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Chemistry

サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質その場キャラクタリゼーション

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

この作業は、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場での飛行時間型二次イオン質量分析のためにマイクロチャネルに液体ハンドリング及び試料導入のためのプロトコルを示します。

Abstract

この作業は、液体真空インターフェース(サルヴィ)および飛行時間型二次イオン質量分析法(TOF-SIMS)での分析のためのシステムを使用して、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場特徴付け実証しています。フィブロネクチンタンパク質フィルムはサルヴィ検出領域を形成する窒化シリコン(SiN)膜上に固定化しました。 TOF-SIMS分析中、分析の三つのモードは、高空間分解能質量分析、二次元(2D)画像、深さプロファイリングを含む行いました。質量スペクトルは、正と負の両方のモードで取得しました。脱イオン水は、また、基準サンプルとして分析しました。我々の結果は、水中のフィブロネクチン膜は水のみと比較して、より明確で強い水クラスターのピークを有することを示します。アミノ酸断片の特徴的なピークは、水和タンパク質TOF-SIMSスペクトルにおいても観察されています。これらの結果は、表面上のタンパク質分子の吸着はdynamicaを研究することができることを示しますLLY初めて液体環境にサルヴィとTOF-SIMSを用いました。

Introduction

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水分補給は、構造、1コンフォメーション、2およびタンパク質の生物学的活性を3に不可欠です。それらを取り囲む水分子のないタンパク質は、生存可能な生物学的活性を持っていないでしょう。具体的には、水の分子が表面と相互作用およびタンパク質の内部構造、およびタンパク質の異なる水和状態は、このような相互作用が別個にする。4固体表面とのタンパク質の相互作用は、ナノテクノロジー、バイオマテリアルと組織工学プロセスにおける意義と基本的な現象です。研究は、長いタンパク質が表面に遭遇すると立体構造変化が発生する可能性があることが示されています。 TOF-SIMSは、タンパク質-固体界面を研究する可能性を秘めている技術として想定されている。5-7潜在的にその構造のメカニズムの基本的な理解を提供する固体表面上のタンパク質の水和を、理解することが重要です、コンフォメーション、および生物学アル・アクティビティ。

しかし、主要な表面分析技術は、主に真空ベースであり、揮発性液体の研究のための直接のアプリケーションが原因で、真空環境下での揮発性液体の急速な蒸発のために困難です。我々は、液体の表面および液体-固体相互作用(TOF-SIMS)飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて直接観察を可能にするために、液体真空インターフェース(サルヴィ)で分析するために、互換性のあるマイクロ流体インターフェースシステム真空を開発しました。8- 1)検出ウィンドウ2)の表面張力を開口部内に液体を保持するために使用され、そして3)サルヴィは、液面の直接撮像を可能にする直径2-3ミクロンの開口部である:11のユニークな態様は、以下が挙げられます複数の分析プラットフォーム間でポータブル。11,12

サルヴィは、検出領域及びポリジメチルシロキサン(PDMS)からなるマイクロチャネルとして窒化シリコン(SiN)膜で構成されています。それはfabrですクリーンルーム内でicated、および製造および主要な設計要因は、前の論文や特許に詳述されている。8月12日 TOF-SIMSのアプリケーション分析ツールは、水溶液と、複雑な液体混合物のさまざまな方法を使って実証されたように、いくつかのこれはナノ粒子を含んでいた。13-17具体的には、サルヴィ液体TOF-SIMSは、 その場で凝縮相のための新しい機会を開き、ライブ生物系( すなわち 、バイオフィルム)、単一細胞、および固体-電解質界面の液体-固体界面のプロービングダイナミックできますTOF-SIMSを使用して液体を含む研究。しかし、現在の設計は、まだ気液相互作用を許可していません。これは、将来の発展の方向性です。サルヴィは、初めてこの研究で水和タンパク質膜を研究するために使用されてきました。

