Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

עבודה זו מציג פרוטוקול טיפול נוזל וההכנסה מדגם על microchannel עבור באתרו זמן של טיסת ניתוח ספקטרומטריית משני יון המוני של ביומולקולות חלבון בתמיסה מימית.

Abstract

עבודה זו ממחישה באפיון באתרו של ביומולקולות חלבון בתמיסה המימית באמצעות מערכת לניתוח בבית ממשק האבק הנוזלי (Salvi) וזמן של הטיסה ספקטרומטריית משני יון המוני (TOF-SIMS). סרט חלבון פיברונקטין מאובן על סיליקון ניטריד (חטא) קרום הנוצר באזור זיהוי Salvi. במהלך ניתוח TOF-SIMS, שלושה מצבים של ניתוח נערכו כולל ספקטרומטריית מסה ברזולוציה מרחבית גבוהה, דו מימדי (2D) הדמיה, ו פרופיל עומק. ספקטרה המונית נרכשה בשני מצבים חיוביים ושליליים. מים ללא יונים נותחו גם כמדגם התייחסות. התוצאות שלנו מראה כי סרט פיברונקטין במים יש יותר פסגות אשכול מים ברורות וחזקות נמשלו למים לבד. פסגות מאפיין של שברי חומצת אמינו ניתנים לצפייה גם בחלבון hydrated ספקטרה TOF-SIMS. תוצאות אלו ממחישות כי ספיחת מולקולת חלבון על משטח ניתן ללמוד דינמיקהlly באמצעות Salvi ו TOF-SIMS בסביבת הנוזל בפעם הראשונה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הידרציה חיוני למבנה, 1 קונפורמציה, 2 והפעילות הביולוגית 3 של חלבונים. חלבונים ללא מולקולות מים המקיף אותם לא יצטרכו פעילויות ביולוגיות קיימא. באופן ספציפי, מולקולות מי אינטראקציה עם פני שטח ואת המבנה הפנימי של חלבונים, ומדינות הידרציה שונות של חלבונים לעשות אינטראקציות כאלה ברורים. 4 האינטראקציה של חלבונים עם משטחים מוצקים היא תופעה בסיסית עם השלכות בננוטכנולוגיה, בביו-חומרים ותהליכי הנדסת רקמות. מחקרים ארוכים הראו כי שינויים מרחביים עלולים להתרחש כחלבון מפגשי משטח. TOF-SIMS כבר שנחזה הטכניקה שיש לו פוטנציאל ללמוד ממשק החלבון-מוצק. 5-7 חשוב להבין את הידרציה של חלבונים על משטחים מוצקים, אשר באופן פוטנציאלי מספק הבנה בסיסית של המנגנון של מבנה שלהם, קונפורמציה, ו ביולוגיפעילות אל.

עם זאת, שיטות אנליטיות פני השטח העיקריים הם בעיקר מבוססי ואקום יישומים ישיר ללימודי נוזל נדיף קשה עקב אידוי מהיר של נוזל נדיף תחת סביבת ואקום. פיתחנו ואקום תואם microfluidic ממשק, מערכת לניתוח בבית ממשק אבק נוזלי (Salvi), כדי לאפשר תצפיות ישירות של משטחים נוזלי אינטראקציות מוצק נוזלי באמצעות ספקטרומטריית מסה זמן של הטיסה משני יון (TOF-SIMS). 8- 11 ההיבטים הייחודיים כוללים את הפעולות הבאות: 1) בחלון הזיהוי צמצם של 2-3 מיקרומטר קוטר המאפשר הדמיה ישירה של פני הנוזל, 2) מתח הפנים משמש להחזיק את הנוזל בתוך הצמצם, ו -3) Salvi הוא נייד בקרב פלטפורמות מרובות אנליטי. 11,12

Salvi מורכב סיליקון ניטריד (חטא) קרום כאזור זיהוי וכן microchannel עשויים polydimethylsiloxane (PDMS). זה fabricated בחדר הנקי, וגורמי הייצור ועיצוב מפתח כבר מפורט ניירות ופטנטים קודמים. 8-12 היישומים של TOF-SIMS ככלי אנליטי הודגמו באמצעות מגוון של תמיסות מימיות ותערובות נוזל מורכבות, חלק שהכיל חלקיקים. 13-17 באופן ספציפי, נוזל Salvi TOF-SIMS מאפשר דינמי חיטוט של הממשק הנוזל-מוצקה של מערכות ביולוגיות חיות (כלומר, biofilms), תאים בודדים, וממשק מוצקים אלקטרוליטים, פתיחת הזדמנויות חדשות עבור בשלב באתרו מרוכז מחקרים כוללים נוזלים באמצעות TOF-SIMS. עם זאת, העיצוב הנוכחי אינו מאפשר אינטראקציות נוזלי גז עדיין. זהו כיוון לפיתוח עתידי. Salvi נעשה שימוש כדי ללמוד את סרט חלבון hydrated בעבודה זו בפעם הראשונה.

פיברונקטין הוא דימר חלבון נפוץ, מורכב משני מונומרים כמעט זהה מקושרים על ידי זוג אג"ח דיסולפיד, 18 אשר אניS-ידוע ביכולתה לאגד תאים. 19,20 נבחר כמערכת מודל כדי להמחיש כי סרט חלבון hydrated יכול להיות נחקר באופן דינמי באמצעות נוזל Salvi TOF-SIMS גישה. פתרון החלבון הוכנס microchannel. לאחר דוגר במשך 12 שעות, סרט חלבון hydrated עטף את הצד האחורי של הממברנה SiN. מים ללא יונים (DI) שימש כדי לשטוף לערוץ לאחר ההקדמה חלבון. מידע נאסף מולקולות חלבון פיברונקטין hydrated ב microchannel Salvi באמצעות TOF-SIMS דינמי. מים די נחקרו גם כביקורת להשוות עם תוצאות שהתקבלו סרט דק hydrated פיברונקטין. הבדלים ברורים נצפו בין סרט חלבון hydrated ומי DI. עבודה זו ממחישה כי חלבון ספיחה על פני שטח בסביבת הנוזלי ניתן ללמוד באמצעות Salvi רומן גישת TOF-SIMS נוזלי. פרוטוקול סרטון נועד לספק הדרכה טכנית עבור אנשים המעונייניםניצול כלי אנליטי חדש ליישומים מגוונים של Salvi עם TOF-SIMS ולהפחית טעויות מיותרות בטיפול נוזלי, כמו גם רכישת וניתוח נתונים TOF-SIMS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ניקוי 1. ועיקור של microchannel Salvi

  1. עיקור של microchannel ב Salvi
    1. צייר 2 מ"ל של תמיסת מימית אתנול 70% לתוך מזרק, חבר את מזרק עם סיום כניסת של Salvi, ולאט לאט להזריק 1 מ"ל של נוזל ב 10 דקות. הסר את המזרק בסוף ההזרקה. לאחר מכן, לחבר את הכניסה והיציאה של Salvi באמצעות איחוד polyetheretherketone (פיק). לחלופין, השתמש משאבת מזרק כדי לנהל אותו הנוהל. לדוגמה, לקבוע את מהירות הזרימה 100 μl / min.
    2. שמור את microchannel Salvi מלאים פתרון אתנול 70% בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות.
  2. הצג Deionized (DI) מים לתוך Salvi
    1. צייר 2 מיליליטר מי DI מעוקר לתוך מזרק, חבר את המזרק עם הכניסה של Salvi, ולאט לאט להזריק 1 מיליליטר של הנוזל ב 10 דקות. הסר את המזרק, ולחבר את הכניסה והיציאה של Salvi באמצעות איחוד צץ. לחלופין, השתמש משאבת מזרק כאמורצעד 1.1.1.

קיבוע 2. של סרט חלבון Salvi

  1. לשתק את סרטי חלבון Salvi
    1. צייר 2 מ"ל של פיברונקטין (10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב בופר פוספט, PBS) פתרון לתוך מזרק, חבר את המזרק עם כניסת של Salvi, לאט להזריק 1 מ"ל של נוזל ב 10 דקות, להסיר את המזרק, ולחבר את כניסת ו לשקע של Salvi באמצעות איחוד צץ.
    2. דגירת Salvi מלא הפתרון פיברונקטין בצלחת תרבות נקיה, לשמור על הצלחת בשכונה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
    3. צייר 2 מיליליטר מי DI מעוקר לתוך מזרק וחבר את המזרק עם הכניסה של Salvi. לאט לאט להזריק 1 מ"ל מים ב 10 דקות, להסיר את המזרק, ולחבר את הכניסה והיציאה של Salvi.
      הערה: אם מצויד מיקרוסקופ אור, לבדוק את Salvi תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את הממברנה SiN הוא תמים לפני ניתוח TOF-SIMS. עכשיו המכשיר Salvi מוכן TOF-SIMSalysis.

3. התקן Salvi לתוך לשכת TOF-SIMS Loadlock

הערה: יש ללבוש כפפות בכל עת במהלך טיפול מכשיר Salvi והתקנתו לבמת TOF-SIMS כדי למנוע זיהומים אפשריים במהלך ניתוח שטח.

  1. הר Salvi לבמה
    1. הנח את הבמה TOF-SIMS על משטח שטוח ונקי. מכניס את מכשיר Salvi לבמה עם פרוסות סיליקון קרום SiN פונים כלפי מעלה. תקן את Salvi באמצעות ארבע חתיכות clamping מתכת לדפוק את חתיכות מתכת מחזיק בפינה של המכשיר לתוך צלחת מתכת ידי ארבעת הברגים.
    2. בעדינות להפשיל צינורות PFTE המחובר לערוץ microfluidic. השתמש ארבעה חתיכות מתכת ארבעה ברגים כדי להחזיק את החלק הנוקשה כלפי מטה. ודא כי מכשיר ממוקם בחלל הפתוח על במת SIMS כך שזה לא יפריע אלומת היונים העיקריות במהלך ניתוח. תמונה ואיור נוסף של fabricat Salviיון והתקנה זמין בפרסומים קודמים. 8,9,11
  2. הר הגביע פאראדיי לבמה
    1. תקן את הכוס פאראדיי על במה על ידי בורג.
  3. טענתי את השלב לתוך TOF-SIMS Loadlock קאמרי
    1. פתח את loadlock TOF-SIMS, להחזיק את הבמה אופקית על משטח הטעינה, ולסגור את הדלת loadlock.

4. TOF-SIMS קליט נתונים

  1. הפעל את משאבת ואקום ולהבטיח ואקום מתאים (למשל, בסדר גודל של 10 -6 mbar או Torr) הוא הגיע בתא loadlock.
  2. הזז את Salvi לתוך אולם ראשי לאחר הוואקום הוא התייצב לאחר כ -30 דקות.
    הערה: ואקום צריך להיות נמוך מ -5 x 10 -6 ואקום mbar בתא הראשי במהלך רכישת נתונים. אחרת, ואקום גבוה מעיד על דליפה במערכת Salvi.
  3. התאם את הקורה מנתח יון העיקרי של TOF-SIMS עםרזולוציה מרחבית של כ 400 ננומטר על פי המלצות היצרן. היו"ר המכהן של קרן העיקרית היא 1,200 הרשות בעוד זמן המחזור הוא 30 μsec תחת מצב DC.
    הערה: תהליך זה כדלקמן המלצות היצרן ברובו.
  4. מצא את הערוץ microfluidic באמצעות מיקרוסקופ אופטי. השתמש במרכז התמונה האופטית כהפניה ויישרת אותו להיות עקבי עם מרכז תמונת יון המשני.
  5. לפני כל מדידה, השתמש קרן + 1 קאב O 2 (~ 40 Na) כדי לסרוק על החלון SiN עם 500 x 500 מיקרומטר 2 שטח עבור ~ 15 שניות כדי להסיר זיהום השטח. כמו כן, השתמש אקדח מבול אלקטרונים לפצות טעינת שטח במהלך כל מדידות. השתמש בפונקציה האוטומטית של אקדח המבול במצב ברירת המחדל עבור שלב זה.
  6. בחר מצב חיובי או שלילי לפני רכישת נתונים. השתמש קורה 25 keV Bi 3 + כמו אלומת היונים העיקריות בכל המידות.
    הערה: השלבים הם f הדומהאו רכישות נתונים חיוביות ושליליות. עבור האינטרס של חלל, במצב החיובי מתואר בפרטים כאן.
    1. פרופיל עומק
      1. סרוק את הקרן + Bi 3 על שטח עגול בקוטר של ~ 2 מיקרומטר עם 32 פיקסלים בהחלטת 32 פיקסלים.
      2. כדי למזער את הזמן הנדרש כדי אגרוף-דרך הממברנה SiN, השתמש ברוחב דופק ארוך (כלומר, 180 NSEC, קרן נוכחית ~ 1.0 רשות בכל פעם מחזור של 100 μsec) Bi 3 + קורה. העוצמות של נציג יונים משני מהגידול פני הנוזל כאשר דרך אגרוף הוא הגיע. השעה אגרוף דרך שונה בין 300 שניות ל -500 שניות, תלוי אצווה של קרום SiN.
        הערה: הבדל זה נראה כקשור האצווה של ממברנות SiN שנרכשו לפי הניסיון שלנו. עם זאת, הפעם האגרוף דרך לא ממש משפיע על ניתוח הנתונים.
      3. לאחר הממברנה SiN אגרוף-דרך, לשמור אותו הנוכחי בערך 200 שניות כדילהשיג מספיק נתונים עבור שחזורי תמונת 2D.
      4. מנמיכים את רוחב הפולס 80 NSEC לאספת נתונים לרכוש ספקטרום עם רזולוציה המוני יותר. המשך רכישה זה בערך עוד 200 שניות. נתוני הספקטרום שמוצגים באיור 1 מתקבלים מהאזור זה.
    2. הדמית 2D and Mass ספקטרה
      1. אסוף את הדמית 2D ונתוני ספקטרה מונית בעת ובעונה אחת כאשר מדידת נתוני יצירת פרופיל עומק. מכשיר TOF-SIMS שומר את כל המידע של כל נקודה ונקודה במהלך הניסוי. הנתונים מוצגים חלונות שונים (FPanel - ספקטרה, FPanel - פרופילים FPanel - תמונות בנפרד) של תוכנות שליטה דיגיטלית. בדוק נתונים בכל פנל בתבונה במהלך רכישת נתונים.

5. ניתוח נתונים TOF-SIMS

הערה: ניתוח נתונים בתחילה בוצעו באמצעות תוכנת אינסטרומנטלי IonToF TOF-SIMS.

  1. פתח אתתוכנת alysis של SIMS (Explorer מדידה) ולאחר מכן לחץ על "הפרופילים", "ספקטרה 'ו' תמונה 'כפתורים, בהתאמה, לעבד פרופיל עומק, ספקטרום m / z, ואת נתוני תמונה.
  2. פתח את קבצי נתונים בעלי סיומת ".ita".
  3. בחר פסגות של עניין, הקלד את שם המין בקופסה "יון", תווית אותם עם צבעים שונים בספקטרום. השתמש בגלגל הגלילה בעכבר כדי לגרור לאורך ציר ה- x. השתמש ב- Ctrl ו בגלגל הגלילה כדי להתאים גבהים שיא ורוחב. מתגים באים "L" בין מצבים לינארית יומן לאורך ציר y.
  4. לנהל שחזור נתונים לפני כיול מסה. אחרת, קשה לבחור את המרווח בין פסגות בשלב כיול ההמונים.
    1. בחר את נתוני יצירת פרופיל עומק עניין ולשחזר את הספקטרום בהתאם לסדרה הזמנית פרופיל העומק.
    2. לחץ על כפתור השחזור. בחלון "שחזור התחל", סוג במגוון סריקה של interest. לחץ "אישור" כדי לשחזר את הנתונים לעומק פרופיל.
  5. בצע כיול המונים. לחץ "F3" כדי לפתוח את החלון "כיול מסה". בחר פסגות לכיול על פי מדגם המבוקש. 21 בעבודה זו, להשתמש הפסגות הבאות CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) ו- H 13 O 6 + (m / z 109) עבור מצב חיובי. השתמש CH פסגות הבאים - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), ו- C 4 H - (m / z 49) עבור מצב שלילי.
    1. בחר לשיא,לוודא כי החץ כלפי מטה הוא הצביע בשיא בפינה השמאלית התחתונה של החלון. לחץ כי שיא הקלד את שם השיא בחלון "כיול מסה", לחץ על "הוסף", ואת יון עניין כלול כיול ההמונים.
    2. לבסוף, לחץ על הכפתור "לכייל". בדקו אם בתחומי פסגות נמצאים במקומות הנכונים על פי המסה שלהם לחייב יחסים. בתפריט "הספקטרום", בחר ולחץ על "כיול המוני החל" כדי "כל ספקטרה" "ספקטרה נבחרת" או, בהתאם לניתוח הספציפי שמתנהל.
  6. כמו בחירת שיא הוא הכרחית ניתוח מדגם, לקבוע פסגות מאפיין של מדגם על פי ספרות או ממצאים קודמים אחרים. השווה את עוצמת פסגות של עניין הספקטרום m / z. במידת הצורך, להוסיף לשיאים חדשים או למחוק פסגות תועלת ברשימת השיא.
    1. הוסף פסגות. לחץ על הפסגה, למצוא את הקווים האדומים ליד חלון השמאלי התחתון. חולד את המקש "Ctrl", עכבר גלילה אופקית כדי להגדיר רוחב שיא, אשר מוסיפים לשיא לרשימת השיא אוטומטי. דרך נוספת להוסיף שיא היא לבחור לשיא בחלון הספקטרום הראשי, ולאחר מכן ללחוץ על כפתור "הוסף שיא" מעל החלון. אם יש הרבה פסגות להוסיף, בתפריט "ספקטרום", בחר "פסגות חיפוש", לבדוק את המפרט הקשור בחלון שנפתח לאחרונה, ולאחר מכן להוסיף פסגות לפי הצורך.
    2. כדי לייצא רשימת שיא, בתפריט "שיא הרשימה", בחר "השמירה בשם ..." רשימת השיא במתכונת "itmil". השתמש Ctrl ו- הלחצן השמאלי כדי לגרור לאורך הספקטרום. בחלון ספקטרה, בחר לשיא של עניין וגרור שני הקווים מהקווקווים לעמדות רצויות.
    3. כדי לייבא רשימת שיא, בתפריט "Mass מרווח הרשימה", לבחור "יבוא ...", אתר קובץ רשימת השיא קיים עם הסיומת הקובץ ".ITPL". לחץ על "פתח".
    4. כדי להשתמש ברשימה "itmil" שיא, ב"רשימת המרווח ההמוני" בתפריט, לחץ על "פתח ...", למצוא את קובץ, ולאחר מכן לחץ על "פתח".
  7. החל רשימת שיא נוסף לנתח נתונים. בחלק הימני התחתון של החלון "ספקטרה", יש חלון בשם "רשימת מרווח המוניים". רשימת השיא המיובאת מוצגת כאן.
    1. לחץ לחיצה ימנית על רשימת הקבצים שיא לשמש, ולהחיל אותו על "ספקטרום הפעיל" או "כל הספקטרום".
  8. הצגת פרופילי הנתונים. בחלון "פרופיל", מכתב השתמש "M" כדי להתאים לחלון (טווח מלא) ואת האות "N" כדי להתאים את ציר y. השתמש ב- Ctrl וגלול גלגל כדי להתאים את רוחב הפרופיל. או תשתמש ב "/" ו- "*" על הלוח המפתח לשינוי בטווח ציר y וגובה.
  9. נתוני יצוא עבור זוממים נוספים באמצעות תוכנה גרפית אחר לאחר הניתוח הראשוני.
    1. כדי לייצא פרופיל עומק, בחלון "פרופיל", לחץ על תפריט "קובץ", ולאחר מכן בחר "ייצוא & #34 ;, ולאחר מכן בחר "שמירה בשם" קובץ ".txt".
    2. כדי לייצא קובץ הספקטרום m / z, בחלון "ספקטרה", לחץ על תפריט "קובץ", ולאחר מכן בחר "ייצוא", ולאחר מכן בחר "שמירה בשם" קובץ ".txt".
    3. כדי לייצא קובץ תמונה, במסך "תמונה" חלון, להדפיס ולשמור כמו קובץ תמונה.

6. TOF-SIMS נתונים שרטוט והצגה

הערה: השתמש בכלי גרפי כדי להתוות את הנתונים לאחר נתוני SIMS מעובדים באמצעות תוכנת אינסטרומנטלי.

  1. השתמש כלי גרפי כדי לייבא את הנתונים.
  2. הפוך מגרש באמצעות m / z כמו ציר x ועוצמת שיא כמו ציר y להראות הקשת המשוחזרת. דוגמה ניתנת באיור 1.
  3. הפוך מגרש באמצעות זמן הגמגום כמו הציר x ועוצמת שיא כמו הציר ה- Y כדי להראות את הסדרה הזמנית פרופיל עומק המשוחזרת. דוגמה לכך היא נתונה figuבתשובה לשאלה 2.
  4. שלב 2 ד תמונות משוחזרות של m / z השונה ויוצר מטריצה ​​להראות מיפוי היון. דוגמה ניתנת באיור 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כמה תוצאות נציג מוצגים כדי להדגים את היתרונות של הפרוטוקול המוצע. באמצעות ממשק microfluidic Salvi, אלומת יונים העיקרי (Bi 3 +) יכול להפציץ ישירות על הסרט פיברונקטין hydrated במים DI. לפיכך המיפוי הכימי המולקולרי של פני הנוזל ניתן לרכוש בהצלחה.

איור 1 א ו -1 B להראות את ספקטרה המונית TOF-SIMS החיובי של מי קולנוע DI פיברונקטין hydrated, בהתאמה. הפסגות של עניין כולל דגימות מי (כלומר, m / z 19, 37, 55, 73, 91 ו -109) ושברי חומצת אמינו (כלומר, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, ו -98) מסומנים על ידי חצים אדומים. בנוסף פסגות המאפיין של שברי חומצת אמינו, אשר דווחו באמצעות דגימות חלבון יבשות נרחב, פסגות דגימות מי הם נצפוספקטרה המונית של סרט פיברונקטין hydrated במי DI. יתר על כן, את העוצמות של פסגות אשכול המים האלה הם מאוד שונים מאלה של ספקטרה ההמונית של מי DI. תוצאה זו מספקת את התיעוד הישיר של הרכוש של מולקולות מים שמסביב ובתוך מולקולות חלבון hydrated כי לשחק תפקיד הספיחה שלהם על משטח.

איור 2 א מראה את סדרת הזמן לעומק פרופיל של סרט פיברונקטין hydrated ומי DI. כפי המדגם הוא תחת קרום SiN, בעוצמות של יונים שניים שנבחרו זניחות לפני הממברנה SiN היא אגרוף הדרך (כלומר, 280 שניות פיברונקטין ו -340 שניות במים DI). לאחר קרום SiN הוא אגרוף דרך, בעוצמות של יונים משני אלה להגדיל באופן משמעותי. בעת שימוש רוחב פולס ארוך, ההחלטה מסה נמוכה באופן יחסי. לכן, תהליך הרוחב פולס קצר משמש להשגת נתונים עם רזולוצית מסה טובהעבור שחזורי דימוי וספקטרום מודגש כמו איור 2 א. לאחר פרק זמן מסוים (כלומר, 60 שניות פיברונקטין ו -220 שניות במים DI), רוחב הפולס מופחת משמש להשגת ספקטרום m / z עם רזולוציה המוני יותר. ספקטרה m / z הסופי שוחזרה מ 200 מדידות שניות מודגשות אזורים מוצלים ירוקים בסדרה הזמנית עומק הפרופיל. האיור 2b מראה את 2 ד תמונות מסרט פיברונקטין hydrated ומי DI, אשר מתאים באזור המוצלל הירוק באיור 2a. תמונות 2D אלה מייצגים את הסעיפים של יונים משני נבחרים מתוך המדגם: הבהירה את התמונה, את ספירת היון מהשנייה גבוהה. תמונות אינטואיטיבי כזה לתת השוואה ברורה של יונים משני שנבחרו בין מדגמים שונים, שהוא מועיל בניתוח נתונים. על פי החוויות שלנו, ההבדל הפעם אגרוף-דרך SiN משתנה בין אצווה אצווה של ממברנות SiN. עם זאת, היא אינה משפיעה מחדשsults של ניתוח TOF-SIMS הדינמי.

איור 1
איור 1: השוואות של ספקטרום החיובי TOF-SIMS של סרט פיברונקטין hydrated ומי DI ב microchannel Salvi (א) ספקטרום m / z המשוחזר של פיברונקטין.. (ב) ספקטרום המים די.

איור 2
איור 2:. פרופילי עומק ותמונות 2D של פיברונקטין hydrated ומי DI (א) סדרות עתיות פרופיל העומק של פיברונקטין ומי DI במצב החיובי. (ב) תמונות 2D המשוחזרים מתאים הירוק מוצל 200 מגזרים שני זמן לאורך סדרת זמן עומק פרופיל (א). מונית מאפיינת כמה לחייב יחסים רלוונטיים לאשכולות מים(למשל, מ '/ z 1, 19, 37, 55) מוצגים בנוסף שברי חומצת אמינו ידועים (למשל, מ' / z 30, 83, 98). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Salvi הוא ממשק microfluidic המאפשר פני הנוזל דינמי וניתוח ממשק נוזל-מוצק על ידי מכשירים מבוססי ואקום, כגון TOF-SIMS במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). בשל השימוש של פתחים קטנים לחשוף נוזל ישירות בריק, Salvi מתאים טכניקות ספקטרוסקופיה ודימות רבות ממוקדות דק ללא כל שינוי; 22 את הטלטלות הצדדיות של מיקרופלואידיקה להפוך אותו פלטפורמת הדמית multimodal נכון. ייחודיויות ומשמעות של Salvi לעומת טכניקות קיימות אחר מסוכמות כמה סקירות אחרונות. 22-25 כמפתח של טכנולוגית Salvi, קבוצה שלנו כבר וליישם אותו באופן פעיל למגוון מחקרים שכללו משטחים נוזלים דינמיים וממשקים מוצקים נוזלים . כמה דוגמאות של יישומים חדשים כוללים קרום תא יונק, מצורף biofilm חיידקים, 15,16 או היווצרות nanoparticle כתוצאת oxidations משטח המימי. ברשות זולכל, אנו מציגים תוצאות TOF-SIMS הנוזלי ראשוניים של הסרט דק חלבון hydrated adsorbed על פני שטח SiN.

זה די קריטי לטפל צעדים הדגישו בזהירות בפרוטוקול. לדוגמא, כאשר ציור הנוזל לתוך מזרק בשלבים 1 ו -2, לוודא שאין בועות כל בתוך המזרק. מכיוון שברגע הבועות מוזרקות לתוך Salvi, הם עלולים לגרום דליפה בריקה. 9 לכן, אם בועות כל הם נצפו, זה נבון להיפטר מהם על ידי הגדיר את המזרק כלפי מעלה בעדינות לדחוף החוצה את הבועות. בנוסף, חשוב מאוד להפוך את חלון חטא Salvi שטוח לניתוח TOF-SIMS אופטימיזציה, כמתואר בשלב 3. levelness זה של אזור זיהוי משפיע ישירות על איכות הנתונים על פי תכנון של TOF-SIMS. 26 זה יש צורך לבדוק את המכשיר לאחר הבטחת הכל חזותית לבמה SIMS. אם חלון SiN אינו אופקי, להתאים את הברגים ולשנות את הגובהשל מכשיר Salvi כדי להבטיח שהכל באותו המטוס ככל האפשר. נקודות עדינות האלה צריכים ניסיון זהירות, אשר קובע את ההצלחה ואמינות של הניסוי כולו.

כפי שמוצג באיור 1b, פסגות עם m / z 19, 37, 55, 73, 91 ויש לי 109 ספירת גבוהה. זה עולה כי ישנם מספר לא מבוטל של דגימות מי (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + ו- H 13 O 6 +) ב חיובי יונים משני. אשכולות המים האחרים (מידע לא מוצג) עם ערכי m / z גבוהים גם פסגות יחסית חזקות לעומת הפסגות השכנות שלהם. כמויות גדולות אלה של דגימות מי נפלטות מפני שטח מי DI לאחר-דרך אגרוף SiN. אותות אשכול מים במצב החיובי לא היו נצפים הקודם work; וזה יוחס ספירות נמוכות של יונים משני ולא מותאם TOF-SIMS התנאים בעבר. 8 במאמץ מתמשך אופטימיזציה של תנאי הרכישה Salvi ו TOF-SIMS כגון אלומת יונים העיקרי (כלומר, Bi + vs . Bi 3 +), רוחב דופק ואת התנאים נוכחיים במהלך פרופיל עומק, ניתן כיום לצפות עד 44 דגימות מי במצב החיובי באמצעות התנאים המוצג במאמר זה. התוצאות המוצגות כאן, אתם מבטיחים להמשיך לחקור את התפקיד של מים בדינמיקה של מולקולות ביולוגיות שונות ומערכות ביולוגיות.

כאן כדוגמה כדי להמחיש את היתרונות של Salvi ו TOF-SIMS בלימוד דינאמיקה מולקולארית ביולוגי, הידרציה של חלבון פיברונקטין הוצג. הפסגות של m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, ו -98 שייכים שברי חומצת אמינו על פי דו"ח הקודם, 27,28 שהם הרבה יותר כבדים מאלה של ואט DIאה שמוצג באיור 1b. זה הבדל בעוצמת המוגברת של שברי חומצת אמינו במדגם פיברונקטין עולה כי יונים משני אלה הם אכן מן החלבונים עצמם. בנוסף, פסגות דגימות מי באיור 1 א הן הרבה יותר חזקות מאלה של מי DI באיור 1b, מה שמרמז על כך את התכונות של מולקולות מים פני חלבון ספיחת פתרון interfacial יכולים להיות שונה מאוד מאלה מים טהורים.

איור 2 א מראה סדרה זמנית פרופיל עומק נציג שני מדגמים שונים: פיברונקטין ומי DI ב microchannel Salvi. נתוני פרופיל העומק נאספו כחלון SiN הופגז על ידי אלומת יוני Bi 3 + העיקריות עם הרוחב פולס הארוך. כפי שניתן לראות באיור 2a, חלון SiN הוא האגרוף דרך בסביבות 300 שניות. לפני חלון חטא Salvi הוא אגרוף through, בעוצמות של יונים משני שנבחרו הם די נמוכים. לאחר חלון SiN הוא האגרוף דרך, העוצמות של היונים משני מייד לגדול ככל פני הנוזל מתחיל להיות מופגז על ידי אלומת היונים העיקריות. לדוגמא, בעוצמות של H + ו- H 3 O + מראים העלייה גדולה, מה שמעיד התצפית של פני מים. 8,9 למרות העוצמות צודקות יציב לאחר האגרוף-דרך או בממשק, הם עשויים להגיע יציב יחסית ערכים לאחר פרק זמן מסוים (למשל, 60 שניות פיברונקטין ו -220 שניות במים DI, בהתאמה, ב איור 2 א). ההבדל בקידוח הרוחב פולס הארוך לא ממש משפיע על תוצאות הניתוח מאוירות כאן כאשר לשחזר ספקטרה m / z (למשל, איור 1), כי ספקטרום m / z היעיל נרכש לאחר-דרך אגרוף SiN. עם זאת, חוקר יכול לבחור להשתמש באותם התנאים עבור כל דגימות FOעקביות r ולהקל בבחירת קטעי נתונים במהלך ניתוח נתונים. על מנת לקבל החלטה המוני יותר, הרוחב הפולס לאחר מכן הופחת ואת העוצמות ירדו בהתאם בחלק האחרון של ניסוי פרופיל עומק. סדרת זמן עומק הפרופיל נאספה ברציפות במשך 200 אחר שניות לספק נתונים נרחבים מ / ניתוח ספקטרלי z. מגזרי הזמן M / ספקטרה z שוחזר מודגש באזורים מוצלים ירוקים.

פיברונקטין כבר בשימוש נרחב עבור ספיחת שטח לפני culturing תא; מחקרים רבים הראו פיברונקטין אחראי הידבקות תא ואינטראקציות ביולוגי תאים. 19,20,29 מחקר שנערך לאחרונה שאפיין את העובי של פיברונקטין adsorbed על פולי מברשות (hydroxylethyl methacrylate) באמצעות ellipsometry. הסרט הדק פיברונקטין היה נחוש בדעתו להיות 3-12 ננומטר עבה. 30 עובי כזה הוא סביר לניתוח פרופיל עומק בתוך solu מימיtion. 8,9 עם התפתחות Salvi, ניתוח ישיר של החלבון hydrated adsorbed על משטח מוצק ניתן כיום. גישה זו באופן פוטנציאלי יכולה להיות יישומים רחבים בחקר האינטראקציות של חלבונים עם משטחים מוצקים באופן דינמי.

איור 2b מראה את 2 ד תמונות נבחרות של יונים משני שונה דגימות פיברונקטין ו DI מים, בהתאמה. תמונות 2D מתקבלות נתונים הזמניים פרופיל עומק באזורים המוצלים ירוקים באיור 2a, אשר תואמים את פני הנוזל לאחר חטא אגרוף-דרך כפי שתואר קודם לכן. התמונות של יונים משני שבר חומצת אמינו שנבחרו CH 4 N +, C 5 H 7 O + ו- C 4 H 4 NO 2 + (כלומר, m / z 30, 83 ו -98) עבור הסרט פיברונקטין רזה הרבה יותר בהירים מאלה עבור מים די. זה מצביע על כך יונים משני שבר חומצות אמינו הם נצפו fROM מולקולות פיברונקטין בתוך הצמצם בקוטר 2 מיקרומטר. יתר על כן, התמונות של פסגות נבחרות (לדוגמא, מ '/ z 1, 19, 37, ו -55) מתאימי דגימות מי מספר של פיברונקטין להפליא בהירים מאלה של מי DI. תוצאה זו ממחישה כי הידרציה של פיברונקטין שהופכת את מולקולות המים המקיפים את biomolecule נבדל מולקולות מים בתוך מי DI.

לסיכום, עבודה זו ספקה ראיות מרשות על שינויי רכוש מולקולת מי הידרציה חלבון מושרה. תוצאות כאלה יכולים לספק הבנה בסיסית משופרת על מבנה, קונפורמציה, והפעילות הביולוגית של החלבונים adsorbed על משטח מוצק במיקרו-סביבה של נוזל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18, (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19, (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29, (6), 061101 (2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5, (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46, (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9, (3), 031101 (2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115, (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26, (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20, (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15, (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5, (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838, (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841, (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31, (5), 050819 (2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115, (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38, (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19, (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. 17-25 (2014).
<em>באפיון באתרו של</em> חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter