Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Нитчатых актина белок (F-актина) играет важную роль в spinogenesis, синаптической пластичности и синаптической стабильности. Изменения в дендритных F-актин богатых структур предложить изменения в синаптической целостность и связность. Здесь мы предлагаем подробный протокол для культивирования первичных крысиных корковых нейронов, фаллоидином окрашивание для F-актина Puncta и последующих методов количественного. Во-первых, фронтальная кора E18 крысиных эмбрионов диссоциируют на культуре низкой плотности клеток, затем нейроны, выращенные в пробирке в течение по крайней мере 12-14 дней. После экспериментального лечения, кортикальные нейроны окрашивали AlexaFluor 488 фаллоидином (маркировать дендритных F-актина Puncta) и ассоциированный с микротрубочками белок 2 (map2; для проверки нервных клеток и дендритных целостности). Наконец, специализированное программное обеспечение используется для анализа и количественной оценки случайно выбранных нейронов дендриты. F-актин богатых структур идентифицируются на дендритных ветвей второго порядка (диапазон длины 25-75 &# 181; м) при непрерывном map2 иммунофлюоресценции. Протокол, представленные здесь будет полезным методом для исследования изменений в дендритных синапсов структур последующих экспериментальных процедур.

Introduction

Основная цель данного исследования заключается в разработке надежного метода измерения (оценки) синаптической целостности нейронов дендритных сети. Здесь мы опишем количественный анализ F-актина Puncta в первичной крыса культивируемых нейронов, используя комбинацию фаллоидином окрашивания и иммуноцитохимическое (МУС) обнаружения дендритов с последующим анализом с использованием специализированного программного обеспечения (NIS-Elements).

Меченые phallotoxins имеют схожую аффинность к больших и малых нитей (F-актин), но не связываются с мономерной шаровое актина (Г-актина), в отличие от некоторых актина антителами 1. Неспецифическое связывание из фаллоидином незначительна, тем самым обеспечивая минимальный фон во визуализации клетки. Фаллоидином намного меньше, чем антитела, которые обычно используемых для обозначения клеточных белков для флуоресцентной микроскопии, который делает возможным более интенсивное маркировки F-актина фаллоидином. Таким образом, детальные изображения F-актина локализации в нейронах может бытьполучены при использовании меченого фаллоидином.

Фаллоидином (F-актин) окрашивание нейронов дендриты генерирует дискретные "горячие точки" или ярко "Puncta", которые представляют собой различные дендритных структур, в том числе зрелых шипов, без колючих синапсов 2 и незрелых шипами. Незрелые шипы включают тонкие филоподий и некоторые формы патч морфологии, и может представлять собой начало spinogenesis 3. Незрелые шипы и без колючих пластыри хватает PSD95 4. Изменения в производстве F-актина приводит к последующим изменениям не только в шипов, но и дополнительных дендритных структур, в результате чего фаллоидином важным инструментом для исследования synaptodendritic целостность 5-7. В общем, количество фаллоидином-положительной (F-актин) Puncta отражать баланс между активными синапсов (возбуждающих и тормозных), динамику актина и стабильности синапсов 8.

Хотя важно, чтобы изучить специфические Тypes синапсов (т.е. возбуждающие шипов), когда мишень для лечения неизвестна надо сначала оценить общую целостность различных дендритных структур. Так как F-актин является основным компонентом дендритных шипиков и других структур, в том числе тормозных синапсов, различным числом F-актина Puncta может указывать на synaptopathy. Это synaptopathy затем может быть исследован в дальнейшем для более конкретных изменений. Наш метод количественное для обнаружения нескольких синаптические типы / структуры дает общую оценку дендритных синаптических изменений (увеличений и уменьшений) следующих различных экспериментальных методов лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы животных были рассмотрены и одобрены уходу и использованию комитета животных в Университете Южной Каролины (количество обеспечение: A3049-01) по.

