Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Kvantifisering av Trådformede Actin (F-aktin) puncta i Rat kortikale nevroner

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Trådformede aktin protein (F-aktin) spiller en viktig rolle i spinogenesis, synaptisk plastisitet, og synaptisk stabilitet. Endringer i dendrittiske F-aktin rike strukturer foreslå endringer i synaptiske integritet og tilkobling. Her gir vi en detaljert protokoll for dyrking av primær rotte kortikale nevroner, Phalloidin farging for F-aktin puncta, og påfølgende kvantifisering teknikker. Først blir den frontale cortex fra E18 rotteembryoer dissosiert til lav tetthet cellekultur, deretter nervecellene dyrkes in vitro i minst 12-14 dager. Etter eksperimentell behandling, blir de kortikale nevroner farget med AlexaFluor 488 Phalloidin (å merke dendrittiske F-aktin puncta) og microtubule-assosiert protein 2 (MAP2, for å validere nevronale celler og dendrittiske integritet). Endelig er spesialisert programvare som brukes til å analysere og kvantifisere tilfeldig utvalgte nevronale dendritter. F-aktin rike strukturer er identifisert på andre ordens dendritiske forgreninger (lengde range 25-75 &# 181; m) med kontinuerlig MAP2 immunfluorescens. Protokollen presenteres her vil være en nyttig metode for å undersøke endringer i dendrittiske synapse strukturer påfølgende til eksperimentell behandling.

Introduction

Det primære målet med denne studien er å utvikle en pålitelig målemetode (estimering) av synaptiske integriteten til nevronale dendrittiske nettverk. Her beskriver vi kvantifisering av F-aktin puncta i grunnskolen rotte dyrkede nerveceller ved hjelp av en kombinasjon av Phalloidin flekker og immunocytokjemisk (ICC) deteksjon av dendritter med påfølgende analyse ved hjelp av spesialisert (NIS-Elements) programvare.

Merkede phallotoxins har lik affinitet for både store og små filamenter (F-aktin), men ikke bindes til monomere globular aktin (G-aktin), i motsetning til enkelte aktin antistoffer 1. Ikke-spesifikk binding av Phalloidin er ubetydelig, og dermed gi minimal bakgrunn i løpet av cellulær avbildning. Phalloidin er mye mindre enn antistoffer som typisk ville bli brukt til å merke cellulære proteiner for fluoriserende mikroskopi, noe som gir mye mer intens merking av F-aktin ved phalloidin. Dermed kan detaljerte bilder av F-aktin lokalisering i nevroner værefrembrakt ved bruk av merket Phalloidin.

Phalloidin (F-aktin) farging av nevronale dendritter genererer diskrete "hot spots" eller lys "puncta", som representerer en rekke dendrittiske strukturer, inkludert modne pigger, ikke-spiny synapser 2 og umodne pigger. Umodne pigger inkluderer tynne filopodia og noen former for patch morfologi, og kan representere initiering av spinogenesis tre. Umodne pigger og ikke-spiny patcher mangler PSD95 4. Endringer i produksjonen av F-aktin føre til senere endringer i ikke bare pigger, men også flere dendrittiske strukturer, og dermed gjør Phalloidin et viktig verktøy for å undersøke synaptodendritic integritet 5-7. Generelt antall Phalloidin-positive (F-aktin) puncta reflektere en balanse mellom aktive synapser (eksitatorisk og hemmende), aktin dynamikk og synapse stabilitet 8.

Selv om det er viktig å studere bestemte types av synapser (dvs. eksitatoriske pigger), når målet for en behandling er ukjent, er det nødvendig å først beregne den generelle integritet av en rekke av dendrittiske strukturer. Siden F-aktin er en viktig komponent i dendrittutløperne og andre strukturer, inkludert hemmende synapser, en endret antall F-aktin puncta kan indikere en synaptopathy. Dette synaptopathy kan da bli etterforsket videre for mer spesifikke endringer. Vår kvantifisering metode for påvisning av flere synaptiske typer / strukturer gir et samlet estimat av dendrittiske synaptiske endringer (økning og reduksjon) etter ulike eksperimentelle behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr protokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care og bruk komité ved University of South Carolina (kvalitetssikring Nummer: A3049-01).

1. Lav tetthet Embryonic Neuronal Culture

  1. Forberedelse til primære kortikale nevroner kultur
    1. løsninger:
      1. Fremstille poly-L-lysin stamløsning ved å oppløse 5 mg poly-L-lysin i 10 ml boratbuffer.
      2. Forbered arbeidsløsning ved å fortynne 1 ml Poly-L-lysin lager i 49 ml boratbuffer.
      3. Forbered borat buffer, pH 8,4 ved å starte med 395 ml dH 2 O og deretter legge alle ingrediensene (1,24 g borsyre + 1,9 g boraks). Juster pH til 8,4 med 1 M NaOH. Juster til 400 ml og filter med 0,2 mikrometer nylon membranfilter under avtrekk.
      4. Forbered HBSS løsning, pH 7,2 ved å starte med 445 ml dH 2 O og legge alle andre ingredienser (50 ml 10X HBSS arkiv + 1,2 g HEPES). Juster pH til 7,2 med 1 N HCl, bring til 500 ml og filter med 0,2 mikrometer nylon membranfilter under avtrekk.
      5. Forbered plating medium: DMEM / F12 med 10% føtalt bovint serum. Filter med 0,2 mikrometer nylon membranfilter under avtrekk.
      6. Forbered komplett vekstmedium: To 50 ml Neurobasal medium, legge til kosttilskudd (500 mL Glutamax (100X) + 500 mL Glukose + 1 ml B-27 (50X) + 500 ul Antibiotika Anti-fungal løsning (100X) + 100 ul 7,5% Sodium bikarbonat. filter med 0,2 mikrometer nylon membranfilter under avtrekk.
    2. To dager før kultur:
      1. Coat tolv 35 mm med glassbunn retter med 2 ml Poly-L-lysin arbeidsløsning, og holde under panseret O / N.
    3. En dag før kultur:
      1. Empty belegg agent fra oppvasken og skyll med DDH 2 O. La oppvasken tørke i en time under panseret.
      2. Fremstille pletteringsmedium (DMEM / F12 med 10% føtalt bovint serum (10% av den totale løsningen) Pipetter 2. Ml medium ihver tallerken, og inkuber O / N ved 37 o C, 5% CO 2.
        Merk: Det er viktig å unngå plast kultur retter når dyrkning. Bruk av glassbunn retter (for inverterte mikroskoper) eller dekkglass (for stående mikroskoper) gir skarpe og klare bilder. Sammenlignet med en plast-bunn fatet, unngår glassbunn fatet uønskede fargetoner eller gjenskinn under fluorescerende mikroskopi.
  2. Cellekultur protokoll:
    1. Put nedkjølt HBSS Buffer (100-150 ml), 100 mm petriskåler, pinsett, saks, 50 ml rør, og 15 ml rør under UV-lys i hette.
    2. Avlive gravid rotte med dødelig innånding av 5% sevofluran under panseret utenfor kultur rommet.
    3. Steriliser med 70% EtOH, telt huden på nedre del av magen ved hjelp av pinsett mens kutte fra halen opp i midten av mage cavity.Open livmoren med saks for å avsløre morkaken.
    4. Fjern 8-10 E18 fostre. Place 8-10 fostre i petriskåler som inneholder HBSS løsning.
    5. Hold baksiden av hodet til fosteret med pinsett, og deretter bruke saks for å skille hodet fra kroppen. Plasser den i en annen petriskål fylt med 5-7 ml HBSS. Overfør retten til hette.
    6. Fyll to ekstra 100 mm petriskål med kaldt HBSS.
    7. Skrell bort skallen, og kaprer hjernen til en ny petriskål fylt med HBSS.
    8. Bruk skarpe buet pinsett, separat lillehjernen og hjernestammen fra hjernen, og deretter overføre hjernen til en ny petriskål med kaldt HBSS i den.
    9. Bruk pinsett til å sikre, skille halvkuler med buede tang. Fjern hjernehinnene; isolere frontal cortex og overføre bitene i merkede 15 ml sentrifugerør.
    10. Fyll 15 ml tube med fersk 2 ml HBSS og legge til 20 mL Trypsin EDTA (10x konsentrert blanding med 0,5% trypsin og 5,3 mM EDTA.) Til hver 15 ml tube.
    11. Inkuber 10-15 min ved RT. Virvle røret med få minutters mellomrom, ikke la settling.
    12. After 10-15 min, bruk glass pipette for å fjerne gamle HBSS og skyll to ganger med ny HBSS.
    13. Fordyp deg i trypsin inhibitor (1 mg / ml, 2 mg trypsin inhibitor i 2 ml HBSS), bland godt og la det sitte 5 min. Vask to ganger med frisk HBSS.
    14. Ved hjelp av pipette glass med gummi pære, Triturer hjernestykker 10-15 ganger meget langsomt slik at man unngår bubbles.Triturate igjen ved hjelp av en kalibrert pipette og et sterilt spiss med en redusert diameter spiss meget langsomt inntil den er homogen.
    15. Transfer dissosiert celler på ønsket tetthet til pre-forberedt belagt kultur retter (50 celler / mm2). Inkuber O / N ved 37 o C, 5% CO2.
    16. Etter 24 timer erstatte DMEM / F12 medium med ferske komplett vekst serumfritt Neurobasal medium.
    17. Opprettholde cellene til alle tider i en 5% CO 2/95% romluft fuktet inkubator i minst 12-14 dager før eksperimentering. Supplement cellene hver 5-6 dager med fersk Neurobasal medium erstatte ca 50% av det gamle mediet.

2. Fluorescent Merking og Immunocytochemistry

Merk: immunfluorescens merking av primære kortikale cellekulturer ble utført i glassbunn 35 mm cellekulturskåler med et arbeidsvolum på 1 ml.

  1. Vask med glassbunn fatet to ganger med fosfat-bufret saltvann pH 7,4 (PBS).
  2. Løs celler med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved RT.
  3. Vask cellene to ganger med PBS og permeabilize med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
  4. Behandle cellene i 20 minutter ved romtemperatur med en F-aktin spesifikk flekk, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 ul av Phalloidin i 1 ml PBS).
  5. Rens cellene to ganger med PBS og blokker med 10% normalt geiteserum ved RT i 1-2 timer.
  6. Spe kylling polyklonale anti-MAP2 antistoff (1: 2500) i PBS med 2% normalt geiteserum og inkuberes O / N ved 4 o C.
  7. Etter inkubasjon skylles i PBS to ganger.
  8. Fortynn sekundært antistoff (Alexa Red 594-konjugert geit-anti-kylling-IgG (1: 500) med 2% normalt geiteserum og inkuberes i 2 timer ved RT.
  9. Skyll med PBS og tilsett 10 mL / fat med Hoescht fargestoff.
  10. Inkuber 3 minutter ved romtemperatur og vaskes to ganger med PBS.
    Merk: De merkede cellene nå klar for trinn 3 (F-aktin puncta telling).
  11. Bevar celleprøve med 100 ul antifade reagens som et coverslipmiddel og holde ved 4 o C i mørket for langtidslagring.
    Merk: Phalloidin er relativt stabil i PBS ved 4 ° C i mørke i opptil en uke og fluorescens kan bevares med antifade coverslip reagenser. Imidlertid er optimale bilder hentet fra 1-3 dager etter farging siden Phalloidin kan begynne å diffundere ut med utvidet lagring.

3. F-aktin puncta Counting

  1. Slå på fluorescerende mikroskop og bytte til 20 × objektiv. Åpne mikroskop programvare, og sette opp programmet på 1280 × 960 piksler bildestørrelse, og 0,17 mikrometer / pixel bildeoppløsning på 1 x zoom.
  2. Hente bilder av co-merket F-aktin / MAP2 nevroner i henhold til grønt (495 nm) / red (613 nm) fluorescerende kanaler.
  3. Velg 5 Green (F-aktin) / Rød (MAP2) immunolabeled / Blå (Hoescht) fluorescerende bilder av enkelte nervecellen med klart definerte dendrittiske lysthus.
  4. Identifiser F-Actin rike strukturer i andre rekkefølge dendrittiske segment (lengde range 25-75 mikrometer) med kontinuerlig MAP2 immunfluorescens.
  5. Rotere det valgte området av bilder til et horisontalt nivå. Kopier og lim inn som et nytt bilde.
  6. Trekk bakgrunn av bilder, ved hjelp av en konsekvent justeringer for hver tallerken.
  7. Tell lyse grønne F-aktin puncta og spore lengden på valgt dendrittiske segment manuelt av utdannet uavhengige observatører. Eksportere dataene til et regneark-fil.
  8. Beregn tettheten ved å dele total F-aktin merket puncta (N) med lengden (L) av MAP2 merket dendritter. Express data som antall F-actinn puncta per 10 mikrometer av Dendritt
    Merk: puncta (størrelse ≤1.5 um) av F-aktin fluorescens med en toppintensitet på minst 50% over gjennomsnittet intensiteten av fargingen i det dendrittiske akselen ble inkludert i hver valgt dendrittiske segment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dagens metoder, må vi først kultur rotte kortikale nevroner ved lav tetthet i 35 mm glassbunn retter, som tillater oss å identifisere dendritter av enkelte nerveceller. I figur 1 er den differensialinterferenskontrast (DIC) bilder viser de morfologiske forandringer i utviklingen av rottefoster-kortikale neuroner på dag 4, 6, 10, 14, 21 og 27 in vitro. Legg merke til at lengden og antallet av dendritter øker med modning av dyrkede rotte primære neuroner. Nerveceller er brukt i forsøkene bare etter 14 dagers modning.

For å oppdage dendrittiske og synaptiske endringer, kombinerer vi Phalloidin F-aktin merking med MAP2 antistoff påvisning av dendritter. Siden Phalloidin merking av F-aktin er svært hurtig (20-30 minutter), er det mulig visuelt å estimere integriteten til synaptodendritic nettverk før fortsetter med ICC antistoff merking (figur 2

Deretter får vi høyoppløselige bilder av co-merket Phalloidin (F-aktin) / MAP2 nevroner og analysert tilfeldig utvalgte nerveceller. Fin filopodia, ryggrad fremspring, og F-aktin patcher ble ansett F-aktin rike strukturer og ble inkludert i våre studier (figur 3). Segmenter av andre orden dendritter (MAP2 positive) ble valgt for analyse av F-actin puncta tettheter. MAP2 positiv farging blir brukt til å bekrefte den neuronale lokalisering av F-aktin puncta. Computer-assistert deteksjon og telling av Phalloidin (F-aktin) merket (grønn fluorescens kanal) synaptic puncta ble utført via bruk av spesialisert programvare. Det er en trinnvis detaljert protokoll i Figur 4 (r 2 = 0,97).

Tidligere brukte vi kvantifisering av F-aktin puncta å vurdere synaptodendritic skade indusert av HIV-1 Tat 9 og utvinning fra HIV-1 Tat-indusert synaptopathy 10. figur 5, rotte kortikale nevroner ble ko-merket med Phalloidin og MAP2 antistoff etter 50 nM av HIV-1 Tat-behandling. MAP2 farging avdekket færre dendrittiske grener og redusert F-aktin følgende HIV-1 Tat-behandling.

Vi fant ut at F-aktin puncta kan enten økning eller reduksjon i respons til eksperimentell behandling. I Figur 6, ble dyrkede nerveceller behandlet med the-konkurrerende NMDA reseptor antagonist memantin, betydelig økende F-aktin positive puncta. I motsetning til dette, behandling med en kombinasjon av metamfetamin + HIV-1 Tat resulterte i signifikant tap av F-aktin puncta.

Figur 1
Figur 1. rottefoster kortikale nevroner i cellekultur Differential interferens kontrast (DIC) bilder av foster rotte kortikale nevroner mellom 4 -. 27 dager in vitro (20X). Nerveceller vises moden i 14 dager in vitro. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Phalloidin / MAP2 co-merking i rotte kortikale nevroner. Dyrkede nevroner merket med MAP2 antistoff (rød) og Phalloidin (grønn). Sammenslåtte bilder tillate besluttsomhet at Phalloidin farging er lokalisert til nevronale dendritter (20X). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. F-aktin synaptiske strukturer av rotte kortikale nevroner. (A) Venstre - F-aktin positive strukturer merket med Phalloidin (60x). Pilene angir F-aktin merket strukturer omfatter sopp pigger (lilla), patch-lignende morfologi (blå) og lang filopodia (oransje). Middle - sammenslåtte bildet viser disse F-aktin strukturer er lokalisert til dendritter (20X). Høyre - Box i nedre høyre angir den andre for dendrittiske gren valgt for analyse (20X) (B) dendrittiske segmenter av Phalloidin (F-aktin) (grønn) / MAP2. (Red) co-merket kortikale nevroner (20X) brukes til å verifisere neuronal opprinnelse F-aktin puncta. Den grønne eneste bilde (Phalloidin / F-aktin) er videre behandlet. (C) Phalloidin / F-aktin (grønn) bilder av tre dendrittiske segmenter som er valgt for puncta telling. Tettheter bestemmes ved å dividere N / L. N = antall puncta, L = lengden av dendrittiske segment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Demonstrasjon av programvarepakken. Trinnvise instruksjoner Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

/53697fig5.jpg "/>
Figur 5. HIV-1 Tat mediert synaptodendritic skade i rotte kortikale nevroner. Cellekulturer ble co-farget for F-aktin og MAP2 etter HIV-1 Tat protein behandling (50 nM). Øvre panels- ubehandlede nevroner viser robust F-aktin, komplekse forgreninger mønstre, og omfattende fin nevronale prosesser. Nedre paneler - HIV-1 Tat-protein som ble behandlet neuroner med redusert F-aktin og redusert dendritiske forgrening. (20X) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. F-aktin puncta i rotte kortikale nevroner. Forskjellige effekter produsert av Memantine vs. Metamfetamin + Tat behandling Images (20X) av ubehandlede dyrkede nerveceller, nevroner behandlet med Memantin (10 mm), og nerveceller behandlet med MethamphEtamine (20 mm) 10 nM av Tat (10 nM). Memantinbehandling økte F-aktin flekker, mens redusert Metamfetamin + HIV-1 Tat behandling F-aktin flekker og redusert dendrittiske forgrening. Memantin behandling økte signifikant F-aktin puncta tetthet, i forhold til ubehandlede kontrollkulturer. I motsetning til dette, metamfetamin + HIV-1 Tat behandling signifikant redusert F-aktin puncta tetthet, i forhold til ubehandlede kontrollkulturer. Mean + SEM, * p <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen beskriver vi dyrkning rotte kortikale nevroner ved lav tetthet i 35 mm glassbunn retter som tillater oss å identifisere dendritter av enkelte nerveceller. Deretter bruker vi Phalloidin og MAP2 flekker å oppdage dendrittiske endringer. Deretter brukte vi spesialisert programvare for å kvantifisere endringer i F-aktin puncta.

For å bestemme endringer i F-aktin puncta hele nevronale nettverk fra et nevron må være godt synlig, kan dette valget av hensiktsmessige andre ordens dendrittiske segmenter fra en enkelt nervecelle. Lav tetthet plating er kritisk for å visualisere både individuelle nevroner, så vel som for å minimalisere tilstedeværelsen av gliaceller. Astrocytter også inneholde F-aktin og uten en neuronal markør, kan forvirre analyse av F-aktin positive puncta. Lav tetthet kulturer og bruken av Neurobasal medium er nyttige i å redusere astrocytic proliferasjon i cellekulturer. Men gitt det forbeholdet at F-aktin protein erikke spesifikke for neuroner, spesifikke nevronale proteinmarkører, slik som MAP2, bør brukes sammen med Phalloidin. Andre protein-antistoffer kan også bli brukt i forbindelse med Phalloidin, så som TH (tyrosinhydroksylase) for identifisering av spesifikke neuronale populasjoner i kultur.

En generell teknikk for å studere synapser og synaptisk morfologi er immunocytokjemi (ICC). ICC er populære siden mange antistoffer for synaptiske proteinene er lett tilgjengelig, inkludert PSD 95, NMDAR (postsynaptiske) samt synaptophysin, bassoon og synapsin I (presynaptisk) 11. Men noen konstruksjoner kan ikke påvises ved ICC (for eksempel tynn filopodia), men en kombinasjon av F-aktin Phalloidin merking med antistoff deteksjon (eller dobbel merking med to forskjellige antistoffer) kan gi rom for spesifikk og komplekse undersøkelse av synaptiske subpopulasjoner og differensial svar på eksperimentelle behandlinger.

F-aktin puncta kan være particularly følsom for eksperimentell behandling. Vi har nylig rapportert at behandling med HIV-1 Tat-protein som produseres en nedgang i F-aktin puncta (24 timer) før noen tegn på åpenbar neuronal død (48 timer) 10. Det er verdt å merke at eksperimentell behandling enten øke (memantin) eller reduser (metamfetamin + HIV-1 Tat) F-aktin puncta. Vi fant også at F-aktin puncta tap er en reversibel reaksjon etter spesifikke eksperimentell behandling 10. Som sådan, er F-aktin puncta kvantifisering et verdifullt verktøy for å overvåke ikke bare akutt synaptopathy, men også for å studere synaptisk gjenvinning og eksperimentelle neurorestoration prosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10, (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21, (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128, (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
Kvantifisering av Trådformede Actin (F-aktin) puncta i Rat kortikale nevroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter