Introduction
プロテオミクスの分野では、フィルタ支援試料調製（FASP）が広く、出発材料の量を最小化する試料調製のアーティファクトを減少させる、およびサンプルスループット1を最大化する能力のために採用されています。しかしながら、このような方法は未だ出現し、グライコミクスの分野のための牽引力を獲得しています。高スループットの開発は、定量的なワークフローがあるため生体防御および癌または疾患2,3によってその変調におけるグリコシル化の重要な役割で必要とされています。哺乳類では、N個の -glycansは、コア構造を飾る糖単位（ヘキソース（16進数）、ヘキソサミン（のHexNAc）、シアル酸（NeuAcで）、およびフコース（Fucは））、（16進数3のHexNAc 2）4共有結合した繰り返しで構成されていますアスパラギンへ。異性体がカウントされるときglycospaceがかなり大きいですが（> 10 12）、それは、組成に基づいて非常に小さく、分子量は、典型的には1,000-8,000ダ5 <範囲/ SUP>。クラスの組成均一性およびグリカンの親水性は、精製、分離、および質量分析（MS）ワークフロー6に特有の課題を提起します。
伝統的には、Nの -glycansはF（PNGアーゼF）は、ペプチドのNによるタンパク質またはペプチドから-glycosidase消化され、次いで、ヒドラジドビーズ8によって、レクチンアフィニティークロマトグラフィー7によって濃縮捕捉、または固相抽出（SPE）9,10を介して精製しました。これらの方法は全て非常に有効であるが、これらは、脱塩のための余分な工程を導入し、同時に処理されたサンプルの数を制限します。過去10年間、グライコミクスのためのハイスループットプラットフォームの数が提案されています。 Kim らは、真空操作、SPE 96ウエルプレート11を用いて、半自動化された方法を発表しました。また、アフィニティーフィルター法は、（N -glyco-FASP）をFi接続の初期誘導体化を必要とマン・グループ、によって開発されましたレクチン12の合成とLTER。最後に、トーマス・オーツのグループは、半定量法、glycospace 13の狭い組成サイズを悪用フィルター支援N -Glycan分離（牙）を、提案しました。分子量カットオフフィルターに依存する、小さな汚染物質が第一無駄に洗浄し、次いで、N個の -glycansを消化し 、溶出しました。脱グリコシル化タンパク質は、このプロトコルでフィルター上に残存すると、インラインFASPに供することができます。
エレクトロスプレーイオン化（ESI）MSによる同定およびグリカンの定量化は、異性体および低豊富な種の検出のための誘導体化の（部分的な）解決のためにオフライン分離を必要とします。個性で標識グリカンヒドラジドタグ戦略正規逆相液体クロマトグラフィー（RPLC）14,15との互換性を与えます。 4フェネチル - ベンゾヒドラジド（P2PGN）疎水性タグはENH、グリカンの親水性を仲介します、平均して、4倍の16でイオン化をancing。容易な条件で化学量論的に1：例えば過メチル化17またはアミン反応性タグ付け化学18のような他の技術が、同様の利点を提供するが、ヒドラジド反応において、グリカンは1を反応させます。相対的定量化は、天然の（NAT）または13 C 6安定同位体ラベル（SIL）で誘導体化された試料のタンデム分析によって達成されます。
以下の方法は、正確な相対的定量化のためのP2GPN疎水性タグにプラズマアプリケーションやカップル、それをするための牙を展開します。更に、分析の完全性を損なうことなく、サンプルの単一のアリコートにショットガンプロテオミクス、脱アミド化プロファイル、および定量的グライコミクスを実行するように設計されました。
Protocol
1.タンパク質および糖タンパク質変性およびアルキル化
- 標準製剤、負荷30kDaの上に糖タンパク質（ 例えば 、フェチュインまたはRNアーゼB）の0.1μgの/μlの溶液を2.5μlあるいは10kDaの分子量（MW）カットオフフィルターのため。
- 生物学的血漿サンプルについては、標準的なブラッドフォード19またはビシンコニン酸20（BCA）タンパク質アッセイによってタンパク質濃度を確認してください。必要であれば、mg / mlでの全タンパク質10〜100の間を含むこと〜7のpHでH 2 O（PNGアーゼダイジェストバッファ）に100mMの炭酸水素アンモニウム（NH 4 HCO 3）で、血漿を希釈します。フィルタへの負荷2.5μlの血漿（25-250μgタンパク質）。
注意：このプロトコルは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の存在下で採取した血液サンプルからの血漿で試験されました。
- 生物学的血漿サンプルについては、標準的なブラッドフォード19またはビシンコニン酸20（BCA）タンパク質アッセイによってタンパク質濃度を確認してください。必要であれば、mg / mlでの全タンパク質10〜100の間を含むこと〜7のpHでH 2 O（PNGアーゼダイジェストバッファ）に100mMの炭酸水素アンモニウム（NH 4 HCO 3）で、血漿を希釈します。フィルタへの負荷2.5μlの血漿（25-250μgタンパク質）。
- フィルタ内の各サンプルに1 Mジチオトレイソリューション（DTT）の2μlを添加します。
- 20でサンプルを希釈します0μlのバッファをダイジェストのPNGase。
- フィルタのサンプル管に蓋をし、軽くボルテックス、その座からフィルタを乱さないように注意しながら。タンパク質や糖タンパク質を変性させ、30分間56℃でサンプルをインキュベートします。
- サンプルをアルキル化するために、50μlの1 Mヨードアセトアミドを加える〜200 mMの最終濃度を得るために、60分間37℃でインキュベートします。
注：プロテオミクス分析が望まれていない場合は、ステップ1.5を省略してもよいです。 - 40分間14,000×gでサンプルを遠心分離することにより、フィルター上に変性した糖タンパク質を濃縮します。フロースルー捨てます。
2. Nはグリカン酵素消化を-結合しました
- バッファをダイジェストPNGアーゼ100μlのサンプルを洗ってください。 20分間、14,000×gでフィルタ上に糖タンパク質を濃縮し、通って流れる捨てます。
- フィルタデッドボリューム（〜5マイクロリットル）での濃縮物を得、合計3回、二回洗浄し、濃縮ステップを繰り返します。すべて捨てますフロースルー。
- 洗浄が完了したら、収集バイアルを捨てます。新しいコレクションバイアル内のすべての将来の溶離液や洗浄液を収集します。
注：H 2 18 OバッファダイジェストPNGアーゼは、化学的に脱アミド化になる脱グリコシル化アスパラギン部位の安定同位体標識のためのPNGアーゼF消化工程中に使用されてもよいです。
- 新鮮なコレクションバイアルに移した後、フィルタリングするためにグリセロールフリーのPNGase F（75,000のx単位/ ml）の2μlを添加します。 100μlの総容量をもたらし、PNGアーゼ消化バッファー98μl加えて、穏やかにアップピペットダウンフィルタに混合します。酵素的ステップ2.2.1、2.2.2、または2.2.3での条件の下でグリカンを消化。
注記：タンパク質の脱グリコシル化のための3つの方法が使用されてもよいです。もっぱらグライコミクス解析（なしプロテオミクス）の場合は、ステップ2.2.1で長い潜伏をお勧めします。グライコミクスおよびプロテオミクス研究のために、2.2.2および2.2.3は、最小限の非SPで高品質のペプチドを生成する手順ecific脱アミド。- グライコミクスのみの消化プロトコル（18時間）：酵素的に、すべてのNの -glycansを切断するために18時間、37℃でサンプルをインキュベートします。
- スパイクで消化プロトコル（SPI）：2時間50℃でサンプルをインキュベートします。すぐに作業を、グリセロールフリーのPNGase F（75,000のx単位/ ml）の追加2μlのサンプルやスパイクを削除します。軽く混合するために1-2秒間のサンプルをボルテックス。さらに2時間50℃でサンプルをインキュベートします。
- マイクロ波消化プロトコル（MD）：マイクロチューブフローティングラックに置くサンプル。 1Lのビーカー中のフロート試料を脱イオン（DI）水1リットルを充填しました。回転板付き電子レンジ（950 W）の中央にビーカーを置きます。 5分間、60％の電力（570 W）での電子レンジ。冷却するために、試料を除去し、室温で2分間保持します。次いで、60％のパワーでさらに5分間、マイクロ波。
注：マイクロ波電力設定は、マイクロ波の最大出力電力に基づいて調整される必要があります。平均電力は、モデル間の一定に保持する必要があります。
3.溶出Nの-glycans
- 20℃で20分間、14,000×gでサンプルを遠心分離することによりグリカンを溶出します。
- 20℃で20分間、14,000×gでフィルタや遠心分離機にPNGアーゼ消化緩衝液100μlを追加します。収集し、任意の残りのNを含む洗浄は、溶離液として同じコレクションバイアルに、グリカン-結合しました。二回繰り返します。新しいコレクションバイアルにフィルターと場所を削除します。
- 凍結した（30〜60分）まで-80°Cの冷凍庫でのグリカンのサンプルをインキュベートします。真空濃縮器（4-6時間）で室温で、完了までドライ。
注：N -glycans前誘導体化までの6ヶ月間-20℃で保存することができます。
4.タンパク質FASP消化
注：プロテオミクスまたは脱アミド化部位の解析が望まれていない場合は、プロトコルの第4章をスキップしてもよいです。
- トンをすすぎます彼は8 M尿素緩衝液400μlのと、脱アミド化ペプチドを含む、フィルタ。収集バイアルに蓋をし、軽く混合する渦。 15分間、14,000×gでフィルターに集中しています。すべてのフロースルーを捨てます。
- 3尿素緩衝液洗浄の合計のための手順を繰り返し4.1さらに2回、。
- 2 M尿素、10mMのCaCl 2を400μlの緩衝液（トリプシンバッファーをダイジェスト）で、脱アミド化ペプチドを含む、フィルターを洗浄します。収集バイアルに蓋をし、軽く混合する渦。 15分間、14,000×gでフィルターに集中しています。すべてのフロースルーを捨てます。
- 3トリプシンの合計を繰り返しステップ4.1をさらに2回は、バッファの洗浄を消化します。
- 洗浄が完了したら、収集バイアルを捨てます。新しいコレクションバイアル内のすべての将来の溶離液や洗浄液を収集します。
- 5トリプシン：それぞれのタンパク質（w / w）の検出または定量プロテオミクス実験用比1:50または1で50μlのブタ修正されたトリプシンを追加します。収集バイアルに蓋をし、軽く混合する渦。
- 2時間37℃でサンプルをインキュベートします。すぐに作業を、1：50または1でトリプシンの追加の50μlのサンプルやスパイクを削除：5トリプシン：タンパク質比。軽く混合するために1-2秒間のサンプルをボルテックス。さらに2時間50℃でサンプルをインキュベートします。
- 15分間、14,000×gで回転させることによりペプチドを溶出します。
- 400μlの1％ギ酸および0.001％のZwittergent 3-16（クエンチバッファー）でフィルターから残りのペプチドを洗い流します。 15分間、14,000×gで回転させることにより、フィルタをオフに溶出します。
- ブラッドフォード19またはBCAアッセイ20によって試料中のペプチド濃度を定量します。
- （30〜60分）を凍結するまで℃のフリーザーで-80ペプチドサンプルをインキュベートします。真空濃縮器（4-6時間）で室温で、完了までドライ。
注：乾燥したペプチドは、最大3ヶ月間-20℃で保存することができます。 - 直前LIQUIにトリプシンのタンパク質を再懸濁し2％アセトニトリル、98％のH 2 O、0.1％ギ酸（移動相A）中のdクロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）分析を所望の濃度まで。 300 ngの/μlの - 100から2.5μlの血漿範囲からのトリプシンペプチド濃度。
N 5.誘導体化は、疎水性ヒドラジドタググリカンを-結合しました
- 0.25mg / mlの最終濃度のために、酢酸（誘導体化溶液）：75:25のMeOH 1mlの乾燥重（SIL）または光（NAT）P2GPN試薬を再構成します。試薬は完全に可溶化するために10分かかります。広範囲に完全な可溶化を確実にするためにボルテックス。
注：イベントでは、この誘導体化プロトコルは、標準のN -glycansで使用され、精製されたグリカンに対して、P2GPNのモル比：1：グリカンは、およそ（と劣ら）17以上あってはなりません。 - タグは、SILまたはNAT P2GPN試薬200μlの（50μgの）とNの -glycansを乾燥させました。乾燥したグリカンを再懸濁するために上下にピペット。渦のsaその後mplesとベンチトップ遠心分離機に〜5秒間のサンプルをスピンダウン。
- 56℃で3時間試薬とグリカンを反応させます。
- 直ちに真空コンセントレータにインキュベーターからグリカンを移動します。 55°C（3-5時間）で完了にドライ。
注：この手順は誘導体化反応をクエンチ。サンプルは、後の工程で交差反応を防ぐために、完全に乾燥していなければなりません。
注：乾燥した、タグ付けされたサンプルは、最大6ヶ月間-20℃で保存することができます。 - 再懸 濁直前LC-MS分析にH 2 Oの25-50μlのN個の -glycansをタグ付けしました。 Nの -glycansが完全に可溶化していることを確認するために上下にピペット。
注：再懸濁のボリュームは、出発タンパク質濃度から推定することができる糖タンパク質の開始濃度に依存します。しかし、範囲はサンプルタイプごとに異なりますし、個別に最適化されなければなりません。 - 5分間、14,000×gで遠心分離したサンプル。 supernを削除しますatant、ピペットの先端は遠心管の底に触れないように注意して。
注：過剰タグは目には見えないかもしれないが、遠心分離によって削減されます。 - タンデム分析のための1：1の比率で、相対的な定量化のために必要であれば、NATやSILサンプルのペアを結合します。
6.超高圧液体クロマトグラフィーと質量分析
注：簡単NLC-1000およびQ Exactive高磁場のために説明したLCとMSの条件は、それぞれ、社内のプロテオミクス解析のためおよびグリカン分析21のために最適化しました。これらの条件は、他の超高耐圧またはナノLCシステムなどの高分解能質量分析計に適合させることができるが、若干の変更を必要とし得ます。高分解能質量分析法の使用は、グリカン同定および脱アミド解析22,23のために必要です。
注：手順6.1から6.3をsとすることができます適切な逆相クロマトグラフィーまたは親水性相互作用商業トラップカラムが使用される場合kipped。
- Meiring らトラップとして使用するための24によると、100μMのIDキャピラリーでフリットを合成します。
- 、2.6μMで100オングストローム、C 18梱包材と5cmの長さに切断し、圧力下でのトラップを梱包してください。
- 2.6μM、100Å、C 18充填剤を圧力下で75μMIDエミッタ列をパックし、30cmの長さに切断。
- プロテオミクス（6.4.1）とグライコミクス（6.4.2）のワークフローのための2つの異なるLC-MS法を準備します。
注：タンパク質およびグリカン試料は、任意の順序で同じトラップ/列の設定で実行されてもよいです。- タンパク質分析のために、移動相A（MPA）でカラム上にタンパク質の〜400 ngのを注入します。 1μlのプレカラム平衡化（500バール）及び5μlの分析カラムの平衡化と、 表1によれば、300 NL /分でサンプルを実行します（500バール）。 表2に提供MS条件下でタンパク質をイオン化します。
- グリカン分析のために、再懸濁の5μLを注入し、P2GPNをカラムにNAT / SIL等モルのサンプルをタグ付けしました。 2μlのプレカラム平衡化（500バール）5μlを分析カラムの平衡化（500バール）で、 表3によると、300 NL / minでサンプルを実行します。 表4にMS条件下グリカンをイオン化します。
| 時間 | ％MPA | ％MPB |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 98 | 2 |
| 105 | 80 | 20 |
| 135 | 68 | 32 |
| 136 | 5 | 95 |
| 151 | 5 | 95 |
| 152 | 100 | 0 |
| 167 | 100 | 0 |
プロテオーム解析のために、表1 LC条件。移動相B（MPB、98％アセトニトリル、2％のH 2 O、0.1％ギ酸）を用いた勾配溶出は、ショットガンプロテオミクス、データ依存取得するためのペプチドを溶出するために行きました、MS実験。
| MS 1パラメータ | |
| 質量範囲（TH） | 375-1500 |
| 解決 | 12万 |
| AGC | 1×10 6 |
| 最大イオン化時間 | 30 |
| S-レンズFRレベル | 55 |
| キャピラリーテムP（°C） | 300 |
| 電圧をスプレー | 1.75 |
| MS 2パラメータ | |
| 取得タイプ | TOP20 |
| 解決 | 15,000 |
| AGC | 1×10 5 |
| 最大イオン化時間 | 30 |
| アンダーフィルレシオ | 2％ |
| 分離ウィンドウ（TH） | 1.4 |
| 充電状態の除外 | 1 |
| 正規化衝突エネルギー | 27 |
| 除外時間（s） | 20 |
表2：プロテオーム解析のためのMS条件エレクトロスプレーイオン化のためのパラメータ、MS 1の取得、および高エネルギーdissociatioを使用してオービトラップ機器におけるMS 2買収。n個（HCD）が与えられています。
| 時間 | ％MPA | ％MPB |
| 0 | 95 | 5 |
| 1 | 70 | 30 |
| 41 | 60 | 40 |
| 46 | 37 | 63 |
| 47 | 10 | 90 |
| 55 | 10 | 90 |
| 56 | 95 | 5 |
| 66 | 95 | 5 |
表3：グリカン分析のためのLC条件グラジエント溶出ヒドラジドNは MS分析のためにタグ付けさ-glycans溶出するために行きました。
| MS 1パラメータ | |
| 質量範囲（TH） | 600-1900 |
| 解決 | 60,000 |
| AGC | 5×10 5 |
| 最大イオン化時間 | 64 |
| S-レンズFRレベル | 65 |
| キャピラリー温度（°C） | 325 |
| 電圧をスプレー | 1.75 |
| MS 2パラメータ | |
| 取得タイプ | Top12 |
| 解決 | 15,000 |
| AGC | 5×10 4 |
| 最大イオン化時間 | 100 |
| アンダーフィルレシオ | 1％ |
| 分離ウィンドウ（TH） | 1.4 |
| 固定された第1マス 125 | |
| 段付正規化衝突エネルギー | 10/20/30 |
| 除外時間（秒） | 15 |
表4：ヒドラジドのためのMS条件は、N -glycan分析をタグ付けされたエレクトロスプレーイオン化のためのパラメータ、MS 1の取得、および高エネルギー解離（HCD）を使用してオービトラップ機器におけるMS 2買収が与えられています。
7.プロテオミクス、脱アミド化分析
- 標準のバイオインフォマティクス検索ツールを使用して、タンパク質/ペプチドを同定します。
注：以下の分析プロトコルはUniprotKBにスイス-Protの/ TREMBLデータベースを使用し、プロテオームDiscovererの1.4ソフトウェアでSEQUESTを経由して検索するように設計された、しかし、プロトコルは直接GUIソフトウェアを使用して、任意のタンパク質の検索とスコアリングエンジンに変換することができます。以下に与えられたすべてのコマンドは、ドロップダウンメニューでのソフトウェアインタフェースにアクセスすることができます。- <LI> Apweiler らによって記載されているように、ゲノムデータまたは利用可能なプロテオームデータベースから生物適切なタンパク質配列データベースを作成するか、またはダウンロードしてください。25
注意：一般的なプロテオームデータベースはスイス-Protの、TREMBL、およびNCBIが挙げられるが、これらだけでなく、社内のデータから構築することができます。 - パーキンスらによって記載されているように、ソフトウェアの中で、取得したデータの品質及び所望の検索の硬直性に応じてデータベースの検索エンジンを選択したパラメータを選択します。 MASCOT 26または工学ら SEQUEST 27用のため。
- 高質量精度のデータについては、ソフトウェアでの検索の設定パラメータは、次のように最大2切れ残り、5 ppmの前駆体の質量許容度、および0.02ダフラグメント質量許容値（最適化された正確な脱アミド化検出22用）とを以下のトリプシンペプチドの修飾を含みます：「カルバミドメチル（C）「静的な変更及び「脱アミド（N / Q）」と「牛idation（M）「動的な変更。18 O消化の標識を使用している場合には、含まれる「脱アミド18 O（1）「追加の動的な変更など。
- 探索、タンパク質データベース（7.1.1）に対して選択されたエンジン、生のペプチドのデータを使用。
注：質量公差が使用される機器のための適切かつ任意に低くないでなければなりません。
注：検索機能は、さまざまな検索エンジン特定のアルゴリズムを使用してソフトウェアによって自動的に完了します。パーコレーターアルゴリズム（MASCOT）、SEQUEST、またはアルゴリズムの他の組み合わせは、ペプチドからタンパク質を同定するとヒットの妥当性を獲得するために使用されています。使用可能なツールの詳細については、ゴンザレス-Galarza ら 28,29からのレビューで覆われています。ソフトウェアによって、追加の検索パラメータは、ユーザの判断に応じて選択する必要があるかもしれません。
- マニュアルキュレーションとフュルトのために同定されたペプチドをエクスポートえー分析。
8.グリカン相対定量
注：以下の同定および定量はXCaliburソフトウェアを使用して完成させました。しかし、生のデータを分析し、自動的にクロマトグラフィーピークを統合するソフトウェアは、置換されていてもよいです。
- ヘキソース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、シアル酸の生物学的に可能な組み合わせからグリカン組成物の理論的なリスト、および他のSAを生成しますccharides。この目的のために、人間のグリカンデータベースはウォーカーら 15によって公開されており、そのまま使用してもよいです。理論上のデータベースでは、種特異的な生物学的な制約は、組み合わせた空間に課さなければならず、これらのルールはKronewitter ら 31に記載されています。
- プロトン電荷状態+ 1-3用の各組成物について原子質量からグリカンモノアイソトピック質量（M）を計算します。 NAT（254.14191グラム/モル）またはSIL（260.162042グラム/モル）P2GPNタグの追加を含むようにモノアイソトピック質量を変更します。
- XCaliburにおけるロードマップビューから「処理設定」プログラムを開きます。正確ウォーカーらから補足資料に記載されているように、[M + H] 1+、[M + 2H] 2+のための理論的モノアイソトピック質量を含むステップ8.2で作成したリストを使用して15。処理方法を設定し、[ M + 3H] 3+種。
注：正確超えグリカン同一性を確認するには質量は、NAT用/ SILは、NATとSIL N -glycanペアが同じ保持時間との共溶出することを確認し、実行を二重化しました。定性的には、オキソニウムイオンシリーズ32に属するピークを含んでいなければならない、MS 2スペクトルと識別をクロス検証します。 - 正確ウォーカーらから補足資料に記載されているように、SILとNAT存在量を得るために、Excelに領域を統合、抽出イオンクロマトグラム（XIC）をエクスポートします。15
- Excelでは、プログラムの新しい列のセルは、ウォーカーらによって公表式に従ってSILの豊かさを調整することにより、分子量のオーバーラップのための補正を計算する1 5。：
、
Aは、モノアイソトピックピークと理論的な同位体の重なりがある場合、
、独立して、組成物ごとに計算することができます。 - ウォーカーらが説明したように、第2欄には、プログラム細胞は、スペクトルごとに、合計正規化されたグリカン因子（TGNF）の計算式を使用して、NATとSILのチャンネルを正規化する1 5。：
、
Nは、定量限界上記のN -glycansの数です。 - 2サンプル間の濃度の倍率変化を計算するために、NATグリカン（またはその逆）：新しい列には、プログラム細胞は、SILの比を取ります。
、 
、独立して、組成物ごとに計算することができます。 
、 Representative Results
図1：組み合わせたプロテオミクスとグライコミクス解析のための牙-P2GPN疎水性タグ付け結合された方法（方法A）が与えられたのスキーム手順グリコシル化部位の同定と、グライコミクスのみの処理とタンデムグライコミクスおよびプロテオミクス解析の間で異なる、強調表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
インラインプロテオミクスとグライコミクス、フィルターベースP2GPN疎水性タグ付け方法（方法A）は、プールされた鶏の血漿サンプル（ 図1）を使用して識別、定量化、および分子量のバイアスのために検証されました。もっぱらグライコミクス実験のために、Nの存在量で相互比較は法によって抽出された-glycansSPE（ゴールドスタンダード、方法B）作製した（ 図2）を carbographします。 2つの方法のグリカンの存在量に有意差はなかったです。同様の方法で抽出されたグリカンのNAT比内ばらつきもSILを定量することによって評価しました。両方の方法のログ2 -distributionsはゼロを中心に、ガウスた、と（ 図3A-B）に有意差はなかっ。分子量は、フィルタは、Nは分子量範囲及び親水性（ 図4）に基づいて-glycans区別しなかったことを示唆し、完全に重なった2つのプロトコルの間の範囲です。
図2：NAT およびSIL Nの等モル混合物を、方法AまたはB法により抽出された-glycansは鶏血漿2.5μlのから調製した（N = 4）の試料は肛門ました。各NAT / SILチャネルで、セクション6に各グリカンのための存在量を示唆した推奨パラメータに従ってUPLC-MSによってyzed、分子を補正し、抽出イオンクロマトグラム（MMA = 3 ppm）で下の面積を積分することによって計算されました重量が重なり、TGNFによって調整します。これらの比率は、その標準誤差で示しています。方法Bの存在量：方法A Nの -glycansはた（p> 0.05）で有意差は認められなかった。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3（A）方法A（N = 133）または（B）方法Bにおける内変動性（N = 123）の戦略を比較しました。同じ抽出方式からNの -glycansのNATとSIL等モル混合物で、、3つの技術の反復にわたって分析しました。ログ2 -distributionsは、ゼロを中心と2つのワークフローの間で有意差は認められなかったた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：各戦略からのグリカンの分子量範囲を比較しました。 2つのワークフローは、同じ分子量の範囲に及ぶグリカンを生成した。N -glycans他対1のプロトコルで検出されたばかりの検出（1×10 5豊富）の限界を超えて下落したと系統的なバイアスを反映するものではありません。 拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。
表5）と比較しました。 FASPトリプシン消化物（STDプロトコル）に続いて私たちの典型的な18時間のフィルタベースのPNGase F消化は、glycositesの識別を妨害することができるの非特異的脱アミド化の有意なレベルをもたらしました。従って、高温（50℃）で、より短いインキュベーション時間を利用する方法およびPNGアーゼFのスパイクステップ（SPIプロトコル）は、非最小化するために、マイクロ波消化プロトコル（MDプロトコル）と共に、代替として調査しました。特定の脱アミド。新しい消化法で観察されたグリカンは、標準の18時間からの組成物または存在量における有意差は認められなかった37°CフィルタのPNGase Fダイジェスト（
| タンパク質 | ペプチド | 脱アミド化ペプチド | Glycosites | 糖タンパク質 | |||||||||||||||||||||
| + | - | + | - | + | - | + | - | + | - | ||||||||||||||||
| FASP | 3083 | 795 | 5 | 5 | |||||||||||||||||||||
| 18時間 | 217 | 304 | 6013 | 5086 | 1029 | 733 | 257 | 24 | 112 | 18 | |||||||||||||||
| MD | 270 | 266 | 5190 | 5125 | 465 | 455 | 254 | 8 | 102 | 7 | |||||||||||||||
| SPI | 281 | 288 | 4729 | 4482 | 602 | 573 | 232 | 10 | 145 | 8 | |||||||||||||||
表5： 標準トリプシンからのプロテオームデータの比較のインライン牙-P2GPNタギング法に対するダイジェストが行われた準備が（+）とし、せずに行った-非特 異的脱アミド化および推定の背景率を決定するために、PNGアーゼF（）。偽陽性率をglycosite。タンパク質は、1％の偽発見率（FDR）で同定されました。ペプチドは、プロテオームのDiscoverer 1.4（Q <0.01）で「高」ペプチドの信頼に基づいて、濾過しました。 glycositesはidentifiました保存されたグリコシル化モチーフ（NXS / T）の脱アミド化を含むユニークな配列に基づいてED。および糖タンパク質は、少なくとも1つの識別glycositeを含む同定されたタンパク質として定義されていました。
図5：グリカンのための短縮プロトコルは、試料中の脱アミノ化を最小限に抑えるために開発され、18時間牙のPNGase F消化物と比較しました。存在量の平均の差は10％とそれぞれMD（2.2.3）およびSPI（2.2.2）プロトコル、5％でした。同定された48グ リカンのうち、90％未満1.5倍の変化を示した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid (50%) | Sigma Aldrich | 45754 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916 | Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1) |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable |
| DL-Dithiothreitol, 1 M in solution | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Easy-nLC 1000 | Thermo Scientific | LC120 | Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters). |
| Floating Tube Rack | TedPella | 20831-20 | |
| Fetuin | New England Biolabs | P6042S | |
| Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens | Fisher Scientific | 11-690-625F | Alternate incubators that reach 56 °C are suitable |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| GE Microwave Oven | General Electric | 57B5 E82904 | Any microwave with adjustable power settings is suitable |
| INLIGHT Glycan Tagging Kit | Cambridge Isotope Laboratories | GTK-1000 | The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent. |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | A3221 | |
| Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase | Phenomenex | Bulk Media | Alternative: Any C18 stationary phase 5 mM |
| Mascot Daemon Software and Server | Matrix Science | Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific) | |
| Methanol, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| PicoFrit Self-Pack Column: 360 μm, OD 75 μm ID, 15 μm tip, non-coated, 5 per box, 50 cm | New Objective | 1 5 PF360-75-15-N-5 | |
| PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml | New England BioLabs | P0705L | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Alternate high mass accuracy (5 ppm) mass spectrometers will provide similar data | |
| RNase B | New England Biolabs | P7817S | |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma Aldrich | T6567-5X | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | Alternate vacuum concentrators are suitable |
| Vivacon 500 30 kDa Filters | Sartorius Stedim Biotech | VN01H22 | Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096) |
| Water, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Water, 18O | Cambridge Isotope Laboratories | OLM-240-97-1 | The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence |
| Xcalibur 2.0 | Thermo Scientific | XCALIBUR20 | |
| Zwittergent Test Kit | Merck Millipore | 693030 |
References
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
- Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
- Roseman, S.
- Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
- Zaia, J.
- Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
- Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
- Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
- Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
- Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
- Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
- Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
- Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
- Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
- Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
- Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
- Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al.
- Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
- Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
- Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
- Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
- Apweiler, R., et al.
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
- Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
- Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
- Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
- Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
- Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).
