Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

في الموقع توصيف المطفأ البروتينات في المياه التي SALVI وTOF-سيمز

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

يعرض هذا العمل على بروتوكول للتعامل مع السائل وعينة مقدمة لمتناهية لفي الموقع أيون الثانوية تحليل الطيف الكتلي الوقت من الطيران من الجزيئات الحيوية البروتين في محلول مائي.

Abstract

يوضح هذا العمل في توصيف الموقع من الجزيئات الحيوية البروتين في محلول مائي باستخدام نظام تحليل في واجهة فراغ السائل (SALVI) والوقت من الطيران أيون الثانوية الطيف الكتلي (TOF-سيمز). وقد ثبتوا الفيلم البروتين فبرونيكتين على غشاء نيتريد السيليكون (الخطيئة) التي تشكل منطقة الكشف SALVI. خلال تحليل TOF-سيمز، وأجريت ثلاث طرق التحليل المكاني بما في ذلك ارتفاع مطياف الكتلة قرار، ثنائي الأبعاد (2D) التصوير، والتنميط العمق. تم الحصول على أطياف واسعة في كل من وسائط الإيجابية والسلبية. تم تحليل الماء منزوع الأيونات أيضا عينة مرجعية. نتائجنا تظهر أن الفيلم فبرونيكتين في الماء له قمم مجموعة المياه أكثر وضوحا وأقوى مقارنة الماء وحده. قمم مميزة من شظايا الحمض الأميني أيضا يمكن ملاحظتها في البروتين رطب TOF-سيمز الأطياف. وتوضح هذه النتائج أن جزيء البروتين الامتزاز على سطح يمكن دراسة dynamicaLLY باستخدام SALVI وTOF-سيمز في البيئة السائلة للمرة الأولى.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الماء ضروري لبنية، 1 التشكل و 2 و 3 النشاط البيولوجي للبروتينات. أن البروتينات دون جزيئات الماء المحيطة بهم ليس لديها أنشطة بيولوجية قابلة للحياة. على وجه التحديد، جزيئات الماء تتفاعل مع السطح والهيكل الداخلي للبروتينات، والدول ترطيب مختلفة من البروتينات جعل هذه التفاعلات متميزة. 4 تفاعل البروتينات مع الأسطح الصلبة ظاهرة الأساسية مع الآثار المترتبة في تكنولوجيا النانو، والمواد الحيوية وعمليات هندسة الأنسجة. وقد أشارت دراسات طويلة قد تحدث تغييرات بتكوين كما واجه بروتين السطح. تم تصوره TOF-سيمز كتقنية أن لديه القدرة على دراسة واجهة البروتين الصلبة 5-7 ومن المهم أن نفهم الماء من البروتينات على الأسطح الصلبة، التي يحتمل أن تقدم فهما أساسيا لآلية هيكلها، التشكل، والبيولوجيةالنشاط الله.

ومع ذلك، سطح كبير التقنيات التحليلية هي في معظمها قائم على فراغ والتطبيقات المباشرة للدراسات السائلة المتطايرة من الصعب بسبب التبخر السريع للسيولة متقلبة في ظل بيئة فراغ. قمنا بتطوير فراغ المتوافقة مع واجهة الموائع الدقيقة، نظام تحليل في واجهة السائل فراغ (SALVI)، لتمكين الملاحظة المباشرة للأسطح السائلة والتفاعلات السائل الصلبة استخدام الوقت من الطيران أيون الثانوية الطيف الكتلي (TOF-سيمز). 8- وتشمل 11 والجوانب الفريدة ما يلي: 1) نافذة الكشف فتحة من 2-3 ميكرون في القطر مما يسمح التصوير المباشر من سطح السائل، 2) يستخدم التوتر السطحي لعقد السائل داخل الفتحة، و3) SALVI هو المحمولة بين منصات تحليلية متعددة. 11،12

يتكون SALVI من غشاء نيتريد السيليكون (الخطيئة) كما في منطقة الكشف ومتناهية مصنوعة من (PDMS) ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان. ومن FABRوقد وردت تفاصيل icated في غرفة نظيفة، وتصنيع وتصميم مفتاح العوامل في الأوراق وبراءات الاختراع السابقة. 8-12 وقد أظهر تطبيقات TOF-سيمز كأداة تحليلية باستخدام مجموعة متنوعة من المحاليل المائية ومخاليط سائلة معقدة، بعض الذي تضمن النانوية. 13-17 على وجه التحديد، SALVI السائل TOF-سيمز يسمح ديناميكية تحقق من واجهة السائل الصلبة من الأنظمة الحية البيولوجية (أي الأغشية الحيوية)، والخلايا واحدة، واجهة الصلبة المنحل بالكهرباء، وفتح فرص جديدة للفي مرحلة الوضع الطبيعي المكثف الدراسات بما في ذلك السوائل باستخدام TOF-سيمز. ومع ذلك، فإن التصميم الحالي لا يسمح تفاعلات الغاز السائل حتى الان. هذا هو اتجاه التنمية المستقبلية. وقد استخدم SALVI لدراسة السينما البروتين رطب في هذا العمل للمرة الأولى.

الفيبرونكتين هو ديمر بروتين يستخدم عادة، تتكون من اثنين من أحادية متطابقة تقريبا مرتبطة بواسطة زوج من السندات ثاني كبريتيد، 18 التي طق معروفة لقدرته على ربط الخلايا. 19،20 وتم اختيارها من كنظام نموذج لتوضيح أن الفيلم البروتين رطب يمكن حيوي سبر باستخدام السائل SALVI TOF-سيمز النهج. وقدم الحل البروتين في متناهية. بعد تفرخ لمدة 12 ساعة، وهو فيلم البروتين رطب تشكلت على الجانب الخلفي من غشاء الخطيئة. وقد استخدم منزوع الأيونات الماء (DI) لشطف القناة بعد البروتين المقدمة. تم جمع المعلومات من جزيئات البروتين فبرونيكتين المائية في متناهية SALVI باستخدام ديناميكية TOF-سيمز. ودرس DI المياه أيضا كعنصر تحكم للمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها من رطب رقيقة فبرونيكتين. وقد لوحظت اختلافات واضحة بين الفيلم البروتين المائية والمياه DI. يوضح هذا العمل الذي امتصاص البروتين على سطح في البيئة السائلة يمكن دراستها باستخدام SALVI الرواية والنهج TOF-سيمز السائل. ويهدف البروتوكول الفيديو لتوفير التوجيه الفني بالنسبة للأشخاص الذين يهتمونفي الاستفادة من هذه الأداة التحليلية جديدة لتطبيقات متنوعة من SALVI مع TOF-سيمز والحد من الأخطاء غير الضرورية في التعامل مع السائل وكذلك الحصول على البيانات TOF-سيمز والتحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تنظيف وتعقيم متناهية SALVI

  1. تعقيم متناهية في SALVI
    1. رسم 2 مل من الايثانول 70٪ محلول مائي إلى حقنة، ربط المحاقن مع نهاية مدخل SALVI، وحقن ببطء 1 مل من السائل في 10 دقيقة. إزالة حقنة في نهاية الحقن. بعد ذلك، ربط مدخل ومخرج SALVI باستخدام polyetheretherketone (نظرة خاطفة) ويسترن. بدلا من ذلك، استخدام ضخ حقنة لإجراء نفس الإجراء. على سبيل المثال، تعيين سرعة تدفق في 100 ميكرولتر / دقيقة.
    2. الحفاظ على متناهية SALVI مليئة 70٪ محلول الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعة.
  2. إدخال منزوع الأيونات الماء (DI) إلى SALVI
    1. رسم 2 مل من الماء المعقم DI إلى حقنة، ربط المحاقن مع مدخل SALVI، وحقن ببطء 1 مل من السائل في 10 دقيقة. إزالة المحاقن، وربط مدخل ومخرج SALVI باستخدام اتحاد نظرة خاطفة. بدلا من ذلك، استخدام مضخة الحقن كما ورد فيخطوة 1.1.1.

2. الشلل للفيلم البروتين في SALVI

  1. لشل حركة فيلم البروتين في SALVI
    1. رسم 2 مل من فبرونيكتين (10 ميكروغرام / مل في الفوسفات مخزنة المالحة، PBS) حل في حقنة، ربط المحاقن مع مدخل SALVI، وضخ ببطء 1 مل من السائل في 10 دقيقة، وإزالة حقنة، وربط مدخل ومخرج SALVI يستخدم اتحاد نظرة خاطفة.
    2. احتضان SALVI مليئة الحل فبرونيكتين في طبق ثقافة نظيفة، والحفاظ على طبق في غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
    3. رسم 2 مل من الماء DI تعقيمها في حقنة وتوصيل حقنة مع مدخل SALVI. ببطء حقن 1 مل من الماء في 10 دقيقة، وإزالة حقنة، وربط مدخل ومخرج SALVI.
      ملاحظة: إذا مجهزة المجهر الضوئي، والتحقق من SALVI تحت المجهر للتأكد من أن غشاء الخطيئة هو حالها قبل التحليل TOF-سيمز. الآن الجهاز SALVI جاهز للTOF-سيمز لalysis.

3. تثبيت SALVI في غرفة Loadlock TOF-سيمز

ملاحظة: قفازات يجب أن ترتديه في جميع الأوقات عند التعامل مع الجهاز SALVI وتثبيته على خشبة المسرح TOF-سيمز لتجنب التلوث المحتملة خلال تحليل السطح.

  1. جبل SALVI على خشبة المسرح
    1. وضع المرحلة TOF-سيمز على سطح مستو ونظيفة. وضع الجهاز SALVI على خشبة المسرح مع رقاقة السيليكون وغشاء الخطيئة تواجه التصاعدي. إصلاح SALVI باستخدام أربع قطع معدنية تحامل والمسمار القطع المعدنية عقد الزاوية من الجهاز في لوحة معدنية بواسطة أربعة مسامير.
    2. لفة بلطف صعودا أنابيب PFTE متصلا قناة ميكروفلويديك. استخدام أربع قطع معدنية وأربعة مسامير لعقد الجزء شديدة أسفل. تأكد من أن الجهاز وضع في الفضاء المفتوح على المسرح سيمز بحيث لا تتداخل مع شعاع ايون الأولية أثناء التحليل. صورة إضافية والتوضيح من fabricat SALVIتتوفر في المنشورات السابقة أيون والتركيب. 8،9،11
  2. جبل كأس فاراداي على خشبة المسرح
    1. إصلاح كوب فاراداي على المسرح من قبل المسمار.
  3. تحميل المرحلة في TOF-سيمز غرفة Loadlock
    1. فتح loadlock TOF-سيمز، عقد ومهدت الطريق أفقيا على منصة التحميل، وإغلاق الباب loadlock.

4. الحصول على البيانات TOF-سيمز

  1. بدوره على مضخة فراغ، وضمان فراغ مناسب (على سبيل المثال، بناء على أمر من 10 -6 م بار أو عربة) وصلت في غرفة loadlock.
  2. نقل SALVI في الغرفة الرئيسية بمجرد استقرار فراغ بعد حوالي 30 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن يكون فراغ أقل من 5 × 10 -6 م بار فراغ في القاعة الرئيسية خلال الحصول على البيانات. خلاف ذلك، وارتفاع الفراغ يدل على وجود تسرب في نظام SALVI.
  3. ضبط شعاع ايون الابتدائية ومحلل من TOF-سيمز معالقرار المكانية من حوالي 400 نانومتر وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. تيار شعاع الرئيسي هو 1200 السلطة الفلسطينية في حين أن دورة الزمن هو 30 μsec تحت وضع العاصمة.
    ملاحظة: هذه العملية يتبع إلى حد كبير توصيات الشركة الصانعة.
  4. العثور على قناة ميكروفلويديك باستخدام المجهر الضوئي. استخدام مركز الصورة البصرية كمرجع ومواءمتها لتكون متسقة مع مركز صورة أيون الثانوية.
  5. قبل كل قياس، واستخدام 1 كيلو O 2 + شعاع (~ 40 غ) لمسح على النافذة الخطيئة بمساحة 500 × 500 ميكرون 2 ب ~ 15 ثانية لإزالة التلوث السطح. أيضا، استخدم بندقية الفيضانات الإلكترون لتعويض شحن السطح خلال جميع القياسات. استخدام وظيفة التلقائي للبندقية الفيضانات في الوضع الافتراضي لهذه الخطوة.
  6. تحديد وضع إيجابي أو سلبي قبل الحصول على البيانات. استخدام كيلو بي 3 + شعاع 25 كما شعاع ايون الابتدائية في جميع القياسات.
    ملاحظة: الخطوات هي و مماثلةأو الاستحواذ البيانات الإيجابية والسلبية. لمصلحة من الفضاء، ووصف الوضع الإيجابي في التفاصيل هنا.
    1. عمق التنميط
      1. مسح + شعاع بي 3 على مساحة مستديرة يبلغ قطرها ~ 2 ميكرون مع 32 بكسل بموجب قرار 32 بكسل.
      2. لتقليل الوقت اللازم لكمة من خلال غشاء الخطيئة، استخدم عرض النبض طويلا (أي 180 NSEC، شعاع الحالي ~ 1.0 السلطة الفلسطينية في وقت دورة من 100 μsec) بي 3 + شعاع. شدة من ممثل أيونات الثانوية من زيادة سطح السائل عند الوصول لكمة من خلال. الوقت لكمة من خلال يختلف من 300 ثانية إلى 500 ثانية، اعتمادا على مجموعة من الغشاء الخطيئة.
        ملاحظة: هذا الاختلاف يبدو أن لهما صلة الدفعة الأغشية الخطيئة المكتسبة وفقا لتجربتنا. ومع ذلك، فإن الوقت لكمة من خلال لا يؤثر حقا على تحليل البيانات.
      3. بعد الغشاء الخطيئة لكمة من خلال، والحفاظ على نفس التيار لمدة 200 ثانية لالحصول على بيانات كافية لإعادة بناء صورة 2D.
      4. تقليل عرض النبضة إلى 80 NSEC لجمع البيانات للحصول على الأطياف لقرار جماعي أفضل. تواصل هذه الصفقة حوالي 200 ثانية أخرى. ويتم الحصول على البيانات الطيف هو مبين في الشكل 1 من هذه المنطقة.
    2. 2D التصوير ووسائل الأطياف
      1. جمع التصوير 2D و البيانات أطياف جماعية في نفس الوقت عند قياس البيانات عمق التنميط. الصك TOF-سيمز يحفظ كل المعلومات من كل بقعة خلال التجربة. وتظهر البيانات في النوافذ المختلفة (FPanel - الأطياف، FPanel - لمحات وFPanel - صور حدة) من برنامج التحكم الرقمي. تحقق البيانات في كل لوحة بحكمة خلال الحصول على البيانات.

تحليل 5. TOF-سيمز البيانات

ملاحظة: تحليل البيانات وأداء في البداية باستخدام برنامج IonToF TOF-سيمز فعال.

  1. فتح لبرنامج alysis من سيمز (قياس إكسبلورر) ومن ثم انقر فوق "لمحات"، "أطياف" و "أزرار صورة، على التوالي، لمعالجة صور الأعماق، م / ض الطيف، وبيانات الصورة.
  2. فتح ملفات البيانات التي لها ملحق "ايتا".
  3. اختر قمم المصالح، اكتب اسم الأنواع في مربع "أيون"، وتسمية لهم مع ألوان مختلفة في الأطياف. استخدام عجلة التمرير الماوس لسحب على طول محور س. استخدم Ctrl وعجلة التمرير لضبط مستويات الذروة والاعراض. حرف "L" التبديل بين وسائط الخطية وسجل على طول المحور الصادي.
  4. إجراء إعادة الإعمار البيانات قبل معايرة الكتلة. وإلا، فإنه من الصعب أن تختار التباعد بين قمم في خطوة معايرة الجماعية.
    1. حدد البيانات عمق التنميط من الفائدة وإعادة بناء الأطياف وفقا لعمق الشخصي سلسلة الزمنية.
    2. انقر على زر إعادة الإعمار. في إطار "بدء إعادة الإعمار"، نوع في مجموعة المسح من كثافة العملياتerest. انقر على زر "موافق" لإعادة بناء البيانات الشخصية العمق.
  5. إجراء معايرة الكتلة. اضغط على "F3" لفتح نافذة "معايرة الجماعية". اختيار قمم للمعايرة بناء على عينة محددة. (21) في هذا العمل، استخدام القمم التالية CH 3 + (م / ض 15)، H 3 O + (م / ض 19)، C 2 H 5 + (م / ض 29 )، H 5 O 2 + (م / ض 37)، C 3 H 7 + (م / ض 43)، H 7 O 3 + (م / ض 55)، H 9 O 4 + (م / ض 71)، H 11 O 5 + (م / ض 99) و H 13 O 6 + (م / ض 109) لوضع إيجابي. استخدام القمم CH التالية - (م / ض 13) يا - (م / ض 16)، OH - (م / ض 17)، C 2 H - (م / ض 25)، C 3 H - (م / ض 37)، وC 4 H - (م / ض 49) لوضع سلبي.
    1. حدد الذروة،تأكد من أن السهم نحو الانخفاض وأشار في ذروة في أسفل الزاوية اليسرى من النافذة. فوق هذا الذروة واكتب اسم الذروة في إطار "معايرة الجماعية"، انقر فوق "إضافة"، ويتم تضمين أيون ذات الاهتمام في معايرة الكتلة.
    2. وأخيرا، انقر على زر "إعادة ضبط". تحقق مما إذا مجالات القمم هي في الأماكن الصحيحة وفقا لكتلتها لتوجيه الاتهام النسب. في القائمة "الطيف"، حدد وانقر فوق "تطبيق قداس معايرة" إلى "جميع الأطياف" أو "أطياف مختارة"، اعتمادا على تحليل محدد يجري.
  6. كما أمر ضروري لتحليل عينة الذروة الاختيار، وتحديد القمم مميزة من العينة بالنسبة إلى الأدب أو النتائج السابقة الأخرى. مقارنة كثافة قمم الفائدة في م / ض الأطياف. إذا لزم الأمر، إضافة قمم جديدة أو حذف القمم عديمة الفائدة في قائمة الذروة.
    1. إضافة القمم. انقر على الذروة، والعثور على الخطوط الحمراء في أسفل النافذة نقاط. الحولد على "السيطرة" مفتاح، انتقل الماوس أفقيا لتحديد ذروة العرض، الذي يضيف الذروة إلى قائمة الذروة تلقائيا. وهناك طريقة أخرى لإضافة الذروة هو لتحديد الذروة في إطار الطيف الرئيسي، ومن ثم النقر على زر "إضافة الذروة" فوق النافذة. إذا كان هناك العديد من القمم لإضافة، في القائمة "الطيف"، حدد "قمم البحث"، تحقق المواصفات الخاصة في الإطار الذي افتتح حديثا، ثم يضاف قمم حسب الحاجة.
    2. لتصدير قائمة الذروة، في القائمة "قائمة الذروة"، اختر "حفظ ..." قائمة الذروة في شكل "itmil". استخدام السيطرة والزر الأيسر لسحب على طول الطيف. في الإطار الأطياف، حدد ذروة الفائدة وسحب اثنين من الخطوط المتقطعة في مناصب مرغوب فيه.
    3. لاستيراد قائمة الذروة، في القائمة "قداس قائمة فاصل"، اختر "استيراد ..."، حدد موقع ملف الذروة قائمة موجودة مع ملحق الملف ".ITPL". انقر فوق "فتح".
    4. لاستخدام "itmil" الذروة القائمة، فيفي "قداس قائمة الفاصل الزمني" القائمة، انقر فوق "فتح ..."، والعثور على الملف، ثم انقر فوق "فتح".
  7. تطبيق لائحة الذروة إلى مواصلة تحليل البيانات. في الجزء السفلي الأيمن من نافذة "أطياف"، هناك نافذة تسمى "قداس قائمة الفاصل الزمني". ويرد ذروة قائمة المستوردة هنا.
    1. بزر الماوس الأيمن فوق الملف قمة قائمة لاستخدامها، تطبيقه على "الطيف النشط" أو "كل الأطياف".
  8. الإطلاع على البيانات. في إطار "الملف الشخصي"، استخدم حرف "M" لتناسب إلى نافذة (مجموعة كاملة) وحرف "N" لتتناسب مع المحور الصادي. استخدام Ctrl ومرر عجلة لضبط العرض الجانبي. أو استخدام "/" و "*" على مجلس مفتاح لتغيير نطاق المحور الصادي والارتفاع.
  9. تصدير البيانات لمزيد من التآمر باستخدام برامج الرسم الأخرى بعد التحليل الأولي.
    1. لتصدير صور الأعماق، في إطار "الملف الشخصي"، انقر على القائمة "ملف"، ثم حدد "تصدير & #34 ؛، ثم حدد "حفظ باسم" ملف ". TXT".
    2. لتصدير ملف الطيف م / ض، في إطار "أطياف"، انقر على القائمة "ملف"، ثم حدد "تصدير"، ثم حدد "حفظ باسم" ملف ". TXT".
    3. لتصدير ملف صورة، في "صورة" نافذة، شاشة طباعة وحفظ كملف صورة.

6. TOF-سيمز التآمر البيانات والعرض

ملاحظة: استخدم أداة الرسم لرسم البيانات بعد معالجة البيانات سيمز باستخدام برنامج فعال.

  1. استخدام أداة الرسم لاستيراد البيانات.
  2. جعل مؤامرة باستخدام م / ض باعتبارها محور س وذروة الشدة التي كانت عليها في المحور الصادي لإظهار الطيف أعيد بناؤها. تم اعطاء مثال في الشكل 1.
  3. جعل مؤامرة استخدام الوقت تفل باعتبارها محور س وذروة الشدة التي كانت عليها في المحور الصادي لإظهار أعيد بناؤها الشخصي عمق سلسلة الزمنية. تم اعطاء مثال في فيقوإعادة 2.
  4. الجمع بين الصور 2D أعيد بناؤها من مختلف م / ض وتشكيل مصفوفة لإظهار رسم الخرائط أيون. تم اعطاء مثال في الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم عرض زوجان من نتائج ممثل للتدليل على مزايا البروتوكول المقترح. باستخدام واجهة ميكروفلويديك SALVI، شعاع ايون الابتدائية (بي 3 +) يمكن أن قصف مباشرة على الفيلم الفيبرونكتين المائية في المياه DI. وبالتالي تعيين الكيميائي الجزيئي للسطح السائل يمكن الحصول عليها بنجاح.

الشكل 1A 1B وتظهر TOF-سيمز أطياف الكتلة الإيجابي للفيلم فبرونيكتين وDI الماء رطب، على التوالي. قمم المصالح بما في ذلك مجموعات المياه (أي، م / ض 19، 37، 55، 73، 91 و 109) شظايا والأحماض الأمينية (أي، م / ض 30، 44، 61، 74، 81، 83، و 98) ويتبين من السهام الحمراء. بالإضافة إلى القمم مميزة من شظايا الأحماض الأمينية، والتي تم الإبلاغ عنها على نطاق واسع باستخدام عينات البروتين الجافة، لوحظ القمم تجمعات المياه فيأطياف الشامل للرطب فيلم فبرونيكتين في الماء DI. وعلاوة على ذلك، فإن شدة هذه القمم كتلة الماء هي مختلفة جدا عن تلك الموجودة في أطياف الشامل للمياه DI. توفر هذه النتيجة دليلا مباشرا على ممتلكات جزيئات الماء المحيطة وداخل جزيئات البروتين المائية التي تلعب دورا في امتصاص على السطح.

ويبين الشكل 2A الوقت سلسلة التعريف عمق الفيلم الفيبرونكتين المائية والمياه DI. كما العينة تحت الغشاء الخطيئة، وكثافة الأيونات الثانية المختارة هي ضئيلة قبل كمات الغشاء الخطيئة من خلال (أي 280 ثانية لالفيبرونكتين و 340 ثانية للمياه DI). بمجرد كمات الغشاء الخطيئة من خلال وشدة هذه الأيونات الثانوية زيادة كبيرة. عند استخدام عرض النبضة الطويلة، القرار الشامل منخفض نسبيا. لذلك، يتم استخدام عملية عرض النبضة قصيرة للحصول على بيانات لقرار جماعي أفضلللحصول على صورة والطيف إعادة البناء كما هو مبين في الشكل 2A. بعد فترة من الزمن (أي 60 ثانية لالفيبرونكتين و 220 ثانية للمياه DI)، ويستخدم لتقليل عرض النبضة للحصول على م / ض الأطياف لقرار جماعي أفضل. تم بناؤها م / أطياف ض النهائية من 200 القياسات ثانية أبرزت في المناطق المظللة الخضراء في التشكيل عمق سلسلة الزمنية ويبين الشكل 2B الصور 2D من الفيلم الفيبرونكتين المائية والمياه DI، والتي تتوافق مع المنطقة المظللة الخضراء في الشكل 2A. وتمثل هذه الصور 2D التهم من أيونات ثانوية مختارة من عينة: أكثر إشراقا الصورة، وارتفاع عدد أيون الثانوية. مثل هذه الصور بديهية تعطي المقارنة واضحة من أيونات ثانوية مختارة بين العينات المختلفة، وهو أمر مفيد في تحليل البيانات. وفقا لتجاربنا، والفرق في لكمة من خلال الوقت الخطيئة يختلف من دفعة لدفعة من الأغشية الخطيئة. ومع ذلك، فإنه لا يؤثر على إعادةsults التحليل TOF-سيمز دينامية.

الشكل 1
الشكل 1: المقارنة بين أطياف إيجابي TOF-سيمز للفيلم الفيبرونكتين المائية والمياه DI في متناهية SALVI (أ) أعيد بناؤها م / ض الطيف فبرونيكتين. (ب) الطيف المياه DI.

الشكل 2
الشكل 2: ملامح العمق والصور 2D فبرونيكتين المائية والمياه DI (أ) عمق التنميط الوقت سلسلة من فبرونيكتين والماء DI في وضع إيجابي. (ب) وصور 2D إعادة بنائها الموافق الأخضر مظللة 200 قطاعات وقت ثانية على طول السلاسل الزمنية صور الأعماق في الفقرة (أ). عدة كتلة مميزة لتوجيه الاتهام نسب ذات الصلة عناقيد الماء(على سبيل المثال، م / ض 1، 19، 37، 55) وترد بالإضافة إلى شظايا الحمض الأميني المعروف (على سبيل المثال، م / ض 30، 83، 98). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SALVI هو واجهة ميكروفلويديك الذي يسمح سطح السائل الحيوي وتحليل واجهة السائل الصلبة الصكوك الفراغ القائم، مثل TOF-سيمز والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM). ويرجع ذلك إلى استخدام فتحات صغيرة لفضح السائل مباشرة في فراغ، SALVI مناسبة للكثير من التحليل الطيفي والتصوير تقنيات جيدة التركيز دون أي تعديلات، 22 قابلية وبراعة على microfluidics جعله الحقيقية منصة التصوير المتعدد الوسائط. وتتلخص سمات مميزة وأهمية SALVI مقارنة مع غيرها من التقنيات الموجودة في العديد من الاستعراضات الأخيرة 22-25 والمطور من التكنولوجيا SALVI، مجموعتنا قد تم إسقاطه بنشاط لمجموعة متنوعة من الدراسات التي تنطوي على الأسطح السائل ديناميكية واجهات السائل الصلبة . وتشمل بعض الأمثلة على التطبيقات الجديدة أغشية الخلايا الثديية، والبكتيريا مرفق بيوفيلم، 15،16 أو تشكيل جسيمات متناهية الصغر نتيجة الأكسدة سطح مائي. في هذا سنويافي عرضنا النتائج السائل TOF-سيمز الأولية للرطب البروتين رقيقة كثف على سطح الخطيئة.

ومن الأهمية بمكان تماما على التعامل مع بعناية الخطوات التي أبرزت في البروتوكول. على سبيل المثال، عندما سحب السائل في الحقنة في الخطوات 1 و 2، تأكد من أنه لا توجد أي فقاعات داخل الحقنة. لمرة واحدة يتم حقن فقاعات في SALVI، فإنها قد تحفز تسرب في فراغ. 9 هكذا، إذا لوحظ أي فقاعات، فإنه من الحكمة للتخلص منها عن طريق وضع حقنة تستقيم ودفع بلطف فقاعات. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم جدا لجعل نافذة الخطيئة في SALVI شقة للتحليل TOF-سيمز الأمثل، كما هو موضح في الخطوة 3. هذا الإستواء من منطقة الكشف يؤثر بشكل مباشر على نوعية البيانات وفقا لتصميم TOF-سيمز. 26 و هو ضروري لفحص جهاز بعد تأمين كل شيء على خشبة المسرح سيمز. إذا كان إطار الخطيئة ليس أفقي، وضبط مسامير وتغيير ارتفاعالجهاز SALVI للتأكد من أن كل شيء على نفس الطائرة إلى أقصى حد ممكن. هذه النقاط الحساسة تحتاج خبرة والحذر، التي تحدد النجاح والاعتماد على التجربة برمتها.

كما هو مبين في الشكل 1B، قمم مع م / ض 19، 37، 55، 73، 91 و 109 ديك التهم عالية. وهذا يدل على أن هناك عدد لا بأس به من عناقيد الماء (H 3 O H 5 O 2 H 7 O 3 H 9 O 4 H 11 O 5 + و H 13 O 6 +) في الإيجابية الأيونات الثانوية. لديهم تجمعات المياه الأخرى (لا تظهر البيانات) مع ارتفاع القيم / ض م أيضا قمم قوية نسبيا مقارنة مع القمم المجاورة لها. وتنبعث هذه كميات كبيرة من تجمعات المياه من سطح الماء DI بعد الخطيئة لكمة من خلال. لم تكن إشارات كتلة الماء في وضع إيجابي يمكن ملاحظتها في السابق ثORK. وهذا يعزى إلى التهم منخفضة من أيونات الثانوية وغير المحسنة TOF-سيمز الظروف في الماضي. 8 مع الجهد المستمر في تحسين الظروف اكتساب SALVI وTOF-سيمز مثل شعاع أيون الأساسي (أي بي + مباراة . بي 3 +)، عرض النبض والظروف الراهنة خلال عمق التنميط، فمن الممكن الآن لمراقبة ما يصل الى 44 مجموعات المياه في وضع إيجابي باستخدام الشروط الواردة في هذه الورقة. النتائج المعروضة هنا واعدة لمواصلة التحقيق في دور المياه في ديناميات مختلف الجزيئات البيولوجية والنظم البيولوجية.

هنا كمثال لتوضيح مزايا SALVI وTOF-سيمز في دراسة ديناميكية الجزيئات البيولوجية، تم تقديم الماء من البروتين فبرونيكتين. قمم م / ض 30، 44، 61، 74، 81، 83، و 98 ينتمون إلى شظايا الحمض الأميني وفقا للتقرير السابق، 27،28 والتي هي أقوى بكثير من تلك التي DI واتإيه هو مبين في الشكل 1B. هذا الاختلاف في زيادة كثافة شظايا الحمض الأميني في العينة الفيبرونكتين تشير إلى أن هذه الأيونات الثانوية هي في الواقع من البروتينات أنفسهم. وبالإضافة إلى ذلك، قمم تجمعات المياه في الشكل 1A هي أقوى بكثير من تلك المياه DI في الشكل 1B، مما يعني أن خصائص جزيئات الماء في سطح بروتين الامتزاز وحل بينية يمكن أن تكون مختلفة جدا عن تلك التي في الماء النقي.

ويبين الشكل 2A تمثيلية عمق التنميط سلسلة زمنية من عينتين مختلفتين: فبرونيكتين والماء DI في متناهية SALVI. وقد تم جمع البيانات التنميط عمق كما كان يجري قصف نافذة الخطيئة من قبل + شعاع ايون الابتدائية بي 3 مع عرض النبضة الطويلة. كما رأينا في الشكل 2A، وكمات نافذة الخطيئة من خلال حوالي 300 ثانية. قبل كمات نافذة الخطيئة في SALVI ماراح، وكثافة الأيونات ثانوية مختارة منخفضة جدا. بمجرد كمات نافذة الخطيئة، من خلال كثافة الأيونات الثانوية تزيد على الفور على سطح السائل يبدأ للقصف من قبل شعاع أيون الأساسي. على سبيل المثال، وشدة H + و H 3 O + تظهر زيادة كبيرة، مما يدل على مراقبة سطح الماء. 8،9 وعلى الرغم من شدة هي حق غير مستقر بعد لكمة من خلال أو في واجهة، فإنها قد تصل إلى مستقر نسبيا القيم بعد فترة من الزمن (على سبيل المثال، 60 ثانية لالفيبرونكتين و 220 ثانية لDI المياه، على التوالي، في الشكل 2A). الفرق في المدى الحفر عرض النبضة لا يؤثر حقا نتائج التحليل يتضح هنا عند اعادة م / ض الأطياف (على سبيل المثال، الشكل 1)، ليتم الحصول على م / ض أطياف فعالة بعد الخطيئة لكمة من خلال. ومع ذلك، قد يختار الباحث إلى استخدام نفس الشروط لجميع العينات FOالاتساق ص وسهولة في اختيار مقاطع البيانات خلال تحليل البيانات. من أجل الحصول على قرار جماعي أفضل، وخفضت في وقت لاحق عرض النبض ووانخفضت شدة وفقا لذلك في الجزء الأخير من التجربة عمق التنميط. تم جمع الوقت سلسلة صور الأعماق بشكل مستمر لمدة 200 ثانية أخرى لتوفير البيانات وافرة لم / ض التحليل الطيفي. وسلط الضوء على قطاعات من الوقت تم بناؤها أن م / ض الأطياف في المناطق المظللة بالأخضر.

وقد استخدم على نطاق واسع الفيبرونكتين لامتصاص السطح قبل زراعة الخلية؛ وقد أظهرت العديد من الدراسات الفيبرونكتين هي المسؤولة عن التصاق الخلايا والتفاعلات خلية بيولوجية. تتميز 19،20،29 دراسة حديثة سمك فبرونيكتين كثف على بولي (hydroxylethyl ميتاكريليت) فرش باستخدام قياس إهليلجي. تم تحديد طبقة رقيقة فبرونيكتين أن يكون 3-12 نانومتر سميكة. 30 هذا سمك غير معقول لتحليل عمق التنميط في المحاليل المائيةنشوئها. 8،9 ومع تطور SALVI، التحليل المباشر للبروتين رطب كثف على سطح صلب من الممكن الآن. هذا النهج المحتمل يمكن أن يكون لها تطبيقات واسعة في دراسة التفاعلات بين البروتينات مع الأسطح الصلبة بشكل حيوي.

ويبين الشكل 2B الصور 2D مختارة من أيونات الثانوية المختلفة من عينات فبرونيكتين والماء DI، على التوالي. ويتم الحصول على صور 2D من البيانات الزمنية عمق التنميط في المناطق المظللة الخضراء في الشكل 2A، والتي تتوافق مع سطح السائل بعد الخطيئة لكمة من خلال كما هو موضح سابقا. صور من أيونات ثانوية مختارة الأحماض الأمينية جزء CH 4 N C 5 H 7 O + و C 4 H 4 NO 2 + (أي، م / ض 30 و 83 و 98) وكان للفيلم رقيقة الفيبرونكتين أكثر إشراقا بكثير من تلك للمياه DI. هذا يدل على أن لوحظ أيونات الثانوية الأحماض الأمينية جزء وROM جزيئات الفيبرونكتين داخل فتحة قطرها 2 ميكرون. وعلاوة على ذلك، فإن الصور من قمم مختارة (على سبيل المثال، م / ض 1، 19، 37، و 55) المقابلة لعدة مجموعات المياه من فبرونيكتين أكثر إشراقا بشكل ملحوظ من تلك المياه DI. توضح هذه النتيجة أن الماء من فبرونيكتين يجعل جزيئات الماء المحيطة جزيء حيوي متميز عن جزيئات الماء في الماء DI.

وباختصار، قدمت هذا العمل دليل صارخ على البروتين ترطيب المياه الناجمة عن التعديلات الملكية جزيء. هذه النتائج يمكن أن توفر تحسين فهم أساسي في الهيكل، والتشكل، والنشاط البيولوجي للبروتينات كثف على سطح صلب في المكروية السائلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18, (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19, (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29, (6), 061101 (2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5, (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46, (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9, (3), 031101 (2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115, (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26, (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20, (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15, (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5, (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838, (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841, (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31, (5), 050819 (2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115, (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38, (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19, (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. 17-25 (2014).
<em>في الموقع</em> توصيف المطفأ البروتينات في المياه التي SALVI وTOF-سيمز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter