Questo lavoro presenta un protocollo di gestione dei liquidi e di introduzione del campione ad un microcanali per in situ tempo di volo ioni secondari analisi di spettrometria di massa di biomolecole proteina in una soluzione acquosa.
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Articolo metodologico
In Situ Caratterizzazione di idrate proteine in acqua da Salvi e TOF-SIMS
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo lavoro dimostra in situ caratterizzazione di biomolecole di proteine nella soluzione acquosa utilizzando il sistema per l'analisi al Interface Vacuum Liquid (SALVI) e tempo di volo spettrometria di massa di ioni secondari (TOF-SIMS). Il film proteine fibronectina è stato immobilizzato sulla membrana di nitruro di silicio (SiN) che forma l'area di rilevamento SALVI. Durante l'analisi ToF-SIMS, sono stati condotti tre modalità di analisi compreso alta spettrometria di massa spaziale risoluzione, immagini bidimensionali (2D), e profili di profondità. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in entrambe le modalità positivi e negativi. acqua deionizzata è stato anche analizzato come un campione di riferimento. I nostri risultati mostrano che il film fibronectina in acqua ha più distinti e più forti picchi di cluster di acqua rispetto alla sola acqua. picchi caratteristici di frammenti di amminoacidi sono anche osservabili nella proteina idratata ToF-SIMS spettri. Questi risultati dimostrano che molecola proteica adsorbimento su una superficie può essere studiato Dynamically usando Salvi e ToF-SIMS nell'ambiente liquido per la prima volta.
Introduzione
L'idratazione è cruciale per la struttura, 1 conformazione, 2 e 3 attività biologica delle proteine. Le proteine senza molecole d'acqua che li circondano non avrebbero attività biologiche vitali. In particolare, le molecole d'acqua interagiscono con la superficie e la struttura interna delle proteine, e diversi stati di idratazione di proteine rendono tali interazioni distinte. 4 L'interazione delle proteine con le superfici solide è un fenomeno fondamentale, con implicazioni nel campo delle nanotecnologie, biomateriali e processi di ingegneria tissutale. Studi hanno a lungo indicato che i cambiamenti ....
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Protocollo
1. Pulizia e sterilizzazione della Microchannel SALVI
- Sterilizzazione della Microchannel in SALVI
- Disegnare 2 ml di soluzione acquosa al 70% di etanolo in una siringa, collegare la siringa con l'estremità di entrata della SALVI, e iniettare lentamente 1 ml del liquido in 10 min. Rimuovere la siringa al termine dell'iniezione. Quindi, collegare l'ingresso e l'uscita di SALVI utilizzando un polietereterchetone (PEEK) unione. In alternativa, utilizzare una pompa a siringa per condurre la stessa procedura. Ad esempio, impostare la velocità di flusso a 100 microlitri / min.
- Mantenere la microcanali SALVI riempito con soluzione....
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Risultati
Un paio di risultati rappresentativi sono presentati per dimostrare i vantaggi del protocollo proposto. Utilizzando l'interfaccia microfluidica SALVI, il fascio di ioni primario (Bi 3 +) può bombardare direttamente sul film fibronectina idratato in acqua deionizzata. Così la mappatura chimica molecolare della superficie del liquido può essere acquisito correttamente.
Figura 1a
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Discussione
SALVI è un'interfaccia microfluidico che consente superficie del liquido dinamico e analisi interfaccia liquido-solido da strumenti vuoto based, come ToF-SIMS e microscopia elettronica a scansione (SEM). A causa l'utilizzo di piccole aperture per esporre il liquido direttamente nel vuoto, SALVI è adatto per molte spettroscopia e di imaging tecniche finemente focalizzato, senza alcuna modifica; 22 la portabilità e la versatilità di microfluidica ne fanno una vera e propria piattaforma di imaging multim.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati al fondo LDRD del Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) e Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD. L'accesso strumentale è stato fornito attraverso una proposta a tema scientifico del W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL è una struttura scientifica nazionale sponsorizzata dall'Office of Biological and Environmental Research (BER) del PNNL. Gli autori ringraziano il signor Xiao Sui, il signor Yuanzhao Ding e la signora Juan Yao per aver corretto le bozze del manoscritto e per aver fornito un uti....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF. Risoluzione SIMS 5 | : >10.000 m/Δ m per la risoluzione di massa; >4.000 m/Δ m per alta risoluzione spaziale |
| Sistema per l'analisi presso l'interfaccia del vuoto liquido (SALVI) | Northwest National Laboratory | N/A | SALVI è uno strumento analitico unico, autonomo e portatile che, per la prima volta, consente a strumenti scientifici basati sul vuoto come la spettrometria di massa di ioni secondari a tempo di volo (ToF-SIMS) di analizzare le superfici liquide nel loro stato naturale a livello molecolare. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | per il collegamento dell'ingresso e dell'uscita del |
| SALVI 5 assi Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage è autocostruito per il montaggio di SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Modulo di filtrazione ad osmosi inversa (D2716) |
| Siringa | BD | 309659 | 1 ml |
| Pipetta | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Intervallo: da 100 a 1.000 ml |
| Puntale per pipette | Neptune | 2112.96.BS | 1.000 &; l |
| Provetta da centrifuga | Corning | 430791 | 15 ml |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/ml |
| Etanolo | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% denaturato |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
Riferimenti
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M.
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Ristampe e permessi