1. Низкая плотность нервные эмбриональные Культура

  1. Подготовка к первичной коркового нейрона культуры
    1. Решения:
      1. Подготовьте поли-L-лизина исходного раствора растворением 5 мг поли-L-лизин в 10 мл боратного буфера.
      2. Подготовьте рабочий раствор путем разбавления 1 мл поли-L-лизин складе в 49 мл боратного буфера.
      3. Подготовьте боратный буфер, рН 8,4, начиная с 395 мл дН 2 O, а затем добавить все ингредиенты (1,24 г борной кислоты + 1,9 г буры). Регулировка рН до 8,4 с помощью 1 М NaOH. Отрегулируйте до 400 мл и фильтруют с 0,2 мкм нейлоновый мембранный фильтр под капотом.
      4. Приготовьте раствор HBSS, рН 7,2, начиная с 445 мл дН 2 O и добавляя все остальные ингредиенты (50 мл 10X HBSS Стоковые + 1,2 г HEPES). Регулировка рН до 7,2 с помощью 1 N HCl, BRIнг до 500 мл и фильтруют с 0,2 мкм фильтр из нейлона мембраны под капотом.
      5. Подготовьте осажденный среду: DMEM / F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Фильтр с 0,2 мкм фильтр нейлоновый мембранный под капотом.
      6. Подготовить всю среду для роста: До 50 мл среды Neurobasal, добавить добавки (500 мкл GlutaMAX (100X) + 500 мкл Глюкоза + 1 мл B-27 (50X) + 500 мкл антибиотикам противогрибкового раствора (100х) + 100 мкл 7,5% бикарбонат натрия. фильтр с 0,2 мкм фильтр нейлоновый мембранный под капотом.
    2. За два дня до культуры:
      1. Coat двенадцать 35 мм со стеклянным дном блюда с 2 мл рабочего раствора поли-L-лизин и держать под капотом O / N.
    3. За один день до культуры:
      1. Пустой покрывающий агент из блюд и промыть DDH 2 O. Разрешить блюда высохнуть в течение часа под капотом.
      2. Подготовьте покрытие среды (DMEM / F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (10% от общего раствора). Внесите 2 мл среды вкаждое блюдо, и инкубировать O / N при 37 ° С, 5% СО 2.
        Примечание: Важно, чтобы избежать пластиковые чашки для культивирования при культивировании. Использование стеклянным дном посуды (для инвертированных микроскопов) или покровные стекла (для вертикальных микроскопов) дает четкие и ясные изображения. По сравнению с пластиковым дном блюдо, со стеклянным дном блюдо избегает нежелательных оттенков или бликов во флуоресцентной микроскопии.
  2. Протокол Клеточная культура:
    1. Положите в холодильнике HBSS буфера (100-150 мл), 100 мм чашках Петри, пинцет, ножницы, 50 мл трубки и 15 мл пробирки под УФ-светом в капот.
    2. Эвтаназии беременных крыс с летальным ингаляции 5% севофлурана под капотом пределами комнатной культуре.
    3. Стерилизовать 70% этанола, палатки коже нижней части живота с помощью щипцов во время резки из хвоста в середине брюшной cavity.Open матка с помощью ножниц, чтобы выставить через плаценту.
    4. Удалить 8-10 E18 плодов. Пласе 8-10 плодов в чашки Петри, содержащие раствор HBSS.
    5. Держите затылок плода щипцами, а затем использовать ножницы, чтобы отрезать голову от тела. Поместите его в другом Петри, наполненной 5-7 мл HBSS. Передача блюдо, чтобы капот.
    6. Заполните два дополнительных 100 мм чашки Петри с холодной HBSS.
    7. Пил сторону черепа, и совок мозг в новой чашки Петри, наполненной HBSS.
    8. Используйте острые изогнутые щипцы, отдельный мозжечок и ствол мозга от мозга, а затем перенести мозг в новом Петри с холодной HBSS в нем.
    9. Используйте пинцет, чтобы обеспечить, отделить полушария с изогнутыми щипцами. Удалить мозговых оболочек; изолировать лобной коры и кусочки передачи в отмеченных 15 мл центрифужные пробирки.
    10. Заполните 15 мл пробирку со свежим 2 мл HBSS и добавить 20 мкл трипсин ЭДТА (10x концентрированную смесь с 0,5% трипсина и 5,3 мМ ЭДТА). Каждому 15 мл пробирку.
    11. Инкубируйте 10-15 мин при комнатной температуре. Аккуратно водоворот трубку каждые несколько минут, не позволяют исчерпывающим.
    12. Мтер 10-15 мин, использование стеклянной пипетки, чтобы удалить старую HBSS и дважды промыть новой HBSS.
    13. Погрузитесь в ингибитор трипсина (1 мг мл, 2 мг ингибитора / Трипсин в 2 мл HBSS), хорошо перемешать и оставьте на 5 мин. Промыть дважды свежей HBSS.
    14. Используя стеклянную пипетку с резиновой грушей, растирают штук мозга 10-15 раз очень медленно, чтобы избежать bubbles.Triturate снова с помощью калиброванного пипетку и стерильный наконечник с уменьшенным диаметром наконечника очень медленно до гомогенного состояния.
    15. Передача диссоциируют клеток при требуемой плотности в заранее подготовленные, покрытые культуральные чашки (50 клеток / мм2). Выдержите O / N при 37 ° С, 5% СО2.
    16. Через 24 часа заменить DMEM / F12, с свежеприготовленный бессывороточной среде Neurobasal полная роста.
    17. Поддержание клеток во все времена в 5% CO 2/95% воздуха в помещении увлажненном инкубаторе в течение по крайней мере 12-14 дней до эксперимента. Дополнение клетки каждые 5-6 дней свежей средой Neurobasal замены примерно 50% старой среде.

2. Люминесцентные Маркировка и Иммуноцитохимическая

Примечание: иммунофлуоресцентного маркировка первичных культурах корковых клеток проводили в стеклянным дном 35 мм чашках для культивирования клеток с рабочим объемом 1 мл.

  1. Промыть со стеклянным дном блюдо дважды фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (PBS).
  2. Устранить клетки с 4% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре.
  3. Промыть клетки дважды PBS и проницаемыми с 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин.
  4. Treat клетки в течение 20 мин при комнатной температуре с F-актина конкретного пятна, AlexaFluor 488 фаллоидином (1:40, 25 мкл фаллоидином в 1 мл PBS).
  5. Промыть клетки дважды PBS и блокируют с 10% нормальной козьей сывороткой при комнатной температуре в течение 1-2 ч.
  6. Развести куриные поликлональных анти-map2 антитела (1: 2500) в PBS с 2% нормальной козьей сывороткой и инкубировать O / N при 4 о С.
  7. После инкубации, промыть в PBS в два раза.
  8. Развести вторичными антителами (Alexa Rред 594-конъюгированного козьего антитела против IgG куриное (1: 500) с 2% нормальной козьей сывороткой и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  9. Промыть PBS и добавить 10 мкл / блюдо Hoescht красителя.
  10. Выдержите 3 мин при комнатной температуре и промывают PBS в два раза.
    Примечание: меченые клетки теперь готов к шагу 3 (F-актин счетной Puncta).
  11. Сохранение клеточного образца с 100 мкл реагента antifade как coverslipping агента и держать при температуре 4 ° С в темноте в течение длительного хранения.
    Примечание: фаллоидином относительно стабилен в PBS при 4 ° С в темноте в течение до 1 недели и флуоресценции может быть сохранена с antifade coverslipping реагентов. Тем не менее, оптимальные изображения получаются из 1-3 дней после окрашивания, так как фаллоидином может начать диффундировать с длительного хранения.

3. F-актин Puncta Подсчет

  1. Включите флуоресцентным микроскопом и переключиться на 20 × цели. Открытое программное обеспечение микроскопа, а также создать программу на × 960 пикселей размером изображения 1280, и 0,1разрешение изображения / пиксель 7 мкм на 1 × зумом.
  2. Получение изображений СО-меченых F-актина / map2 нейронов под зеленым (495 нм) / красный (613 нм) флуоресцентных каналов.
  3. Выберите 5 Зеленый (F-актин) / Красный (map2) immunolabeled / синий (Hoescht) флуоресцентные изображения индивидуального нейрона с четко определенными дендритных беседки.
  4. Определить F-актин богатых структур в дендритных сегменте второго порядка (диапазон длины 25-75 мкм) с непрерывным map2 иммунофлюоресценции.
  5. Поворот выделенной области изображения в горизонтальном уровне. Копирование и вставка в виде нового изображения.
  6. Вычтите фон изображений, используя последовательную корректировку для каждого блюда.
  7. Подсчитайте ярко-зеленый F-актин Puncta и проследить длину выбранного дендритных сегменте вручную обученным независимых наблюдателей. Экспорт данных в файл электронной таблицы.
  8. Рассчитайте плотность путем деления общей F-актина с надписью Puncta (N) на длину (L) из КАРТА 2 меченого дендриты. Экспресс данные как количество F-ACолова Puncta за 10 мкм дендритов
    Примечание: Puncta (размер ≤1.5 мкм) из F-актина флуоресценции с пиковой интенсивности, по крайней мере 50% выше средней интенсивности окрашивания в дендритной вала были включены в каждой выбранной дендритной сегмента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В нынешних методов, мы впервые культуры крысы корковых нейронов при низкой плотности в 35 мм с прозрачным дном посуды, что позволяет выявить дендритов отдельных нейронов. На рисунке 1, дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения показывают морфологические изменения в развитии плода крысы корковых нейронов в дни 4, 6, 10, 14, 21 и 27 в пробирке. Заметим, что длина и количество дендритов увеличивается с созреванием культивируемых первичных крысы нейронов. Нейроны используются в экспериментах только после 14 дней созревания.

Для обнаружения дендритных и синаптические изменения, мы совмещаем фаллоидином F-актина маркировки с обнаружением КАРТА 2 антитела дендритов. Так фаллоидином маркировка F-актина происходит очень быстро (20-30 мин), можно визуально оценить целостность synaptodendritic сети перед выполнением маркировки антител МТП (рисунок 2

Далее, мы получать изображения с высоким разрешением со-меченого фаллоидином (F-актин) / КАРТА 2 нейронов и проанализированы случайно выбранных нейронов. Изысканные филоподии, позвоночника выступы, и F-актин пластыри считались F-актин богатые структуры и были включены в наших исследованиях (рисунок 3). были выбраны сегменты второго порядка дендритов (КАРТА 2 положительных) для анализа F-актина плотностей Puncta. МАР2 положительным окрашивание используется для подтверждения нейрональной локализации F-актина Puncta. Компьютерный обнаружение и подсчет фаллоидином (F-актин) помечены (зеленая флуоресценция канал) синаптической Puncta проводили с помощью использования специализированного программного обеспечения. Существует шаг за шагом подробный протокол на рисунке 4 (R 2 = 0,97).

Ранее мы использовали количественную оценку F-актина Puncta оценить synaptodendritic нарушений, индуцированных ВИЧ-1 Tat 9 и восстановления от HIV-1 Tat-индуцированной synaptopathy 10. На рисунке 5, крысы нейроны коры были совместно метили фаллоидином и map2 антитела после 50 нМ лечения ВИЧ-1 Tat. КАРТА 2 окрашивание показало меньше дендритных ветвей и уменьшилась F-актин следующие ВИЧ-1 Tat обращения.

Мы обнаружили, что F-актин Puncta может либо увеличение или уменьшение в ответ на экспериментальных процедур. На рисунке 6, культивируемые нейроны обрабатывают гое неконкурентоспособной NMDA антагонист рецепторов мемантин, значительно увеличивая F-актина положительный Puncta. Напротив, обработка с комбинацией метамфетамина + ВИЧ-1 Tat привело к значительной потере F-актина Puncta.

Рисунок 1
Рисунок 1. крысиных эмбрионов нейроны коры в культуре клеток дифференциальные интерференционного контраста (DIC) изображения плода крысы корковых нейронов между 4 -. 27 дней в пробирке (20X). Нейроны появляются зрелые на 14 дней в пробирке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

фигура 2
Рисунок 2. фаллоидином / КАРТА 2 совместно маркировки в крысиных корковых нейронов. Культивированный нейронов, меченных MAP2 антитела (красный) и фаллоидином (зеленый). Объединенные изображения позволяют определить, что окрашивание фаллоидином локализуется нейронных дендритов (20х). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 3
Рисунок 3. F-актин синаптические структуры коры головного мозга крыс нейроны. (A) влево - F-актин положительные структуры, меченные фаллоидином (60X). Стрелки указывают F-актин меченые структуры включают грибные шипами (сиреневые), патч-морфологию (синий) и длинный филоподий (оранжевый). Средний - объединенного изображения демонстрации этих F-актин структур локализованы дендритов (20х). Справа - ящик в правом нижнем углу указывает на дендритных ветви второго порядка, выбранный для анализа (20Х) (B) дендритные сегменты фаллоидином (F-актин) (зеленый) / MAP2. (Красный) CO-меченых корковых нейронов (20X) используются для проверки нейронов происхождение F-актина Puncta. Зеленый только изображения (фаллоидином / F-актин) дополнительно обрабатывается. (С) фаллоидином / F-актин (зеленый) изображения трех дендритных сегментов, отобранных для подсчета Puncta. Плотности определяется путем деления N / L. N = количество Puncta, L = длина дендритов сегменте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 4
Рисунок 4. Демонстрация программного пакета:. Пошаговые инструкции Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

/53697fig5.jpg "/>
Рисунок 5. ВИЧ-1 Tat опосредовано synaptodendritic травму в крысиных корковых нейронов. Клеточные культуры совместно окрашивали F-актин и MAP2 после лечения белка ВИЧ-1 Tat (50 нМ). Верхний panels- необработанные нейроны, показывающие надежную F-актин, сложные узоры ветвление и обширные мелкие нейронные процессы. Нижние панели - ВИЧ-1 Tat белок обработанные нейроны с уменьшенной F-актин и пониженной дендритных разветвлений. (20X) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 6
Рисунок 6. F-актина Puncta в крысиных корковых нейронов:. Разные эффекты, вызываемые мемантина против лечения метамфетамина + Tat изображения (20X) необработанных культивируемых нейронах, нейроны, обработанные мемантина (10 мкМ), и нейроны обрабатывают Methamphetamine (20 мкМ) +10 нМ Tat (10 нМ). Лечение Мемантин увеличили F-актина окрашивание, тогда как лечение Метамфетамин + ВИЧ-1 Tat уменьшилось F-актина окрашивание и снижение дендритных разветвление. Лечение Мемантин значительно увеличилось F-актина плотность Puncta, относительно необработанных контрольных культурах. В противоположность этому, метамфетамин + ВИЧ-1 Tat обработки значительно уменьшилось F-актина плотность Puncta, относительно необработанных контрольных культурах. Среднее + SEM, * р <0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе, мы описываем культивирования крысы корковых нейронов при низкой плотности в 35 мм с прозрачным дном посуды, которая позволяет нам идентифицировать дендритов отдельных нейронов. Далее, мы используем фаллоидином и map2 окрашивание для выявления дендритные изменения. Затем мы использовали специализированное программное обеспечение для количественной оценки изменений в F-актин Puncta.

Для определения изменений в F-актин Puncta вся нейронная сеть отдельного нейрона должны быть отчетливо видны, это позволяет выбор соответствующих дендритных сегментов второго порядка от одного нейрона. металлизированный низкой плотности имеет решающее значение в целях как визуализировать отдельные нейроны, а также свести к минимуму присутствие глиальных клеток. Астроциты также содержат F-актин и без нейронов маркер, может запутать анализ F-актина положительного Puncta. Культуры низкой плотности и применение Neurobasal среды являются полезными в уменьшающихся астроцитов пролиферацию в клеточных культурах. Однако, учитывая предостережение, что F-актин белкане специфична для нейронов, определенных нейронных белковых маркеров, таких как МАР2, должны быть использованы вместе с фаллоидином. Другие антитела белковые также может быть использован в сочетании с фаллоидином, таких как TH (тирозин гидроксилазы) для идентификации специфических нейрональных популяций в культуре.

Один общий метод для изучения синапсов и синаптическую морфология иммуноцитохимия (МУС). МТП популярностью, поскольку многие антитела для синаптических белков являются легко доступными в том числе PSD 95, NMDA-(постсинаптический), а также синаптофизином, фагот и синапсины I (пресинаптических) 11. Тем не менее, некоторые структуры не может быть обнаружен с помощью ICC (такие, как тонкая филоподии), а комбинация F-актина маркировки фаллоидином с выявления антител (или двойной маркировки с двух различных антител) может позволить конкретной и комплексного исследования синаптических субпопуляций и дифференциальных ответов на экспериментальных процедур.

F-актин Puncta может быть участнлярно чувствительны к экспериментальным лечения. Мы недавно сообщили, что лечение с помощью ВИЧ-1 Tat белок производится уменьшение F-актина Puncta (24 ч) до каких-либо доказательств для явного гибели нейронов (48 ч) 10. Следует отметить, что экспериментальные процедуры могут либо увеличение (мемантин) или уменьшение (метамфетамин + ВИЧ-1 Tat) F-актина Puncta. Мы также обнаружили, что F-актин потеря Puncta является обратимым ответ следующее конкретных экспериментальных процедур 10. Таким образом, F-актин Puncta количественное является ценным инструментом для мониторинга не только острый synaptopathy, но и для изучения синаптической восстановление и экспериментальные процессы neurorestoration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10, (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21, (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128, (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter