBS）で2回ガラスボトムディッシュを洗ってください。
- RTで15分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。
- PBSで細胞を2回洗浄し、5分間、PBS中の0.1％トリトンX-100で透過性。
- F-アクチン特異的な染色で、室温で20分間細胞を処理するため、のAlexaFluor 488ファロイジン（1時40分、1ミリリットルPBS中ファロイジン25μlの）。
- PBSで2回細胞を洗浄し、1〜2時間、室温で10％正常ヤギ血清でブロックします。
- 2％正常ヤギ血清を含むPBSで4 O℃でO / Nインキュベートする：ニワトリポリクローナル抗MAP2抗体（2,500 1）希釈
- インキュベーション後、PBSで2回すすぎます。
- 二次抗体（AlexaのRを希釈ED 594結合ヤギ抗ニワトリIgG抗体（1：500）2％正常ヤギ血清で、室温で2時間インキュベートします。
- PBSですすぎ、ヘキスト染料を10μl/皿を追加します。
- 室温で3分間インキュベートし、PBSで二回洗浄します。
注：ステップ3（F-アクチン涙点カウント）のための標識された細胞は、準備が整いました。 - 封入剤として退色防止試薬100μlの細胞サンプルを維持し、長期保存のため、暗所で4°Cのでおきます。
注：ファロイジンは退色防止封入試薬で保存することができる1週間と蛍光まで暗所で4℃でPBS中で比較的安定しています。ファロイジンを長期間にわたって保管して外に拡散を開始することができるので、最適な画像が染色後1-3日から取得されます。
3. F-アクチン斑点カウント
- 蛍光顕微鏡をオンにして、20倍の対物レンズに切り替えます。オープン顕微鏡ソフトウェア、および1280×960ピクセルの画像サイズでプログラムを設定し、0.11倍ズームで7ミクロン/ピクセル画像の解像度。
- 赤、緑（495nmで）/（613 nm）の蛍光チャネルの下で共同標識F-アクチン/ MAP2ニューロンの画像を取得します。
- 5グリーン（F-アクチン）/レッド（MAP2）免疫標識/ブルー（ヘキスト）明確に定義された樹状アーバーと個々のニューロンの蛍光画像を選択してください。
- 連続MAP2免疫蛍光と二次樹枝状のセグメント（長さの範囲25から75ミクロン）でF-アクチン豊富な構造を特定します。
- 水平レベルに画像の選択した領域を回転させます。新しいイメージとしてコピーして貼り付けます。
- 各皿のための一貫性の調整を使用して、画像の背景を引きます。
- 明るい緑色のF-アクチン涙点を数え、訓練を受けた独立した観察者によって手動で選択された樹状セグメントの長さをトレースします。スプレッドシートファイルにデータをエクスポートします。
- MAP2の長さ（L）総F-アクチン標識された涙点（N）を割ることで密度を計算する樹状突起を標識しました。 F-交流の数などのデータを表現しますデンドライトの10ミクロンあたり錫涙点
注：涙点の樹状シャフト内染色の平均強度よりも少なくとも50％のピーク強度とF-アクチンの蛍光（サ イズ≤1.5μm）をそれぞれ選択した樹状セグメントに含まれていました。
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Representative Results
私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で存在する方法で、私たち第1の培養ラット皮質ニューロン、。 図1では 、微分干渉コントラスト（DIC）画像は、日4、6、10、14、21、in vitroで 27に胎児ラット皮質ニューロンの開発における形態学的変化を示しています。樹状突起の長さと数は、培養ラット初代神経細胞の成熟に伴って増加することに注意してください。ニューロンはわずか14日間熟成した後、実験に使用されています。
樹状突起とシナプスの変化を検出するために、我々は樹状突起のMAP2抗体検出とファロイジンFアクチンの標識を兼ね備えています。 F-アクチンのファロイジン標識は（20-30分）非常に急速であるので、視覚的にICCの抗体標識（ 図2に進む前にsynaptodendriticネットワークの整合性を推定するために、それは可能です
次に、共標識ファロイジン（F-アクチン）/ MAP2、ニューロンの高解像度画像を取得し、ランダムに選択された神経細胞を分析しました。ファイン糸状仮足、背骨の突起、およびF-アクチンパッチは、F-アクチン豊富な構造と考えられていたと私たちの研究（ 図3）に含まれていました。二次デンドライト（MAP2陽性）のセグメントは、Fアクチン涙点密度の分析のために選択しました。 MAP2陽性染色は、F-アクチン涙点のニューロンの局在を確認するために使用されます。コンピュータ支援検出及びファロイジン（F-アクチン）の標識（緑色蛍光チャネル）の計数は、シナプス点は、特殊なソフトウェアの使用を介して行われました。 図4のステップの詳細なプロトコルでステップがあります2 = 0.97）が非常に高いことを非常によく相関することを報告しています。
以前、我々は、HIV-1 Tatの9およびHIV-1 Tatの誘発性シナプス変性症10からの回復により誘発されるsynaptodendritic損傷を評価するために、F-アクチン涙点の定量化を使用していました。 図5において、ラットの皮質ニューロンは、HIV-1 Tatの処置の50 nMの後ファロイジンおよびMAP2抗体で同時標識しました。 MAP2染色は少ない樹枝状の枝を明らかにし、HIV-1のTat-治療後のF-アクチンを減少しました。
我々は、Fアクチン斑点が実験処理に応答して増加または減少し得ることを見出しました。 図6に 、培養されたニューロンは、目で処理しました電子非競合NMDA受容体アンタゴニストのメマンチンは、有意Fアクチン陽性の涙点を増加させます。対照的に、メタンフェタミン+ HIV-1 Tatの組み合わせを用いた治療は、F-アクチン涙点の重大な損失をもたらしました。
図細胞培養1.胎児ラット皮質ニューロン 4の間に胎児ラット皮質ニューロンの微分干渉コントラスト（DIC）画像- 。、in vitroで 27日（20X）。ニューロンは、in vitroで 14日目に成熟表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.ラット皮質ニューロンにおけるファロイジン/ MAP2同時標識。MAPで標識された培養神経細胞2抗体（赤）とファロイジン（緑）。マージされた画像は。ファロイジン染色は、ニューロンの樹状突起（20X）に局在していることを決意を許可するこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図ラット皮質ニューロンの3 F-アクチンシナプス構造。 （A）左 -ファロイジンで標識F-アクチン陽性の構造（60X）。矢頭は、F-アクチン標識された構造は、マッシュルーム棘（紫）、パッチ状の形態（青）と長い糸状仮足（オレンジ色）が含ま示します。中東 - これらのF-アクチンの構造を実証するマージされた画像は、樹状突起（20X）に局在しています。右-右下のボックスには、分析（20X）のために選択された二次樹枝状の枝を示している（B）ファロイジン（F-アクチン）（緑）/ MAP2の樹状セグメント。 （赤）の共同標識皮質ニューロン（20X）F-アクチン斑点のニューロンの起源を確認するために使用されています。緑の画像のみ（ファロイジン/ F-アクチン）がさらに処 理される。（C）ファロイジン/ F-アクチン（緑）涙点計数のために選択した3つの樹状突起セグメントの画像。密度は、N / Lを割ることにより決定されます。 N =斑点、L =樹状セグメントの長さの数。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ソフトウェア・パッケージの図4.デモ：ステップバイステップのインストラクション この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5. HIV-1 Tatのは、ラット皮質ニューロンでsynaptodendritic傷害を媒介した。細胞培養は、HIV-1 Tatタンパク質の治療（50nMの）後のF-アクチンとMAP2のための共染色しました。アッパーは、堅牢なF-アクチン、複雑な分岐パターン、および大規模な細かい神経突起を示す未処理のニューロンをpanels-。下パネル - F-アクチンの減少と減少した樹状分枝を有するHIV-1 Tatタンパク質処理したニューロン。 （20X）は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ラット皮質ニューロンにおける図6. F-アクチン斑点：メタンフェタミン+タット処理対メマンチンによって生成されるさまざまなエフェクト Methamphで処理された未処理の培養神経細胞、メマンチンで処理したニューロン（10μM）、およびニューロンの画像（20X）エタミン（20μM）のTatの10 nMの（10nMの）。メタンフェタミン+ HIV-1 Tatの処理はFアクチン染色を減少させ、樹枝状分岐の減少に対し、メマンチン処理は、Fアクチン染色を増加させました。メマンチン処理は、未処置対照培養物と比較しF-アクチン涙点密度を増加しました。これとは対照的に、メタンフェタミン+ HIV-1 Tatの治療は大幅に未処理の対照培養物と比較しF-アクチン斑点の密度を、減少しました。 + SEM、* P <0.05を意味する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、我々は、私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で培養ラット皮質ニューロンを記述する。次に、我々は、樹状変化を検出するファロイジンとMAP2染色を使用します。その後、我々はF-アクチン斑点の変化を定量化するために特別なソフトウェアを使用していました。
F-アクチン斑点の変化を決定するために、個々の神経細胞の全体の神経回路網が明確に表示されている必要があり、これは、単一ニューロンから適切な二次樹枝状のセグメントを選択することができます。低密度めっきは、個々のニューロンを可視化するための両方、ならびにグリア細胞の存在を最小限にするために重要です。アストロサイトはまた、F-アクチンを含み、ニューロンマーカーなしで、F-アクチン陽性の涙点の分析を混乱させる可能性があります。低密度培養物およびNeurobasal培地の使用は、細胞培養物中で星状細胞の増殖を減少させるのに有用です。しかし、Fアクチンのタンパク質であることを警告与えニューロンに特異的ではない、などMAP2などの特定の神経細胞のタンパク質マーカーは、ファロイジンと一緒に使用する必要があります。他のタンパク質の抗体は、培養物中の特定のニューロン集団の同定のためのそのようなTHとしてファロイジン（チロシンヒドロキシラーゼ）と組み合わせて使用することができます。
シナプスとシナプスの形態を研究するための一つの一般的な技術は、免疫細胞化学（ICC）です。 ICCは、次のような（シナプスタンパク質のための多くの抗体は、しかし、PSD 95、NMDAR（シナプス後）だけでなく、シナプトフィジン、ファゴットとシナプシンI（シナプス前）11を含む、容易に入手可能であるので、いくつかの構造は、ICCによって検出することができない人気です細い糸状仮足）が、抗体検出（または2つの異なる抗体を用いた二重標識とF-アクチンファロイジン標識の組み合わせ）は、シナプス亜集団と実験的治療への差動応答の特異的かつ複雑な調査を可能にすることができます。
F-アクチン斑点は気難しいかもしれ実験的治療にularly敏感。我々は最近、HIV-1 Tatタンパク質による治療が明白な神経細胞死（48時間）10のための証拠の前にF-アクチン斑点（24時間）の減少を生じたことを報告しました。これは、実験的な治療が増加（メマンチン）または減少（メタンフェタミン+ HIV-1 Tatの）F-アクチン斑点のいずれかかもしれないことに注意すべきです。我々はまた、F-アクチン斑点損失が特定の実験処理10以下の可逆反応であることを見出しました。このように、F-アクチン涙点の定量化は、急性シナプス変性症だけでなく、シナプスの回復と実験神経修復のプロセスを研究するためだけでなく、を監視するための貴重なツールです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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