Abstract
proteína actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en espinogénesis, la plasticidad sináptica, y la estabilidad sináptica. Los cambios en las estructuras dendríticas ricas F-actina sugieren alteraciones en la integridad y la conectividad sináptica. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el cultivo de neuronas corticales de rata primaria, tinción faloidina para puntos lagrimales F-actina, y técnicas de cuantificación posteriores. En primer lugar, la corteza frontal de embriones de rata E18 se disocia en cultivo de células de baja densidad, a continuación, las neuronas cultivadas in vitro durante al menos 12-14 días. Después del tratamiento experimental, las neuronas corticales se tiñeron con faloidina AlexaFluor 488 (para etiquetar los puntos lagrimales F-actina dendríticas) y la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2, para validar las células neuronales y la integridad dendríticas). Finalmente, el software especializado se utiliza para analizar y cuantificar las dendritas neuronales seleccionados al azar. F-actina estructuras ricas están identificados en las ramas dendríticas de segundo orden (rango de longitud y 25-75# 181; m) con inmunofluorescencia MAP2 continua. El protocolo presentado aquí será un método útil para la investigación de cambios en las estructuras de la sinapsis dendríticas posteriores a los tratamientos experimentales.
Introduction
El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método fiable de medida (estimación) de la integridad sináptica de la red dendrítica neuronal. A continuación se describe la cuantificación de los puntos lagrimales F-actina en la rata primaria neuronas cultivadas utilizando una combinación de tinción faloidina y detección inmunocitoquímica (CPI) de las dendritas con posterior análisis utilizando software especializado (NIS-Elements).
Falotoxinas etiquetados tienen afinidad similar para los filamentos tanto grandes como pequeñas (F-actina), pero no se unen a la actina monomérica globular (G-actina), a diferencia de algunos anticuerpos de actina 1. La unión no específica de faloidina es despreciable, lo que proporciona el fondo de imagen mínima durante celular. Faloidina es mucho más pequeño que los anticuerpos que normalmente se utilizan para etiquetar proteínas celulares por microscopía de fluorescencia, que permite mucho más intensa etiquetado de F-actina por faloidina. Por lo tanto, a los detalles de la localización de F-actina en neuronas pueden serobtenido mediante el uso de faloidina marcada.
Faloidina (F-actina) tinción de dendritas neuronales discretas genera "puntos calientes" o "puntos lagrimales" brillante, que representan una variedad de estructuras dendríticas maduras, incluyendo las espinas, las sinapsis no espinosas 2 y espinas inmaduras. Espinas inmaduras incluyen filopodios delgadas y algunas formas de la morfología de parches, y pueden representar el inicio de espinogénesis 3. Espinas inmaduras y parches no espinosas carecen PSD95 4. Los cambios en la producción de plomo F-actina a los cambios posteriores en no sólo las espinas dendríticas, sino también estructuras adicionales, con lo que faloidina una herramienta importante para la investigación de la integridad synaptodendritic 5-7. En general, el número de puntos lagrimales faloidina-positivo (F-actina) reflejan un equilibrio entre las sinapsis activas (excitatorias e inhibitorias), la dinámica de actina y la estabilidad sinapsis 8.
Aunque es importante para estudiar t específicaipos de sinapsis (es decir, espinas dorsales excitatorios), cuando se desconoce el objetivo de un tratamiento, es necesario estimar primero la integridad general de una variedad de estructuras dendríticas. Desde F-actina es un componente principal de las espinas dendríticas y otras estructuras, incluyendo las sinapsis inhibidoras, un número alterado de puntos lagrimales F-actina puede indicar un synaptopathy. Este synaptopathy puede entonces investigarse más a fondo de las alteraciones más específicas. Nuestro método de cuantificación para la detección de múltiples tipos / estructuras sinápticas se obtiene una estimación global de las alteraciones sinápticas dendríticas (aumentos y disminuciones) después de varios tratamientos experimentales.
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Protocol
Todos los animales protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de aseguramiento: A3049-01).
1. baja densidad cultivos neuronales embrionarias
- Preparación para el cultivo de neuronas corticales primaria
- soluciones:
- Preparar poli-L-lisina solución madre disolviendo 5 mg de poli-L-lisina en 10 ml de tampón de borato.
- Preparar la solución de trabajo diluyendo 1 ml de poli-L-lisina en 49 ml de tampón borato.
- Preparar tampón borato, pH 8,4, comenzando con 395 ml de H2O destilada y luego añadir todos los ingredientes (1,24 g de ácido bórico + 1,9 g de bórax). Ajustar el pH a 8,4 con NaOH 1 M. Ajuste a 400 ml y filtrar con un filtro de membrana de nylon de 0,2 micras bajo el capó.
- Preparar la solución de HBSS, pH 7,2, comenzando con 445 ml de H2O destilada y añadir todos los demás ingredientes (50 ml 10X HBSS archivo + 1,2 g de HEPES). Ajustar el pH a 7,2 por N HCl 1, bring a 500 ml y filtrar con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó.
- Preparar medio en placa: DMEM / F12 con suero bovino fetal 10%. Filtro con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó.
- Preparar medio de crecimiento completo: Para 50 ml de medio Neurobasal, añadir los suplementos (500 l glutamax (100X) + 500 l Glucosa + 1 ml de B-27 (50X) + 500 l de solución de antibiótico-antimicótico (100X) + 100 l 7,5% El bicarbonato de sodio. filtro con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó.
- Dos días antes del cultivo:
- Escudo vidrio platos de fondo doce de 35 mm con 2 ml de solución de trabajo de poli-L-lisina, y mantener bajo el capó O / N.
- Un día antes de la cultura:
- Agente de recubrimiento de vacío de los platos y enjuagar con ddH2O Permitir que los platos se sequen durante una hora bajo el capó.
- Preparar medio en placa (DMEM / F12 con suero bovino fetal al 10% (10% de la solución total). Pipeta 2 ml de medio encada plato, y se incuba O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
Nota: Es importante evitar placas de cultivo de plástico cuando se cultiva. El uso de vidrio platos de fondo (para microscopios invertidos) o cubreobjetos de vidrio (para microscopios verticales) produce imágenes nítidas y claras. En comparación con un plato de plástico de fondo, el plato de fondo de vidrio evita reflejos no deseados o el deslumbramiento durante la microscopía fluorescente.
- soluciones:
- Protocolo de cultivo celular:
- Pon refrigerada HBSS Buffer (100-150 ml), platos de Petri de 100 mm, pinzas, tijeras, tubos de 50 ml, 15 ml y tubos bajo la luz UV en la campana.
- La eutanasia a ratas preñadas con la inhalación letal de 5% de sevoflurano bajo el capó fuera de la habitación de cultivo.
- Esterilizar con un 70% de EtOH, tienda de la piel del abdomen inferior utilizando fórceps durante el corte de la cola hacia arriba en el medio de cavity.Open abdominal del útero con unas tijeras para exponer la placenta.
- Retire 8-10 fetos E18. Place 8-10 fetos en placas de Petri que contienen solución de HBSS.
- Mantenga la parte posterior de la cabeza del feto con una pinza, a continuación, utilizar tijeras para cortar la cabeza del cuerpo. Colocarlo en otra placa de Petri llena con 5-7 ml de HBSS. Llevar la cápsula a la campana.
- Llenar dos placa de Petri de 100 mm adicional con HBSS frío.
- Pelar un lado del cráneo y cerebro en primicia una nueva placa de Petri llena de HBSS.
- El uso de fórceps curvos afilados, cerebelo y tronco cerebral separada del cerebro, a continuación, transferir cerebro a una nueva placa de Petri con HBSS fría en ella.
- Use pinzas para sujetar, separar los hemisferios con pinzas curvas. Retire las meninges; aislar la corteza frontal y piezas de transferencia en tubos de centrífuga de 15 ml marcados.
- Llenar el tubo 15 ml con 2 ml de HBSS fresco y añadir 20 l de tripsina EDTA (10x mezcla concentrada con 0,5% de tripsina y EDTA 5,3 mM.) A cada tubo de 15 ml.
- Incubar 10-15 min a TA. homogeneizar suavemente el tubo cada pocos minutos, no permitirá cancelar.
- after 10-15 minutos, el uso de pipetas de vidrio para eliminar edad HBSS y se enjuaga dos veces con HBSS nueva.
- Sumergir en inhibidor de tripsina (1 mg / ml, 2 mg de inhibidor de tripsina en 2 ml de HBSS), mezclar bien y dejar reposar 5 minutos. Lavar dos veces con HBSS fresco.
- Usando pipeta de vidrio con el bulbo de caucho, piezas cerebrales triturado en 10-15 veces muy lentamente a fin de evitar bubbles.Triturate de nuevo usando una pipeta calibrada y una punta estéril con un diámetro de la punta reduce muy lentamente hasta homogeneidad.
- Transferencia disoció las células a una densidad deseada para pre-preparadas placas de cultivo recubiertas (50 células / mm2). Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO2.
- Después de 24 horas, sustituya medio DMEM / F12 con medio libre de suero Neurobasal crecimiento completo recién hecho.
- Mantener las células en todo momento en un CO2 / 95% incubador humidificado aire de la habitación 5% durante al menos 12-14 días antes de la experimentación. Suplemento las células cada 5-6 días con medio Neurobasal fresco sustitución de aproximadamente 50% de la edad media.
2. Marcaje fluorescente y inmunocitoquímica
Nota: El etiquetado de inmunofluorescencia de cultivos de células primarias corticales se llevó a cabo en placas de cultivo de vidrio de células de fondo 35 mm con un volumen de trabajo de 1 ml.
- Lavar el plato con fondo de vidrio dos veces con solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4 (PBS).
- Fijar las células con 4% de paraformaldehído durante 15 min a RT.
- Lavar las células dos veces con PBS y se permeabilizan con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5 min.
- Tratar las células durante 20 min a RT con una tinción específica de F-actina, AlexaFluor 488 faloidina (1:40, 25 l de faloidina en 1 ml de PBS).
- Enjuagar las células dos veces con PBS y bloquear con suero de cabra normal al 10% a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
- Diluir el anticuerpo policlonal de pollo anti-MAP2 (1: 2.500) en PBS con suero normal de cabra al 2% y se incuba O / N a 4 ° C.
- Después de la incubación, enjuague en PBS dos veces.
- Diluir el anticuerpo secundario (Alexa Red cabra 594 conjugado con IgG anti-pollo (1: 500) con suero de cabra normal al 2% y se incuba durante 2 horas a RT.
- Enjuague con PBS y añadir 10 l / placa de tinte Hoescht.
- Incubar 3 min a TA y se lava con PBS dos veces.
Nota: Las células marcadas ya está listo para el paso 3 (F-actina conteo de puntos lagrimales). - Preservar muestra de células con 100 l de reactivo antifade como agente de cubreobjetos y mantenerse a 4 ° C en la oscuridad durante el almacenamiento a largo plazo.
Nota: faloidina es relativamente estable en PBS a 4 ° C en la oscuridad durante hasta 1 semana y la fluorescencia puede ser conservado con Antifade reactivos cubrición. Sin embargo, las imágenes óptimas se obtienen a partir de 1-3 días después de la tinción desde faloidina puede empezar a difundirse fuera con un almacenamiento prolongado.
3. F-actina Conteo puntos lagrimales
- Encienda el microscopio de fluorescencia y cambiar a 20 × objetivo. software de microscopio abierta, y estableció el programa de 1280 × 960 píxeles de tamaño de la imagen, y 0,1resolución de imagen / píxeles de 7 micras, con 1 × zoom.
- Adquirir imágenes de co-etiquetado de actina F / neuronas MAP2 con bandera verde (495 nm) / rojo (613 nm) canales fluorescentes.
- Elija 5 Green (F-actina) / rojo (MAP2) immunolabeled / azul (Hoescht) imágenes fluorescentes de neurona individual con árboles dendríticos claramente definidos.
- Identificar las estructuras ricas F-actina en segundo orden segmento dendrítico (intervalo de longitudes de 25-75 micras) con inmunofluorescencia MAP2 continua.
- Rotar la región seleccionada de imágenes a un nivel horizontal. Copiar y pegar como una nueva imagen.
- Restar el fondo de imágenes, utilizando una serie de ajustes constantes para cada plato.
- Contar el brillante F-actina puntos lagrimales verde y rastrear la longitud del segmento dendrítico seleccionada manualmente por observadores independientes entrenados. Exportar los datos a un archivo de hoja de cálculo.
- Calcular la densidad dividiendo F-actina total de puntos lagrimales marcado (N) por la longitud (L) de la etiqueta MAP2 dendritas. expresas de datos como el número de F-acpuncta estaño por 10 m de dendrita
Nota: puntos lagrimales (tamaño ≤1.5 m) de la fluorescencia F-actina con una intensidad máxima de al menos 50% por encima de la intensidad media de la tinción en el eje dendríticas fueron incluidos en cada segmento dendríticas seleccionado.
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Representative Results
En los presentes procedimientos, en primer lugar la cultura de rata neuronas corticales a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, la cual nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. En la Figura 1, el contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes muestran los cambios morfológicos en el desarrollo de rata fetal neuronas corticales en los días 4, 6, 10, 14, 21 y 27 in vitro. Tenga en cuenta que la longitud y el número de dendritas aumentan con la maduración de las neuronas primarias de rata en cultivo. Las neuronas se utilizan en los experimentos sólo después de 14 días de maduración.
Para detectar cambios dendríticas y sinápticas, combinamos el etiquetado faloidina F-actina con la detección de anticuerpos MAP2 de las dendritas. Desde etiquetado faloidina de F-actina es muy rápida (20 a 30 min), es posible estimar visualmente la integridad de la red synaptodendritic antes de proceder con el etiquetado de anticuerpos ICC (Figura 2
A continuación, se adquiere imágenes de alta resolución de faloidina co marcado con (F-actina) / MAP2 neuronas y analizaron las neuronas seleccionadas al azar. Filopodios bien, salientes de la columna vertebral, y los parches de actina F se consideraron estructuras ricas F-actina y se incluyeron en nuestros estudios (Figura 3). Se seleccionaron los segmentos de la segunda dendritas orden (MAP2 positivos) para el análisis de las densidades de puntos lagrimales F-actina. MAP2 tinción positiva se utiliza para confirmar la localización neuronal de los puntos lagrimales F-actina. la detección y recuento de faloidina (F-actina) marcada (canal de fluorescencia verde) asistida por ordenador puntos lagrimales sináptica se llevó a cabo mediante el uso de software especializado. Hay un paso a paso protocolo se detalla en la Figura 4 2 = 0,97).
Anteriormente, hemos utilizado la cuantificación de puntos lagrimales F-actina para evaluar lesiones synaptodendritic inducida por el VIH-1 Tat 9 y la recuperación de synaptopathy inducida por Tat del VIH-1 10. En la Figura 5, neuronas corticales de rata fueron co-etiquetados con el anticuerpo faloidina y MAP2 después de 50 nM de tratamiento del VIH-1 Tat. MAP2 tinción reveló un menor número de ramas dendríticas y la disminución de F-actina tras VIH-1 Tat-tratamiento.
Hemos encontrado que puntos lagrimales F-actina puede aumentar o disminución en la respuesta a los tratamientos experimentales. En la Figura 6, las neuronas cultivadas se trataron con THe NMDA no competitivo antagonista del receptor de la memantina, aumentando significativamente positivo puntos lagrimales F-actina. En contraste, el tratamiento con una combinación de metanfetamina + VIH-1 Tat resultó en una pérdida significativa de puntos lagrimales F-actina.
Figura 1. Las neuronas corticales de rata fetal en cultivo celular imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) de las neuronas corticales de rata fetal entre 4 - 27. Días in vitro (20x). Las neuronas parecen estar maduros a los 14 días in vitro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. faloidina / MAP2 co-etiquetado en las neuronas corticales de rata. Neuronas cultivadas etiquetados con MAP2 de anticuerpos (rojo) y faloidina (verde). Las imágenes fusionadas permiten determinar que la tinción con faloidina se localiza en las dendritas neuronales (20x). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. estructuras sinápticas F-actina de las neuronas corticales de rata. La izquierda (A) - F-actina estructuras positivas marcadas con faloidina (60X). Las puntas de flecha indican las estructuras marcadas F-actina incluyen espinas de hongos (púrpura), parche similar a la morfología (azul) y de largo filopodios (naranja). Medio - fusionado imagen que demuestra estas estructuras de F-actina se localiza en las dendritas (20x). Derecha - Box en la parte inferior derecha indica la rama dendrítica segundo orden seleccionado para el análisis (20X) (B) segmentos dendríticos de faloidina (actina F) (verde) / MAP2. (Rojo) co-etiquetados neuronas corticales (20x) se utilizan para verificar el origen neuronal de puntos lagrimales F-actina. La única imagen verde (faloidina / F-actina) se procesa adicionalmente. Imágenes (C) faloidina / F-actina (verde) de tres segmentos dendríticas seleccionados para el conteo de puntos lagrimales. Las densidades se determinan dividiendo N / L. N = número de puntos lagrimales, L = longitud del segmento dendrítico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Demostración de paquete de software:. Instrucciones paso a paso Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5. El VIH-1 Tat mediada lesión synaptodendritic en las neuronas corticales de rata. Los cultivos celulares se co-tiñeron para F-actina y MAP2 después del tratamiento proteína del VIH-1 Tat (50 nM). Alta Panels- neuronas no tratadas que muestran robusto F-actina, los patrones de ramificación complejos y extensos procesos neuronales finas. - paneles inferiores neuronas tratadas proteína Tat del VIH-1 con la disminución de la F-actina y la disminución de las ramificaciones dendríticas. (20X) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. puntos lagrimales F-actina en neuronas corticales de rata:. Diferentes efectos producidos por la memantina vs. tratamiento de metanfetamina + Tat Imágenes (20X) de las neuronas cultivadas sin tratar, las neuronas tratados con memantina (10 mM), y las neuronas tratadas con Methamphetamine (20 mM) 10 nM de Tat (10 nM). tratamiento con memantina aumentó la tinción de actina F, mientras que el tratamiento de metanfetamina + VIH-1 Tat disminuyó tinción F-actina y la disminución de las ramificaciones dendríticas. tratamiento con memantina aumentó significativamente la densidad de puntos lagrimales F-actina, en relación con los cultivos de control no tratados. En contraste, los tratamientos de metanfetamina + VIH-1 Tat disminuyó significativamente la densidad de puntos lagrimales F-actina, en relación con los cultivos de control no tratados. Media + SEM, * p <0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, se describe el cultivo de neuronas corticales de rata a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, que nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. A continuación, utilizamos faloidina y tinción MAP2 para detectar cambios dendríticas. A continuación, se utilizó un software especializado para cuantificar los cambios en puntos lagrimales F-actina.
Para determinar los cambios en puntos lagrimales F-actina toda la red neuronal de una neurona individual debe ser claramente visible, lo que permite la selección de segmentos dendríticas segundo orden apropiado de una sola neurona. chapado de baja densidad es crítica con el fin de visualizar tanto las neuronas individuales, así como para reducir al mínimo la presencia de células gliales. Los astrocitos también contienen actina F y sin un marcador neuronal, podrían confundir el análisis de los puntos lagrimales positivo F-actina. culturas de baja densidad y el uso de medio Neurobasal son útiles en la disminución de la proliferación de los astrocitos en los cultivos celulares. Sin embargo, dada la advertencia de que la proteína actina F esno es específico de neuronas, los marcadores de proteínas neuronales específicos, tales como MAP2, se debe utilizar junto con faloidina. Otros anticuerpos de proteínas también se pueden utilizar en conjunción con faloidina, como TH (tirosina hidroxilasa) para la identificación de poblaciones neuronales específicas en cultivo.
Una técnica general para el estudio de las sinapsis y la morfología sináptica es inmunocitoquímica (CPI). ICC es popular ya que muchos anticuerpos para proteínas sinápticas son fácilmente disponibles incluyendo PSD 95, NMDAR (post-sináptica), así como la sinaptofisina, fagot y sinapsina I (pre-sináptica) 11. Sin embargo, algunas estructuras no se puede detectar por ICC (por ejemplo, filopodios fina), pero una combinación de etiquetado faloidina F-actina con la detección de anticuerpos (o doble etiquetado con dos anticuerpos diferentes) pueden permitir la investigación específica y compleja de las subpoblaciones sinápticas y respuestas diferenciales a los tratamientos experimentales.
puntos lagrimales F-actina puede ser particlarmente sensible a los tratamientos experimentales. Recientemente hemos informado de que el tratamiento con la proteína Tat del VIH-1 produce una disminución de puntos lagrimales F-actina (24 horas) antes de cualquier evidencia de la muerte neuronal manifiesta (48 h) 10. Es de señalar que los tratamientos experimentales pueden aumentar (memantina) o disminuir (metanfetamina + VIH-1 Tat) F-actina puntos lagrimales. También se encontró que la pérdida de puntos lagrimales F-actina es una respuesta reversible después de los tratamientos experimentales específicos 10. Como tal, la cuantificación puntos lagrimales F-actina es una herramienta valiosa para controlar no sólo synaptopathy aguda, sino también para el estudio de los procesos experimentales neurorestoration recuperación sináptica y.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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