フィブロネクチンは、ジスルフィド結合の組によって連結された2つの略同一のモノマーからなる、18れるI一般的に使用されるタンパク質二量体であります細胞に結合する能力についてよく知られているよ。19,20は、それが水和タンパク質フィルムを動的サルヴィ液体TOF-SIMS法を用いて調べることができたことを示すためにモデル系として選択しました。タンパク質溶液をマイクロチャネルに導入しました。 12時間インキュベートした後、水和タンパク質膜のSiN膜の裏面に形成されました。脱イオン(DI)水を、タンパク質導入の後にチャネルを洗い流すために使用しました。情報は、動的TOF-SIMSを用いサルヴィマイクロチャネル内の水和フィブロネクチンタンパク分子から収集しました。 DI水はまた、水和フィブロネクチン薄膜から得られた結果と比較するための対照として調べました。明確な違いは、水和タンパク質フィルムとDI水との間で観察されました。この作業は、液体環境における表面上のタンパク質吸着は、新規サルヴィと液体TOF-SIMS法を用いて研究することができることを示しています。ビデオプロトコルは、興味のある人々のための技術的なガイダンスを提供することを意図していますTOF-SIMSとサルヴィの多様なアプリケーションのためのこの新しい分析ツールを利用することで、不要な液体ハンドリングミスと同様にTOF-SIMSデータ収集と分析を減らします。

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Protocol

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サルヴィマイクロチャネルの1クリーニングと滅菌

  1. サルヴィにおけるマイクロチャンネルの滅菌
    1. 、シリンジに70%エタノール水溶液2mlを描くサルヴィの入口端でシリンジを接続し、ゆっくりと10分間で液を1ml注入。注射の終了時に注射器を取り外します。次に、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)ユニオンを使用してサルヴィの入口と出口を接続します。代わりに、同じ手順を行うためにシリンジポンプを使用しています。たとえば、100μL/分での流速を設定します。
    2. 4時間室温で70%のエタノール溶液で満たされたサルヴィマイクロチャネルを保管してください。
  2. サルヴィに脱イオン(DI)水を導入
    1. 、シリンジに滅菌DI水の2ミリリットルを描くサルヴィの入口で注射器を接続し、ゆっくりと10分内の液体の1ミリリットルを注入。シリンジを取り外し、およびPEEKユニオンを使用してサルヴィの入口と出口を接続します。で述べたように、交互に、シリンジポンプを使用しステップ1.1.1。

サルヴィにおけるタンパク質フィルムの2の固定化

  1. サルヴィにタンパク質フィルムを固定化
    1. ゆっくりと、10分に液体の1ミリリットルを注入シリンジを取り外し、入口を接続し、サルヴィの入口で注射器を接続し、シリンジにフィブロネクチンの2ミリリットル(リン酸緩衝生理食塩水、PBS中10μg/ mlの)ソリューションを描きますそして、PEEKユニオンを使用してサルヴィの出口。
    2. サルヴィをインキュベート12時間室温でフード内で皿を維持し、クリーンな培養皿にフィブロネクチン溶液で満たされました。
    3. シリンジに滅菌DI水の2ミリリットルを描き、サルヴィの入口で注射器を接続します。ゆっくりと、10分間で水1ミリリットルを注入シリンジを取り外し、サルヴィの入口と出口を接続します。
      注意:光顕微鏡を備えた場合は、このSiN膜は、TOF-SIMS分析の前に完全であることを確実にするために、顕微鏡下でサルヴィを確認してください。今サルヴィデバイスがのために準備ができているTOF-SIMSalysis。

3. TOF-SIMSロードロックチャンバ内にサルビをインストールします。

注:サルヴィデバイスを処理し、表面分析の間に潜在的な汚染を避けるために、TOF-SIMSのステージにそれをインストールする際に手袋を常に着用します。

  1. ステージ上にマウントサルビ
    1. 平らで清潔な表面にTOF-SIMSのステージを置きます。上向きにシリコンウェハとSiN膜とステージ上にサルヴィデバイスを置きます。 4金属製のクランプ片を用いサルビを修正し、4本のネジにより金属板にデバイスの角を保持する金属片をねじ込みます。
    2. 静かにマイクロ流体チャネルに接続されたPFTEチューブをロールアップ。硬い部分を長押しする4つの金属片と4本のネジを使用してください。それは分析中に一次イオンビームと干渉しないように、デバイスをSIMSステージ上のオープンスペースに配置されていることを確認します。サルヴィfabricatの追加の画像およびイラストイオンとインストールは、以前の出版物でご利用いただけます。8,9,11
  2. ステージ上にファラデーカップをマウントします
    1. ネジで、ステージ上のファラデーカップを修正しました。
  3. TOF-SIMSロードロックチャンバ内にステージをロード
    1. 、TOF-SIMSのロードロックを開いて保持し、荷台の上に水平にステージを設定し、ロードロックのドアを閉じます。

4. TOF-SIMSデータ集録

  1. (10 -6ミリバールまたはトルのオーダーで、 例えば )真空ポンプの電源をオンにし、適切な真空を確保するためには、ロードロックチャンバに到達します。
  2. 真空は、約30分後に安定化されると、主室にサルヴィを移動します。
    注:真空は、データ取得時のメインチャンバー内の5×10 -6ミリバールの真空よりも低くなければなりません。そうでなければ、より高い真空サルヴィシステムにおける漏れを示します。
  3. でTOF-SIMSの一次イオンビームとアナライザを調整します製造業者の推奨に従って、約400nmの空間分解能。サイクル時間は、DCモードで30マイクロ秒であるが、一次ビームの電流1,200ペンシルバニア。
    注:このプロセスは、主にメーカーの推奨に従っています。
  4. 光学顕微鏡を用いて、マイクロ流体チャネルを探します。基準となる光学像の中心を使用し、二次イオン像の中心と一致するように、それを揃えます。
  5. 各測定の前に、表面汚染を除去するために〜15秒500×500μmの2エリアでのSiNウィンドウにスキャンする1キロ電子ボルトのO 2 +ビーム(〜40 NA)を使用します。また、すべての測定中に表面の帯電を補償するために、電子フラッド銃を使用しています。このステップのデフォルトモードでフラッドガンの自動機能を使用してください。
  6. データ収集の前に正または負のモードを選択します。すべての測定における一次イオンビームとして25 keVのバイ3 +ビームを使用してください。
    注:手順は、同様のFですまたは正と負のデータ取得。スペースの関心については、ポジティブモードは、ここで詳細に説明されています。
    1. デプスプロファイリング
      1. 32ピクセルの解像度によって32ピクセルで〜2ミクロンの直径を有する円形のエリアでのBi 3 +ビームを走査します。
      2. パンチスルーするのSiN膜に必要な時間を最小限に抑えるために、長いパルス幅を使用する( すなわち 、180ナノ秒、100マイクロ秒のサイクルタイムでのビーム電流〜1.0 PA)のBi 3 +ビーム。液面の上昇からの二次イオンを表すの強度は、パンチスルーが達したとき。パンチスルー時間は、このSiN膜のバッチに応じて、300秒から500秒まで変化します。
        注:この違いは、我々の経験に応じて取得したSiN膜のバッチに関連すると思われます。しかし、パンチスルー時間は本当にデータ分析には影響を与えません。
      3. このSiN膜のパンチスルーした後、約200秒で同じ最新の状態に保ちます2D画像再構成のための十分なデータを得ます。
      4. 優れた質量分解能でスペクトルを取得するために、データ収集のために80ナノ秒にパルス幅を減らします。さらに約200秒間、この買収を続けます。 図1に示されたスペクトルデータは、この領域から得られます。
    2. 2Dイメージングおよび質量スペクトル
      1. プロファイリングデータを深さを測定すると同時に、2Dイメージングおよび質量スペクトルデータを収集します。 TOF-SIMSの測定器は、実験中に各スポットのすべての情報を保存します。 ( - スペクトル、FPanel - プロファイルとFPanel - 個別に画像FPanel)デジタル制御ソフトウェアのデータが別のウィンドウに表示されています。慎重にデータ取得時に各パネルのデータを確認してください。

5. TOF-SIMSデータ解析

注:データ解析は、最初IonToF TOF-SIMS楽器ソフトウェアを使用して行われます。

  1. ANを開きます。次いで、SIMS(測定エクスプローラ)とのalysisソフトウェアは、深さプロファイルのm / zスペクトル、及び画像データを処理するために、それぞれ、「プロファイル」、「スペクトル」と「画像」ボタンをクリックします。
  2. 拡張子「.ita」を持っているデータファイルを開きます。
  3. 関心のピークを選択し、「イオン」ボックスに種名を入力し、スペクトルの異なる色でそれらにラベルを付けます。 x軸に沿ってドラッグして、マウスのスクロールホイールを使用してください。ピーク高さと幅を調整するには、Ctrlとスクロールホイールを使用してください。 y軸に沿ってリニアとログモード間の文字「L」スイッチ。
  4. 質量校正前にデータの再構築を行っています。それ以外の場合は、質量較正ステップのピーク間の間隔を選択することは困難です。
    1. 関心の深さプロファイリングデータを選択し、深さプロファイル時系列に従ってスペクトルを再構築します。
    2. 復興ボタンをクリックします。 int型の走査範囲で「スタート復興」ウィンドウで、タイプerest。深さプロファイルデータを再構築するために「OK」をクリックします。
  5. 質量キャリブレーションを実行します。押して「F3」は「質量キャリブレーション」ウィンドウを開きます。 。特定のサンプルに基づいて、本研究では21を校正するためのピークを選択して、CH 3 +(のm / z 15)、H 3 O +(のm / z 19)以下のピークを使用し、C 2 H 5 +(のm / z 29 )、H 5 O 2 +(M / Z 37)、C 3 H 7 +(M / Z 43)、H 7 O 3 +(M / Z 55)、H 9 O 4 +(M / Z 71) H 11 O 5 +(のm / z 99)とポジティブモード用H 13 O 6 +(のm / z 109)。以下のピークCH使用- (のm / z 13)、O - (のm / z 16)、OH - (のm / z 17)、C 2 H - (のm / z 25)、C 3 H - (のm / z 37)、およびC 4 H - (M / Z 49)ネガティブモードで。
    1. ピークを選択し、下向きの矢印は、ウィンドウの左下隅にあるピークに指摘されていることを確認してください。そのピークをクリックして、「質量キャリブレーション」ウィンドウ内のピーク名を入力し、「追加」をクリックし、目的のイオンは、質量キャリブレーションに含まれています。
    2. 最後に、「再校正」ボタンをクリックします。ピークの面積は電荷比、それらの質量に応じて適切な場所にあるかどうかを確認してください。 「スペクトラム」メニューで、選択して行われている特定の分析に応じて、「すべてのスペクトル」または「選択したスペクトル」に「マスキャリブレーションの適用」をクリックします。
  6. ピーク選択は、サンプル分析のために必要であるように、文学や他の以前の知見によれば、試料の特徴的なピークを決定します。 m / zスペクトルにおける関心のピークの強度を比較してください。必要に応じて、ピークリストに無用なピークを新たなピークを追加または削除。
    1. ピークを追加します。左下のウィンドウに赤い線を見つけ、ピークをクリックします。ホルDの "Ctrl"キー、自動的にピークリストにピークを追加してピーク幅を、定義するために水平方向にマウスをスクロールします。ピークを追加するもう1つの方法は、メインスペクトルウィンドウでピークを選択するために、次にウィンドウの上に「ピークを追加」ボタンをクリックすることです。 「スペクトラム」メニューで、追加する多くのピークがある場合は、「検索ピーク」を選択し、必要に応じてその後のピークを追加し、新しく開いたウィンドウに関連する仕様をご確認ください。
    2. ピークリストをエクスポートするには、「ピークリスト」メニューで、「保存... "" itmil」形式のピークリストを選択します。スペクトルに沿ってドラッグするCtrlキーと左ボタンを使用してください。スペクトルウィンドウで、関心のピークを選択し、望ましい位置に2本の破線をドラッグします。
    3. ピークリストをインポートするには、「マス間隔リスト」メニューで、「インポート...」を選択し、ファイル拡張子「.ITPL」で、既存のピークリストファイルを探します。 「開く」をクリックしてください。
    4. で、「itmil「ピークリストを使用するには「マス間隔リスト」メニューには、「開く...」をクリックし、ファイルを検索し、「開く」をクリックします。
  7. さらに、データを分析するために、ピークリストを適用します。 「スペクトル」ウィンドウの左底部には、「マス間隔リスト」と呼ばれるウィンドウがあります。インポートされたピークリストは、ここに示されています。
    1. 、使用されるピークリストファイルを右クリックし、「アクティブスペクトル」または「全てのスペクトル」に適用します。
  8. データプロファイルを表示します。 「プロファイル」ウィンドウで、使用して文字「M」は、y軸に合うようにウィンドウ(フルレンジ)と文字「N」にフィットします。プロファイルの幅を調整するには、Ctrlとスクロールホイールを使用してください。または、「/」を使用し、y軸の範囲と高さを変更するためにキーボード上の「*」。
  9. さらに、初期分析後、他のグラフィックソフトを使用してプロットするためのデータをエクスポートします。
    1. 「ファイル」メニューをクリックし、「プロファイル」ウィンドウで、深さプロファイルをエクスポートするには、「エクスポート&#を選択その後、34 ;,および「.txtの「ファイル」として保存」を選択します。
    2. 、「スペクトル」ウィンドウで、のm / zスペクトルファイルを書き出す「ファイル」メニューをクリックし、次に「エクスポート」を選択し、「.txtの「ファイル」として保存」を選択します。
    3. 「イメージ」ウィンドウ、印刷画面では、画像ファイルをエクスポートし、画像ファイルとして保存します。

6. TOF-SIMSデータプロットとプレゼンテーション

注:SIMSデータは、楽器のソフトウェアを使用して処理された後、データをプロットするグラフィックツールを使用します。

  1. データをインポートするグラフィックツールを使用します。
  2. 再構成されたスペクトルを示すために、y軸とx軸とのピーク強度としてのm / zを使用してプロットをします。例えば1に示されています。
  3. 再構成された深度プロファイル時系列を表示するには、y軸とx軸とのピーク強度として、スパッタ時間を使ってプロットをします。例はFiguに与えられています2再。
  4. 異なるのm / zの再構成された2次元画像を合成し、イオンマッピングを表示するマトリックスを形成します。例が図2に示されています。

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Representative Results

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代表的な結果の対は、提案されたプロトコルの利点を実証するために提示されています。サルヴィマイクロ流体インターフェイスを使用して、一次イオンビーム(BI 3 +)を直接脱イオン水中で水和フィブロネクチンフィルムに衝突することができます。したがって、液体表面の分子の化学的マッピングが正常に取得することができます。

図1aは、それぞれ、水和フィブロネクチン膜とDI水の正のTOF-SIMSのマススペクトルを示す図1b。水クラスター( すなわち 、のm / z 19、37、55、73、91および109)およびアミノ酸断片を含む関心のピーク( すなわち 、のm / z 30、44、61、74、81、83、および98)赤い矢印で示されています。広く乾燥タンパク質サンプルを使用して報告されているアミノ酸断片の特徴的ピークに加えて、水クラスターのピークが観察されますDI水中の水和フィブロネクチンフィルムの質量スペクトル。また、これらの水クラスターピークの強度は、DI水の質量スペクトルのものとは非常に異なっています。この結果は、周囲の表面上での吸着において役割を果たし水和タンパク質分子内部の水分子のプロパティの直接的な証拠を提供します。

図2aは、水和フィブロネクチン膜とDI水の深さプロファイルの時系列を示しています。サンプルはこのSiN膜の下にあるとしてのSiN膜を介してパンチされる前に、選択された第2のイオンの強度は無視できる(すなわち 、フィブロネクチンのための280秒、DI水のための340秒)。このSiN膜を介してパンチされると、これらの二次イオンの強度が著しく増加します。長いパルス幅を使用する場合、質量分解能が比較的低いです。したがって、短いパルス幅プロセスがより良好質量分解能でデータを取得するために使用されます図2aに強調されているように、画像とスペクトルを再構成しました。期間フィブロネクチンおよびDI水を220秒間、すなわち 、60秒)した後、減少したパルス幅は、より良好な質量分解能でのm / zスペクトルを得るために使用されます。最終のm / zスペクトルは、深さプロファイル時系列に緑色の網掛け部分に強調した。 図2bは、 図2aの緑の斜線部分に対応する水和フィブロネクチン膜及びDI水、から2D画像を示している200秒の測定値から再構築しました。これらの2D画像はサンプルから選択された二次イオンの数を表す:二次イオンカウントが高い、画像明るいです。このような直感的な画像は、データ分析に有用である異なるサンプル間の選択された二次イオンの明確な比較を与えます。私たちの経験によると、SiNからパンチスルー時間の差は、バッチからのSiN膜のバッチに変化します。しかし、それは再には影響しません。ダイナミックTOF-SIMS分析のsults。

図1
図1:サルヴィマイクロチャネル内の水和フィブロネクチンフィルムおよびDI水のTOF-SIMSポジティブスペクトルの比較フィブロネクチンの(a)は 、再構築のm / zスペクトル (b)は、DI水スペクトル。

図2
2: 深さプロファイルおよび水和フィブロネクチンおよびDI水の2D画像 (a)のポジティブモードにおけるフィブロネクチンおよびDI水の深さプロファイリング時系列。 (b)は、2D画像は、緑色に対応する再構成された(A)中の深さプロファイルの時系列に沿った200秒の時間セグメントを斜線。水クラスターとの関連性の割合を充電するには、いくつかの特有の質量( 例えば 、のm / z 1、19、37、55)既知のアミノ酸断片に加えて示されている( 例えば 、のm / z 30、83、98)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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サルヴィは、TOF-SIMS、走査型電子顕微鏡(SEM)等の真空ベースの機器によって動的液面と液体 - 固体界面の分析を可能にするマイクロ流体インターフェースです。真空中で液体を直接公開するための小さな開口の使用に、サルヴィは、任意の変更を加えることなく、多くの細く絞った分光法とイメージング技術に適しており、マイクロ流体工学の22移植性と汎用性は、真のマルチモーダルイメージングプラットフォームにします。明確な特徴や他の既存の技術に比べてサルヴィの重要性は、いくつかの最近のレビューにまとめられている。サルビ技術の開発者として22-25、当社グループは積極的に動的な液体表面と液体-固体界面を含む研究のさまざまなに適用されています。新たなアプリケーションのいくつかの例には、哺乳動物の細胞膜、細菌バイオフィルムの付着、水の表面酸化の結果として、15,16またはナノ粒子の形成を含みます。このPAであたりは、私たちは罪の表面に吸着した水和タンパク質薄膜の初期液体TOF-SIMSの結果を提示します。

慎重プロトコルで強調表示のステップを処理することは非常に重要です。手順1と2で注射器に液体を描画するときにたとえば、シリンジ内の気泡がないことを確認してください。気泡が認められた場合に気泡がサルヴィに注入されると、それらは真空中の漏れを誘発する可能性があるため。9はこのように、それは直立シリンジを設定し、静かに気泡を押し出すことにより、それらを取り除くことが賢明です。また、ステップ3で説明した検出領域のこの水平度を直接TOF-SIMSの設計に応じてデータの品質に影響を与えるように、最適化されたTOF-SIMS分析用サルヴィでのSiNウィンドウを平坦にすることが非常に重要である。26また視覚的にSIMSのステージ上にすべてを確保した後、デバイスを検査する必要があります。このSiNウィンドウが水平でない場合は、ネジを調整して高さを変更しますすべてができるだけ同じ平面にあることを確実にするサルヴィ装置の。これらの微妙な点は、全体の実験の成功と信頼性を決定する経験と注意深さが必要です。

図1bに示すように、M / Z 19、37、55、73、91及び109は、高いカウントを有するとピーク。これは、正中(H 11 O 5 +とH 13 O 6 +、H 3 Oの+、H 5 O 2 +、H 7 O 3 +、H 9 O 4 +)水クラスターのかなりの数が存在することを示しています二次イオン。より高いm / z値を有する他の水クラスターは、(データは示さず)、それらの隣接するピークと比較して比較的強いピークを有します。水クラスターのこれらの大量のSiNからパンチスルーした後、DI水の表面から放出されます。ポジティブモードでの水クラスター信号は、前のワットで、観察されていませんORK;これは、二次イオンおよび過去の非最適化、TOF-SIMS条件の低い数に起因した。8継続的な努力により、そのような一次イオンビーム( すなわち 、バイ+ VSとしてサルヴィおよびTOF-SIMS取得条件の最適化。のBi 3 +)、深さプロファイリング時のパルス幅と現在の状況を、この論文で提示条件を用いて、ポジティブモードで44水クラスターまで観察することが可能になりました。ここに示す結果は、様々な生体分子の動態及び生物学的システムにおける水の役割を調査するために有望です。

ここでは、生物学的分子動力学を研究にサルヴィとTOF-SIMSの利点を説明するための一例として、フィブロネクチンタンパク質の水和が発表されました。 m / z 30、44、61、74、81、83、および98のピークは、DIワットのものよりはるかに強いている以前の報告、27,28に記載のアミノ酸断片に属しER 図1bに示されています。フィブロネクチン試料中のアミノ酸断片の増加した強度の差は、これらの二次イオンは、タンパク質自体より確かであることを示唆しています。また、 図1a中の水クラスターのピークは、タンパク質吸着表面及び界面、溶液中の水の分子の特性は、純水のものとは非常に異なる可能性があることを意味し、図1(b)に DI水のものよりもはるかに強いです。

サルヴィマイクロチャネルにおけるフィブロネクチンおよびDI水: 図2aは、二つの異なる試料の代表的な深さプロファイリング時系列を示しています。このSiNウィンドウは長いパルス幅のBi 3 +一次イオンのビームによって衝撃されたように、深さプロファイリングデータを収集しました。 図2aに見られるように、SiNからウィンドウは約300秒でスルー打ち抜きます。サルヴィでのSiNウィンドウがthroug打ち抜かれる前にhは、選択された二次イオンの強度はかなり低いです。このSiNウィンドウを介してパンチされると、液体表面は、一次イオンのビームによって衝撃が開始されるように、二次イオンの強度はすぐに増加します。例えば、H +やHの強度3 O +は、水の表面の観察を示す、大きな増加を示す。8,9強度がパンチスルーまたは界面で後に不安定な権利であるが、それらは比較的安定して到達することができます一定期間後の値( 例えば 、フィブロネクチンのための60秒、 図2aのそれぞれのDI水、220秒)。効果的なのm / zスペクトルは、SiNからパンチスルー後に取得されるので、長いパルス幅掘削の差は本当に、のm / zスペクトルを( 例えば図1)再構築するときに、ここで示した分析結果には影響を与えません。しかし、研究者は、すべてのサンプルのfoに同じ条件を使用することもできますrの一貫性とデータの分析時にデータセクションを選択する際に容易になります。より良好な質量分解能を得るために、パルス幅は、その後減少し、強度がデプスプロファイリング実験の後半部分に応じて減少しました。デプスプロファイルの時系列を連続したm / zスペクトル分析のための十分なデータを提供する別の200秒間集めました。再構築した/ zのスペクトルをmは時間のセグメントは、緑色の網掛け部分で強調表示されます。

フィブロネクチンは、広く細胞培養の前に表面吸着のために使用されています。多くの研究は、フィブロネクチンは、細胞接着および細胞-生体材料相互作用の原因であることを示している。19,20,29最近の研究は、(ヒドロキシエチルメタクリレート)ブラシが偏光解析法を用いてポリ吸着フィブロネクチンの厚さを特徴とします。フィブロネクチン薄膜は3-12 nmの。30このような厚さであることが決定されたことは、水性ソリューにおける深さ方向分析のための合理的でする。サルビの発展に伴い8,9、固体表面上に吸着水和タンパク質の直接分析が可能になりました。このアプローチは、潜在的に動的に固体表面とタンパク質の相互作用を研究する中で幅広い用途を持つことができます。

図2bはそれぞれ、フィブロネクチンおよびDI水のサンプルからの異なる二次イオンの選択された2次元画像を示します。 2D画像は罪の後に液面に対応する図2aの緑の斜線の領域における深さプロファイリング一時的なデータから得られるパンチスルー前述したように。選択されたアミノ酸フラグメント二次イオンCH 4 N +、C 5 H 7 O +の画像およびフィブロネクチン薄膜のためのC 4 H 4 NO 2 +( すなわち 、のm / z 30、83および98)は、それよりもはるかに明るいましたDI水のため。これはアミノ酸断片、二次イオンは、F観察されていることを示し直径2μmの開口内部のフィブロネクチン分子をROM。さらに、フィブロネクチンのいくつかの水クラスターに対応する選択されたピーク例えば、M / Z 1、19、37、及び55)の画像は、DI水よりも著しく明るいです。この結果は、フィブロネクチンの水和は、DI水中の水分子は異なる生体分子を取り囲む水分子を行うことを示しています。

要約すると、この作業は、タンパク質の水和誘起される水の分子特性の変化に印象的な証拠を提供しています。このような結果は、改善された基本的な構造上の理解、コンフォメーション、及び液体の微小環境中の固体表面上に吸着した蛋白質の生物学的活性を提供することができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

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References

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18, (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19, (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29, (6), 061101 (2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5, (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46, (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9, (3), 031101 (2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115, (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26, (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20, (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15, (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5, (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838, (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841, (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31, (5), 050819 (2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115, (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38, (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19, (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. 17-25 (2014).
サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質<em>の</em>その場キャラクタリゼーション<em>で</em>
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Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

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