Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

(F-aktin) İpliksi aktin proteini spinogenesis, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilitesinde önemli bir rol oynar. dendritik F-aktin zengin yapılardaki değişiklikler sinaptik bütünlük ve bağlantı değişiklikleri göstermektedir. Burada F-aktin puncta ve sonraki ölçümü teknikleri için birincil sıçan kortikal nöronların, Phalloidin boyama kültürü için ayrıntılı bir protokol sağlar. İlk olarak, E18 fare embriyonlarının frontal korteks, daha sonra, düşük yoğunluklu, hücre kültürü içine en az 12-14 gün boyunca in vitro yetiştirilen nöronlar ayrışmış. Deneysel tedaviden sonra, kortikal nöronlar AlexaFluor 488 falloidinle boyanır ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (dendritik F-aktin puncta etiket) (MAP2; nöronal hücreleri ve dendritik bütünlüğünü doğrulamak için). Son olarak, özel yazılım analiz ve rastgele seçilen nöronal dendrite ölçmek için kullanılır. F-aktin zengin yapılar ikinci mertebe dendritik dalları (uzunluk aralığı 25-75 ve tespit edilir# 181; sürekli map2 immünofloresan ile m). Burada sunulan protokol deneysel tedaviler sonrasında dendritik sinaps yapılarında değişiklikler araştırmak için faydalı bir yöntem olacaktır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışmanın temel amacı, nöronal dendritik ağın sinaptik bütünlüğünün ölçümü (tahmini) güvenilir bir yöntem geliştirmektir. Burada Phalloidin boyama ve uzman (NIS-Elemanları) yazılımı kullanılarak takip eden analizi ile dendritler immunositokimyasal (ICC) taramadan oluşan bir kombinasyon kullanılarak primer fare kültürlenmiş nöronlar F-aktin puncta ölçülmesini açıklar.

Etiketli phallotoxins büyük ve küçük ipliklerin (F-aktin) için benzer bir yakınlığa sahip fakat bazı aktin antikor 1 farklı olarak, monomerik küresel aktin (G-aktin) bağlanmaz. Phalloidin bağlayıcı Nonspesifik böylece hücresel görüntüleme sırasında en az bir arka plan sağlayarak, ihmal edilebilir düzeydedir. Phalloidin genellikle Phalloidin F-aktin çok daha yoğun etiketleme sağlar flüoresan mikroskopi için hücresel proteinleri etiketlemek için kullanılacak antikorlar çok daha küçüktür. Böylece, nöronlarda F-aktin lokalizasyonu detaylı görüntüler olabilirişaretlenmiş falloidinle kullanılması yoluyla elde edilmiştir.

Phalloidin nöronal dendritler (F-aktin) boyama olgun dikenleri olmayan dikenli sinaps 2 ve olgunlaşmamış dikenler de dahil olmak üzere dendritik yapıların, çeşitli temsil eden ayrık "sıcak noktalar" ya da parlak "puncta" oluşturur. Olgunlaşmamış dikenleri ince filopodia ve yama morfolojisi bazı formları içerir ve spinogenesis 3 başlatılmasını temsil edebilir. Olgunlaşmamış dikenleri olan ve olmayan dikenli yamalar PSD95 4 yoksundur. Sadece dikenler sonraki değişiklikler değil, aynı zamanda ek dendritik yapılara F-aktin kurşun üretiminde değişiklikler, böylece synaptodendritic bütünlüğünü 5-7 araştırmak için önemli bir araç faloidin adrestir. Genel olarak, Phalloidin-pozitif (F-aktin) puncta sayısı bir aktif sinapsların arasında bir denge (eksitatör ve inhibitör), aktin dinamiklerini ve sinaps istikrar 8 yansıtmaktadır.

belirli t incelemek önemli olmasına rağmenBir tedavinin hedefi bilinmediğinde sinaps (yani, uyarıcı dikenleri) bir Dosya türleri, ilk dendritik yapıların çeşitli genel bütünlüğünü tahmin etmek için gereklidir. F-aktin önleyici sinaps bir synaptopathy gösterebilir F-aktin puncta bir değiştirilmiş sayısı dahil olmak üzere dendritik dikenler ve diğer yapıların, önemli bir bileşeni olduğu için. Bu synaptopathy daha sonra belirli değişiklikler için daha fazla araştırılması olabilir. Birden fazla sinaptik türleri / yapıların tespiti için bizim miktar yöntemi çeşitli deneysel tedaviler aşağıdaki dendritik sinaptik değişiklikler (artış ve azalışlar) genel bir tahmin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan protokolleri gözden geçirilmiş ve Güney Carolina Üniversitesi'nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (güvence numarası: A3049-01) tarafından onaylanmıştır.

1. Düşük yoğunluklu Embriyonik Nöronal Kültür

  1. Primer kortikal nöron kültürü için hazırlık
    1. Çözümler:
      1. 10 ml borat tamponu Poli-L-Lizin 5 mg çözülmesiyle Poli-L-Lisin stok çözelti hazırlayın.
      2. 49 mi borat tamponu içinde 1 ml poli-L-lizin stok seyreltilmesi ile çalışma çözeltisi hazırlayın.
      3. 395 mi DH 2 O ile başlayan ve daha sonra tüm maddeler (Boraks 1.24 g borik asit + 1.9 g) eklenerek borat tamponu, pH 8.4 hazırlanır. 1 M NaOH ile 8.4 pH ayarlayın. 400 ml ayarlayın ve kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre.
      4. 445 ml dH 2 O ile başlayan ve diğer tüm maddeler ekleyerek HBSS çözüm, pH 7.2 hazırlayın (50 ml 10X HBSS Stok + 1.2 g HEPES). 1 N HCI, bri tarafından pH'ı 7.2'ye ayarlayınng 500 ml ve kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre.
      5. % 10 fetal bovin serumu içeren DMEM / F12: Kaplama orta hazırlayın. kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre.
      6. tam büyüme ortamı hazırlayın: 50 ml Neurobasal orta için, takviyeleri ekleyin (500 ul GlutaMAX (100X) + 500 ul Glukoz antibiyotik antimikotik çözüm (100X + 1 ml B-27 (50X) + 500 ul) + 100 ul% 7.5 sodyum Bikarbonat. kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre.
    2. İki gün kültür öncesi:
      1. 2 Poli-L-Lizin çalışma solüsyonu ve kaput O / N altında tutmak ile kaplayın oniki 35 mm cam alt yemekler.
    3. kültür bir gün önce:
      1. GKD 2 O. ile boş kaplama yemekler ajan ve durulama Yemekler kaputun altında bir saat kurumaya bırakın.
      2. % 10 fetal sığır serumu (toplam çözeltinin% 10) ile kaplanmış ortamı (DMEM / F12 hazırlayın. Pipet 2 mi ortam içineher yemeğin ve 37 o C,% 5 CO 2 O / N kuluçkaya yatmaktadır.
        Not: kültürlerken plastik kültür kaplarına önlemek için önemlidir. cam alt (ters Mikroskop) yemekleri ya da (dik mikroskoplar) cam lamelleri kullanılması keskin ve net görüntüler verir. Bir plastik alt tabak ile karşılaştırıldığında, cam alt çanak floresan mikroskopi sırasında istenmeyen tonları veya parlamayı önler.
  2. Hücre kültürü protokolü:
    1. HBSS Buffer (100-150 ml), buzdolabında koymak 100 mm petri, forseps, makas, 50 ml tüpler ve kaputu UV ışık altında 15 ml tüpler.
    2. kültür odası dışında başlık altında% 5 sevofluran öldürücü inhalasyon ile gebe sıçan Euthanize.
    3. % 70 EtOH, çadır karın cavity.Open plasentayı maruz makas kullanarak rahim ortasında kuyruk yukarıya kesim sırasında forseps kullanarak alt karın derisi ile sterilize edin.
    4. 8-10 E18 fetus çıkarın. PlaHBSS çözeltisi ihtiva eden petri çanakları 8-10 fetus ce.
    5. forseps ile fetusun başının arkasını tutun, sonra vücuttan kafasını koparmaya makas kullanın. HBSS 5-7 ml ile dolu başka bir petri yerleştirin. kaput çanak aktarın.
    6. Soğuk HBSS ile iki ek 100 mm petri doldurun.
    7. Peel kenara kafatası ve HBSS ile dolu yeni bir petri içine beyin kepçe.
    8. sonra bunun soğuk HBSS ile yeni bir petri beyin transferi, beyinden gelen keskin kavisli bir forseps, ayrı beyincik ve beyin sapı kullanın.
    9. kavisli bir forseps ile hemisfer ayırmak, sabitlemek için cımbız kullanın. meninks çıkarın; İşaretli 15 ml santrifüj tüplerine frontal korteks ve transfer parçaları izole.
    10. Taze 2 mi HBSS ile 15 ml tüp doldurun ve her biri 15 ml'lik bir tüpe 20 ul tripsin EDTA (% 0.5 tripsin ve 5.3 mM EDTA. 10x konsantre edildi) ekleyin.
    11. Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkalayın. Yavaşça tüpü birkaç dakikada girdap, yerleşme izin vermez.
    12. After 10-15 dk, kullanım cam pipet eski HBSS kaldırmak ve yeni HBSS ile iki kez durulayın.
    13. (2 mi HBSS içinde 1 mg / ml, 2 mg tripsin inhibitörü) tripsin inhibitörü daldırın, iyice karıştırın ve 5 dakika bekletin. Taze HBSS ile iki kez yıkayın.
    14. Yine bir kalibre pipet ve çok yavaş homojen hale gelene kadar azaltılmış ucu çapı ile steril bir ucunu kullanarak bubbles.Triturate önleyecek şekilde çok yavaş çiğnemek beyin parçaları, lastik ampul 10-15 kez cam pipet kullanarak.
    15. Aktarım istenilen yoğunlukta hücreler çözülmüş kaplanmış kültür kaplarına (50 hücre / mm2) hazırlanmış ön. 37 o C,% 5 CO2 O / N inkübe edin.
    16. 24 saat sonra, taze tam büyüme serumsuz Neurobasal orta DMEM / F12 ortamı değiştirin.
    17. Deney için en az 12-14 gün% 5 CO 2/95% odada nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde her zaman hücreleri korumak. Taze Neurobasal orta yaşlı orta yaklaşık% 50 yerine her 5-6 gün hücreleri tamamlar.

2. Floresan Etiketleme ve İmmünositokimya

Not: Birincil kortikal hücre kültürleri immünofloresan markalama 1 ml'lik bir çalışma hacmine sahip cam alt 35 mm'lik bir hücre kültür tabaklarında gerçekleştirilmiştir.

  1. fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (PBS) ile iki defa cam alt bulaşık yıkama.
  2. Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid hücreleri saptamak.
  3. PBS ile iki kez yıkanır hücreler, 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenliği.
  4. F-aktine özel leke ile oda sıcaklığında 20 dakika için hücreleri tedavi, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 1 ml PBS içinde Phalloidin 25 ul).
  5. PBS ile iki kez hücreleri durulanır ve 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında% 10 normal keçi serumu ile bloke eder.
  6. % 2 normal keçi serumu ile PBS içinde 4 O ° C'de O / N inkübe: Tavuk poliklonal anti-MAP2 antikoru (2.500 1) ile seyreltilir
  7. inkübasyondan sonra, iki kez PBS ile durulayın.
  8. ikincil antikor (Alexa R sulandırmakEd 594-konjuge keçi anti-tavşan IgG'si (1: 500)% 2 normal keçi serumu ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
  9. PBS ile durulayın ve 10 ul / Hoescht boya çanak ekleyin.
  10. Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın ve iki kez PBS ile yıkayın.
    Not: Adım 3 (F-aktin puncta sayma) için artık etiketli hücreler hazır.
  11. Bir Lamel Kapatma ajan olarak antifade reaktif 100 ul ile hücre örneği korumak ve uzun süreli depolama için karanlıkta 4 o C'de tutun.
    Not: Phalloidin antifade Lamel reaktifleri ile korunabilir 1 hafta ve floresan kadar karanlıkta 4 ° C'de PBS içinde nispeten kararlıdır. Phalloidin uzatılmış depolama ile difüze başlayabilir Bununla birlikte, uygun resim boyama sonrası 1-3 gün elde edilir.

3. F-aktin puncta Sayma

  1. floresan mikroskop açın ve 20 × amacı geçmek. Açık mikroskop yazılımı ve 1280 × 960 piksel görüntü boyutunda program kurmak, ve 0.11 × zum 7 mikron / piksel görüntü çözünürlüğü.
  2. Kırmızı yeşil (495 nm) / (613 nm) floresan kanal altında eş etiketli F-aktin / map2 nöronların görüntüler elde.
  3. 5 Yeşil (F-aktin) / Kırmızı (map2) immunolabeled / Mavi (Hoescht) açıkça tanımlanmış dendritik milleri ile bireysel nöronun floresan görüntüleri seçin.
  4. Sürekli map2 immünofloresan ile ikinci dereceden dendritik segmentte (uzunluk aralığı 25-75 mikron) F-aktin zengin yapıları belirleyin.
  5. yatay bir seviyeye görüntüleri seçili bölgeyi döndürün. yeni bir resim olarak Kopyala ve yapıştır.
  6. Her yemeğin tutarlı ayarlamalar kullanarak, görüntülerin arka planını çıkarın.
  7. Parlak yeşil F-aktin puncta saymak ve elle eğitimli bağımsız gözlemciler tarafından seçilen dendritik parçasının uzunluğunu iz. Bir tablo dosyasına veri verir.
  8. Map2 dendrit etiketli uzunluğu (L) toplam F-aktin etiketli puncta (N) bölünmesi ile yoğunluğunu hesaplayınız. F-ac sayısı Express verilerinidendrit 10 mikron başına kalay puncta
    Not: puncta dendritik mili boyanma ortalama yoğunluğu en az 50% bir tepe şiddetine sahip F-aktin floresans (boyut ≤1.5 um), seçilen her bir dendritik bölümüne dahil edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mevcut yöntemlerle, biz ilk kültür sıçan bizi bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta, kortikal nöronlar. Şekil 1 'de, diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve görüntüler gün 4, 6, 10, in vitro olarak 14, 21 ve 27 fetal sıçan kortikal nöronlar geliştirmek morfolojik değişiklikleri gösterir. uzunluk ve Dentritlerin sayısı kültürlü sıçan primer nöronlar olgunlaşması ile artış olduğunu unutmayın. Nöronlar, sadece 14 gün olgunlaşmasından sonra deneylerde kullanılır.

dendritik ve sinaptik değişiklikleri tespit etmek, biz dendritlerinin map2 antikor tespiti ile Phalloidin F-aktin etiketleme birleştirir. F-aktin Phalloidin etiketleme (20-30 dk) çok hızlı olduğundan görsel ICC antikor etiketleme (Şekil 2 geçmeden önce synaptodendritic ağın bütünlüğünü tahmin etmek mümkün değildir

Sonra, eş-etiketli Phalloidin (F-aktin) / map2 nöronların yüksek çözünürlüklü görüntüler elde ve rastgele seçilen nöronlar analiz. Güzel filopodia, omurga çıkıntılar ve F-aktin yamalar F-aktin zengin yapılar olarak kabul edildi ve çalışmalarımız (Şekil 3) alındı. (MAP2 pozitif) ikinci derece dendritler segmentleri F-aktin puncta yoğunlukları analizi için seçildi. Map2 pozitif boyanma F-aktin puncta nöronal lokalizasyonu onaylamak için kullanılır. Bilgisayar destekli algılama ve Phalloidin (F-aktin) etiketli (yeşil floresan kanal) sayma sinaptik puncta özel yazılım kullanımı yoluyla gerçekleştirildi. Şekil 4, adım ayrıntılı protokol ile bir kademe mevcuttur 2 = 0.97) çok yüksek olduğunu bildirmişlerdir.

Daha önce, HIV-1 Tat-kaynaklı synaptopathy 10 HIV-1 Tat 9 ve geri neden synaptodendritic hasarı değerlendirmek için F-aktin puncta ölçülmesini kullanılır. Şekil 5, sıçan kortikal nöronlar eş etiketli, HIV-1 Tat tedavi 50 nM sonra Phalloidin ve MAP2 antikor. MAP2 boyama az dendritik dalları ortaya ve HIV-1 Tat-tedaviden sonra F-aktin azaldı.

Bulduğumuz F-aktin puncta deney uygulamaya yanıt olarak artış veya azalma olabileceği gibi. Şekil 6'da, kültürlenmiş nöronlar th ile muamele edildiE rekabetsiz NMDA reseptör antagonisti memantin önemli ölçüde F-aktin pozitif puncta artar. Bunun aksine, metamfetamin + HIV-1 Tat bir kombinasyonu ile tedavi F-aktin puncta önemli bir kayıp ile sonuçlanmıştır.

Şekil 1
Şekil hücre kültüründe 1. Fetal sıçan kortikal nöronlar 4 arasında fetal sıçan kortikal nöronların Diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri -. Vitro 27 gün (20X). Nöronlar in vitro 14 gün olgun görünüyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Sıçan kortikal nöronlarda Şekil 2. Phalloidin / map2 ko-etiketleme. MAP ile etiketlenmiş Kültür nöronlar2 antikoru (kırmızı) ve Phalloidin (yeşil). Birleştirilmiş görüntüleri Phalloidin boyama nöronal dendritler (20X) lokalize belirlenmesi. Izin bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Sıçan kortikal nöronların Şekil 3. F-aktin sinaptik yapılar. (A) Sol - Phalloidin (60X) ile etiketlenmiş F-aktin pozitif yapılar. ok uçları F-aktin etiketli yapılar mantar dikenleri (mor), yama benzeri morfoloji (mavi) ve uzun filopodia (turuncu) içerir gösterir. Orta - Bu F-aktin yapıları gösteren Birleştirilmiş görüntü dendritler (20X) lokalize edilmiştir. Sağ - Sağ alt Kutu analizi (20X) için seçilen ikinci dereceden dendritik şube gösterir (B) Phalloidin (F-aktin) (Yeşil) / map2 dendritik segmentleri. (Kırmızı) eş-etiketli kortikal nöronlar (20X) F-aktin puncta nöronal kaynağını doğrulamak için kullanılır. Yeşil yalnızca resim (Phalloidin / F-aktin) ayrıca işlenir. Puncta sayımı için seçilmiş en çok üç dendritik segment (C) Phalloidin / F-aktin (yeşil) ve görüntüler. Yoğunlukları N / L bölünmesi ile tespit edilir. N = puncta, L = dendritik segmentin uzunluğu sayısıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Yazılım paketinin 4. Gösteri Şekil:. Adım adım yönergeler bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/53697fig5.jpg "/>
Şekil 5. HIV-1 Tat sıçan kortikal nöronlarda synaptodendritic yaralanma aracılı. Hücre kültürleri, HIV-1 Tat proteini tedavisi (50nM) sonra F-aktin ve map2 eş boyandı. Üst Sağlam F-aktin, karmaşık dallanma desenleri ve geniş ince nöronal süreçleri gösteren işlenmemiş nöronlar paneller. Alt paneller - F-aktin azalmış ve azalmış dendritik dallanma HIV-1 Tat proteini tedavi nöronlar. (20X) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. F-aktin sıçan kortikal nöronlarında puncta. Metamfetamin + Tat tedavi genel Memantin tarafından üretilen farklı etkileri tedavi edilmemiş kültürlenmiş nöronların Görüntü (20X) memantin (10 uM) ile muamele nöronlar ve sinir Methamph ile işlemden geçirildietamine (20 uM) Tat (10 nM) + 10 nM. Metamfetamin + HIV-1 Tat Tedavi F-aktin boyama azalmış ve dendritik dallanma gerilemiştir Memantin tedavisi, F-aktin boyama arttı. Memantin tedavisi, muamele edilmemiş kontrol kültürlerine göre F-aktin puncta yoğunluğu artmıştır. Bunun aksine, metamfetamin + HIV-1 Tat tedaviler önemli ölçüde muamele edilmemiş kontrol kültürlerine göre F-aktin puncta yoğunluğu azalmıştır. + SEM, * p <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol, bize bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta sıçan kortikal nöronların kültürleme açıklar. Sonra, dendritik değişiklikleri tespit etmek faloidin ve map2 boyama kullanın. Sonra, F-aktin puncta değişiklikleri ölçmek için özel yazılım kullanılır.

F-aktin puncta bireysel nöronun tüm nöronal ağ açıkça görünür olmalıdır değişiklikleri belirlemek için, bu tek bir nörondan uygun ikinci dereceden dendritik segmentlerin seçilmesini sağlar. Düşük yoğunluklu kaplama bireysel nöronlar görselleştirmek ve glial hücrelerin varlığını en aza indirmek için, her iki için kritiktir. Astrositler da F-aktin içeren ve bir nöronal marker olmadan, F-aktin pozitif puncta analizini bulandırabilir olabilir. Düşük yoğunluklu kültürleri Neurobasal ortamın kullanılması hücre kültürlerinde astrositik proliferasyonunu azaltmada faydalıdır. Ancak, F-aktin proteini olduğu ihtar verildinöronlar gibi MAP2'nin spesifik nöronal protein işaretleri, özel olmayan, falloidinle birlikte kullanılmalıdır. Diğer protein antikorları aynı zamanda kültür içinde spesifik sinir hücresi popülasyonlarının tanımlanması için örneğin TH olarak Phalloidin (tirosin hidroksilaz) ile bağlantılı olarak kullanılabilir.

sinaps ve sinaptik morfoloji eğitim için genel bir tekniktir immünsitokimya (ICC) 'dir. Sinaptik proteinler için birçok antikorlar PSD 95 de dahil olmak üzere hali hazırda mevcuttur, çünkü ICC popüler, (post-sinaptik) yanı sıra, sinaptofisin, bassoon ve (pre-sinaptik) sinapsin NMDAR Bununla birlikte, bazı yapıların ICC (örneğin, tespit edilemez 11. ince filopodia), fakat antikor tespiti (veya iki farklı antikorları ile çift etiketleme ile F-aktin Phalloidin etiketleme bir kombinasyonu) sinaptik alt popülasyonları ve deneysel tedaviler diferansiyel yanıtları özel ve karmaşık soruşturma için izin verebilir.

F-aktin puncta katılımı ile olabilirDeneysel tedavilere durum daha ziyade hassas. Son zamanlarda, HIV-1 Tat proteini ile tedavi belirgin nöronal ölüm (48 sa) 10 uygun herhangi bir kanıt önce F-aktin puncta (24 saat) bir düşüş yarattığını gösterdi. Bu not deneysel tedaviler olabilir ya artışı (memantin) veya azaltmak (metamfetamin + HIV-1 Tat) F-aktin puncta biridir. Biz de F-aktin puncta kaybı özgü deneysel tedaviler 10 Aşağıdaki tersine çevrilebilir bir tepki olduğunu gördük. Bunun gibi, F-aktin puncta ölçümü akut synaptopathy değil, aynı zamanda sinaptik kurtarma ve deneysel neurorestoration süreçlerini incelemek için sadece izlemek için değerli bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10, (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21, (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128, (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter