Introduction
När det gäller proteomik, har förberedelserna filter stödd prov (FASP) fått stor spridning för sin förmåga att minimera mängden utgångsmaterial, minska provberednings artefakter, och maximera provkapacitet 1. Emellertid har en sådan metod ännu inte dyka och få dragkraft för området glycomics. Utveckling av hög genomströmning, är kvantitativa arbetsflöden behövs på grund av den integrerade roll glykosylering i biologiska försvar och dess modulering av cancer eller sjukdomar 2,3. Hos däggdjur är N-glykaner består av upprepande sackaridenheter (hexoser (Hex), hexosaminer (HexNac), sialinsyror (NeuAc), och fucoses (Fuc)), som pryder en kärnstruktur (Hex 3 HexNac 2) 4 kovalent bunden till asparagin. Även om glycospace är avsevärt stor när isomerer räknas (> 10 12), är det ganska små på en komposition basis och molekylvikter sträcker sig typiskt från 1,000-8,000 Da 5 </ Sup>. Kompositions homogenitet klassen och hydrofilicitet glykaner utgör unika utmaningar för rening, separation, och masspektrometri (MS) arbetsflöden 6.
Traditionellt är N-glykaner diger från proteiner eller peptider genom peptid- N -glycosidase F (PNGase F) och sedan berikas av lektin affmitetskromatografi 7, fångas upp av hydrazid pärlor 8, eller renas via fastfasextraktion (SPE) 9,10. Även om dessa metoder är alla mycket effektiva, de införa extra steg för avsaltning och begränsa antalet prover samtidigt bearbetas. Under det senaste årtiondet har ett antal av hög genomströmning plattformar för glycomics föreslagits. Kim m.fl.. Publicerat en semi-automatisk metod med användning av en vakuumdrivet SPE 96-brunnsplatta 11. Alternativt, var en affinitetsfiltermetoden (N -glyco-FASP) som utvecklats av Mann-gruppen, som krävde den inledande derivatisering av filter med en blandning av lektiner 12. Slutligen föreslog Thomas-Oates gruppen en semi-kvantitativ metod, Filter Aided N-glykan separation (HUGGTÄNDER), som utnyttjade den snäv kompositions storleken på glycospace 13. Att förlita sig på molekylvikt cut-off-filter, var små föroreningar tvättas först att slösa och sedan N-glykaner bröts ned och eluerades. Deglykosylerade proteiner kvar på filtret i detta protokoll och kan utsättas för in-line FASP.
Identifiering och kvantifiering av glykaner av elektro (ESI) MS kräver off-line separationer för (delvis) upplösning av isomerer och derivatisering för detektering av låg rikliga arter. Märkning i egenart när normalisera med glykan hydrazid tags strategi ger kompatibilitet med omvänd fas vätskekromatografi (RPLC) 14,15. Den 4-fenetyl-bensohydrazid (P2PGN) hydrofob tagg medierar hydrofiliciteten hos de glykaner, enhnansiering jonisering av, i genomsnitt, fyra gånger 16. Även om andra tekniker, såsom permetylering 17 eller aminreaktiv märkning kemier 18, erbjuder liknande fördelar, i hydrazid reaktionen, är glykaner reageras 1: 1 stökiometriskt i facile förhållanden. Relativ kvantifiering uppnås genom tandem analys av prover derivatiserade med infödda (NAT) eller 13 C 6 stabil isotopetiketter (SIL).
Följande metod utvecklas HUGGTÄNDER för plasmaapplikationer och par det till P2GPN hydrofoba tagg för exakt relativ kvantifiering. Dessutom hade utformats för att utföra skott-gun proteomik, deamidering profilering, och kvantitativa glycomics på en enda portion av provet, utan att äventyra integriteten av analyserna.
Protocol
1. Protein och glykoprotein denaturering och alkylering
- För standardberedningar, belastning 2,5 pl av en 0,1 mikrogram / l lösning av glykoprotein (t.ex. Fetuin eller RNas B) på en 30 kDa eller 10 kDa molekylvikt (MW) cut-off-filter.
- För biologiska plasmaprover, kontrollera proteinkoncentrationen genom en standard Bradford 19 eller bicinkoninsyra 20 (BCA) proteinanalys. Späd plasma, om så är nödvändigt, med 100 mM ammoniumbikarbonat (NH 4 HCO 3) i H2O (PNGas Digest Buffer) vid ett pH av ~ 7 för att innehålla mellan 10 till 100 mg / ml totalt protein. Belastning 2,5 pl plasma (25-250 ng protein) på ett filter.
Obs: Detta protokoll har endast testats på plasma från blodprover som samlats i närvaro av etylendiamintetraättiksyra (EDTA).
- För biologiska plasmaprover, kontrollera proteinkoncentrationen genom en standard Bradford 19 eller bicinkoninsyra 20 (BCA) proteinanalys. Späd plasma, om så är nödvändigt, med 100 mM ammoniumbikarbonat (NH 4 HCO 3) i H2O (PNGas Digest Buffer) vid ett pH av ~ 7 för att innehålla mellan 10 till 100 mg / ml totalt protein. Belastning 2,5 pl plasma (25-250 ng protein) på ett filter.
- Tillsätt 2 pl av en M ditiotreitol Solution (DTT) till varje prov i filtret.
- Späd provet med 200 il PNGas smälta buffert.
- Cap filterprovröret och lätt virvel, försiktigt så att inte störa filtret från sitt säte. Inkubera provet vid 56 ° C i 30 min för att denaturera proteinerna och glykoproteiner.
- Att alkylera proven, tillsätt 50 | il 1 M jodacetamid, för att ge en slutlig koncentration av ~ 200 mM, och inkubera vid 37 ° C under 60 min.
OBS: Om proteomik analys inte önskas kan steg 1,5 hoppas över. - Koncentrera det denaturerade glykoproteinet på filtret genom att centrifugera proverna vid 14000 x g under 40 min. Kassera flöda igenom.
2. N-kopplade glykan enzymatisk uppslutning
- Tvätta provet med 100 pl PNGas smälta buffert. Koncentrera glykoproteinet på filtret vid 14.000 xg i 20 min och kasta flöda igenom.
- Upprepa tvätta och koncentratet steg två gånger, för totalt tre gånger, vilket gav ett koncentrat i filter dödvolym (~ 5 | il). Kasta allaflöda genom.
- Släng uppsamlingskärl gång tvättar är klar. Samla alla framtida eluenter och tvättar i en ny uppsamlingskärl.
OBS: PNGas smälta buffert i H 2 18 O kan användas under den PNGas F uppslutningssteget för stabil isotop märkning av de-glykosylerad asparagin ställen, som blir kemiskt deamiderat.
- Tillsätt 2 pl glycerol fritt PNGas F (75.000 x enheter / ml) för att filtrera efter överföring till ett nytt uppsamlingskärl. Lägg 98 pl PNGas smälta buffert, vilket den totala volymen till 100 pl, och försiktigt pipettera upp och ned på filtret för att blanda. Enzymatiskt smälta glykaner enligt villkoren i steg 2.2.1, 2.2.2, OR 2.2.3.
NOTERA: Tre metoder för deglykosylering av proteiner kan användas. För enbart glycomics analys (inga proteomik), är den långa inkubationen i steg 2.2.1 rekommenderas. För glycomics och proteomik forskning, steg 2.2.2 och 2.2.3 kommer att producera högkvalitativa peptider med minimal icke-specific deamidering.- Glycomics endast för matsmältning protokoll (18 timmar): Inkubera proverna vid 37 ° C under 18 timmar för att enzymatiskt klyva alla N-glykaner.
- Spike-i matsmältningen protokollet (SPI): Inkubera proverna vid 50 ° C under 2 h. Arbeta snabbt, avlägsna prover och pigg i en ytterligare 2 | il av glycerol-free PNGas F (75.000 x enheter / ml). Lätt virvel proverna för 1-2 sekunder för att blanda. Inkubera proverna vid 50 ° C under ytterligare 2 h.
- Mikrovågsnedbrytning protokoll (MD): Placera prover i ett mikrocentrifugrör flytande rack. Float prov i en 1 L bägare fylld med en liter avjoniserat (DI) vatten. Placera bägaren i centrum av en mikrovågsugn (950 W) med en roterande platta. Mikrovågsugn vid 60% effekt (570 W) under 5 min. Svalna, ta prover och håll vid rumstemperatur under 2 min. Sedan mikrovågsugn för en ytterligare 5 min vid 60% effekt.
OBS: Microwave effektinställningar kommer att behöva justeras baserat på den maximala uteffekten i mikrovågsugn.Medeleffekt bör hållas konstant mellan modeller.
3. Eluering av N-glykaner
- Eluera glykaner genom centrifugering av provet vid 14000 xg under 20 min vid 20 ° C.
- Tillsätt 100 pl av PNGas smälta buffert till filtret och centrifugera vid 14.000 xg under 20 min vid 20 ° C. Samla tvätta innehåller eventuellt kvarvarande N-kopplade glykan, i samma uppsamlingsflaska som elueringsmedel. Upprepa två gånger. Ta bort filtret och placera i ett nytt uppsamlingskärl.
- Inkubera glykan prov i -80 ° C frys tills fryst (30-60 min). Torr till fullständighet, vid rumstemperatur, i vakuumkoncentrator (4-6 h).
OBS: N-glykaner kan förvaras vid -20 ° C i upp till sex månader före derivatisering.
4. Protein FASP Digestion
OBS: Om proteomik eller deamidering webbplats analys inte är önskvärd, kan avsnitt 4 i protokollet över.
- Skölj than filter, som innehåller de deamiderade peptider med 400 pl av 8 M urea buffert. Förslut flaskan insamling och lätt virvel att blanda. Koncentrera dig på filtret vid 14.000 xg under 15 minuter. Kasta alla genomströmning.
- Upprepa steg 4,1 ytterligare två gånger, för totalt tre urea bufferttvättar.
- Skölj filtret, som innehåller de deamiderade peptider med 400 pl 2 M urea, 10 mM CaCl2 buffert (trypsin smälta buffert). Förslut flaskan insamling och lätt virvel att blanda. Koncentrera dig på filtret vid 14.000 xg under 15 minuter. Kasta alla genomströmning.
- Upprepa steg 4,1 ytterligare två gånger, för totalt tre trypsin smälta buffert tvättar.
- Släng uppsamlingskärl gång tvättar är klar. Samla alla framtida eluenter och tvättar i en ny uppsamlingskärl.
- Tillsätt 50 | il svin-modifierad trypsin i en 1:50 eller 1: 5 trypsin: protein (vikt / vikt) förhållande för upptäckt eller kvantitativa proteomik experiment, respektive.Förslut flaskan insamling och lätt virvel att blanda.
- Inkubera proverna vid 37 ° C under 2 h. Arbeta snabbt, ta prover och spik i ytterligare 50 pl trypsin vid 1:50 eller 1: 5 trypsin: protein-förhållande. Lätt virvel proverna för 1-2 sekunder för att blanda. Inkubera proverna vid 50 ° C under ytterligare 2 h.
- Eluera peptiderna genom spinning vid 14000 x g i 15 min.
- Skölj de återstående peptiderna från filtret med 400 | j, l 1% myrsyra och 0,001% Zwittergent 3-16 (quench buffert). Eluera bort filtret genom spinning vid 14000 x g i 15 min.
- Kvantifiera peptidkoncentrationen i proverna från Bradford 19 eller BCA-analys 20.
- Inkubera peptidprover i -80 ° C frys tills fryst (30-60 min). Torr till fullständighet, vid rumstemperatur, i vakuumkoncentrator (4-6 h).
NOT: Torkade peptider kan förvaras vid -20 ° C i upp till tre månader. - Resuspendera tryptiska proteiner strax före Liquid-grafi-masspektrometri (LC-MS) analys i 2% acetonitril, 98% H2O, och 0,1% myrsyra (mobil fas A) till önskad koncentration. Tryptiska peptidkoncentrationer från 2,5 pl plasma intervallet 100-300 ng / l.
5. Derivatisering av N-kopplade glykaner med Hydrofoba hydrazid Taggar
- Rekonstituera torkade tunga (SIL) eller ljus (NAT) P2GPN reagens i 1 ml 75:25 MeOH: ättiksyra (Derivatisering lösning), för en slutlig koncentration av 0,25 mg / ml. Reagens kan ta upp till 10 minuter för att helt lösa. Utför vortex för säkerställande av fullständig solubilisering.
Obs: Vid denna derivatisering protokoll används med standard N-glykaner, jämfört renade glykaner, molförhållandet P2GPN: glykan bör vara ungefär (eller mindre) än 17: 1. - Tag torkad N-glykaner med 200 pl (50 ng) av SIL eller NAT P2GPN reagens. Pipett upp och ner för att resuspendera torkade glykaner. virvel samples och sedan spinn ner prover för ~ 5 sek på en bänkcentrifug.
- Reagera glykanema med reagenset under 3 h vid 56 ° C.
- Omedelbart flytta glykaner från inkubatorn till vakuumanrikningsverk. Torr till fullbordan vid 55 ° C (5/3 h).
OBS: Detta steg släcker derivatiseringsreaktion; provet måste vara helt torr för att förhindra korsreaktivitet i de efterföljande stegen.
OBS: Torkade, etikette prover kan förvaras vid -20 ° C i upp till sex månader. - Resuspendera tagged N-glykaner i 25-50 | il av H2O just före LC-MS-analys. Pipett upp och ner för att säkerställa N-glykaner är helt upplöst.
OBS! Volym för återsuspension är beroende av utgångskoncentrationen av glykoprotein, som kan uppskattas från startproteinkoncentrationen. Dock kommer området att variera per provtyp och bör individuellt optimeras. - Centrifugera proverna vid 14.000 xg under 5 min. Ta bort supernatant, var noga med att inte låta pipettspetsen vidrör botten av centrifugröret.
Obs: Överskott tagg kan inte vara synlig för ögat, men kommer att minskas med centrifugering. - Kombinera ett par av NAT och SIL prover, om så önskas för relativ kvantifiering, i en 1: 1-förhållande för tandem-analys.
6. Ultra högtrycksvätskekromatografi och masspektrometri Analys
OBS: LC och MS förhållanden som beskrivs för en enkel NLC-1000 och en Q Exactive hög fält respektive optimerades internt för proteomik analys och glykan analys 21. Dessa förhållanden kan anpassas till andra ultrahög tryck- eller nano LC-system och andra höga upplösningsförmågan masspektrometrar men kan kräva smärre ändringar. Användningen av hög upplösningsförmåga masspektrometri är nödvändig för glykan identifiering och deamidering analys 22,23.
OBS: Steg 6,1-6,3 kan vara skipped om en lämplig omvänd faskromatografi eller hydrofila interaktion kommersiell fälla och kolumn används.
- Syntetisera en fritta i 100 pM ID kapillär enligt Meiring et al. 24 för användning som en fälla.
- Packa fällan under tryck med 2,6 ^ M, 100 Å, C 18 förpackningsmaterial och skars till en längd av 5 cm.
- Packa en 75 iM ID emitter kolonnen under tryck med 2,6 ^ M, 100 Å, C 18 förpackningsmaterial och skars till en längd av 30 cm.
- Förbered två olika LC-MS-metoder för proteomik (6.4.1) och glycomics (6.4.2) arbetsflöden.
Obs: Protein och glykan prover kan köras på samma fälla / kolumninställningar i valfri ordning.- För proteinanalys, injicera ~ 400 ng av protein på kolonnen i mobil fas A (MPA). Köra provet vid 300 Nl / min, i enlighet med tabell 1, med ett 1 | j, l förkolonn jämvikt (500 bar) och en 5 | j, l analyskolonn jämvikt(500 bar). Jonisera proteiner under MS villkoren i tabell 2.
- För glykan analys, injicera 5 il återsuspenderades P2GPN taggade NAT / SIL ekvimolära prover på kolonnen. Köra provet vid 300 Nl / min, i enlighet med tabell 3, med en 2 ^ il förkolonn jämvikt (500 bar) och en 5 | j, l analyskolonn ekvilibrering (500 bar). Jonisera glykaner under MS villkoren i tabell 4.
| Tid | % MPA | % MPB |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 98 | 2 |
| 105 | 80 | 20 |
| 135 | 68 | 32 |
| 136 | 5 | 95 |
| 151 | 5 | 95 |
| 152 | 100 | 0 |
| 167 | 100 | 0 |
Tabell 1. LC-betingelserna för proteomik analys. En gradienteluering med mobil fas B (MPB, 98% acetonitril, 2% H2O, 0,1% myrsyra) utfördes för att eluera peptider för shot-gun proteomik, databeroende förvärvet , MS experiment.
| MS 1 Parametrar | |
| Mass Range (Th) | 375-1500 |
| Upplösning | 120000 |
| AGC | 1 × 10 6 |
| Max Jonisering Tid | 30 |
| S-objektiv FR Nivå | 55 |
| kapillär Temp (° C) | 300 |
| Spray Spänning | 1,75 |
| MS 2 Parametrar | |
| förvärvet Type | Top20 |
| Upplösning | 15000 |
| AGC | 1 x 10 5 |
| Max Jonisering Tid | 30 |
| underfill Ratio | 2% |
| Isolering Window (Th) | 1,4 |
| Laddningstillstånd Uteslutning | 1 |
| Normaliserat kollisionsenergin | 27 |
| Uteslutning Tid (s) | 20 |
Tabell 2: MS förutsättningar för proteomik analys Parametrarna för elektrosprayjonisering, MS ett förvärv, och MS 2 förvärv i en Orbitrap instrument med hjälp av högre energi dissociatio.n (HCD) ges.
| Tid | % MPA | % MPB |
| 0 | 95 | 5 |
| 1 | 70 | 30 |
| 41 | 60 | 40 |
| 46 | 37 | 63 |
| 47 | 10 | 90 |
| 55 | 10 | 90 |
| 56 | 95 | 5 |
| 66 | 95 | 5 |
Tabell 3:. LC-betingelserna för glykan analys En gradienteluering genomfördes för att eluera hydrazid taggade N-glykaner för MS-analys.
| MS 1 Parametrar | |
| Mass Range (Th) | 600-1900 |
| Upplösning | 60000 |
| AGC | 5 x 10 5 |
| Max Jonisering Tid | 64 |
| S-objektiv FR Nivå | 65 |
| Kapillär Temp (° C) | 325 |
| Spray Spänning | 1,75 |
| MS 2 Parametrar | |
| förvärvet Type | Top12 |
| Upplösning | 15000 |
| AGC | 5 × 10 4 |
| Max Jonisering Tid | 100 |
| underfill Ratio | 1% |
| Isolering Window (Th) | 1,4 |
| Fast första mass 125 | |
| Klev Normalized kollisionsenergin | 10/20/30 |
| Uteslutning (sek) | 15 |
Tabell 4: MS villkor för hydrazid taggade N-glykan analys Parametrarna för elektrosprayjonisering är MS en förvärv, och MS 2 förvärv i en Orbitrap instrumentet med högre energi dissociation (HCD) ges..
7. Proteomics och Deamidering Analys
- Identifiera proteiner / peptider med användning av standard bioinformatik sökverktyg.
Obs: Följande analysprotokoll designades med hjälp av Swiss-Prot / Trembl databaser UniprotKB och söka via SEQUEST i Proteome Discoverer 1,4 programvara, men protokollet kan direkt översättas till något protein sökning och poängsättning motorn med ett GUI programvara. Alla kommandon som anges nedan kan nås i programvarugränssnitt via drop-down menyer.- <li> Skapa eller ladda ner en organism lämplig proteinsekvensdatabas från genetiska data eller tillgängliga Proteome databaser som beskrivits av Apweiler et al. 25
Obs: Vanliga Proteome databaser inkluderar Swiss-Prot, Trembl och NCBI, men kan byggas från interna data samt. - Inom programmet, välj en databas sökmotor och välj parametrar beroende på kvaliteten på de uppgifter som erhållits och rigorousness av sökningen önskas, såsom beskrivits av Perkins et al. för MASCOT 26 eller Eng et al. för SEQUEST 27.
- För precisionsuppgifter hög massa, ställa in parametrar för sökning i programmet enligt följande: max två missade klyvningar, 5 ppm föregångare mass tolerans och 0,02 Da fragment masstolerans (för optimerad korrekt deamidering detektering 22) och omfattar följande tryptiska peptidmodifieringar "carbamidomethyl (C)" statisk modifiering och "deamidering (N / Q)" och "oxesolideringen (M) "dynamiska förändringar. Om du använder 18 O matsmältning märkning, inkluderar" deamidering 18 O (1) "som en extra dynamisk modifikation.
- Sök, med den valda motorn råpeptid data mot proteindatabasen (7.1.1).
Obs: Mass toleranser bör anpassas till det instrument som används och inte godtyckligt låg.
Obs: Sökfunktionen är automatiskt klar i programvaran med olika sökmotor specifika algoritmer. Perkolatorn algoritm (MASCOT), SEQUEST, eller andra kombinationer av algoritmer används för att identifiera proteiner från peptider och att göra mål giltigheten av träffar, Mer information om de verktyg som finns är täckta i en recension från Gonzalez-Galarza et al. 28,29. Beroende på vilket program, kan ytterligare sökparametrar måste väljas enligt gottfinnande användaren.
- Exportera de identifierade peptiderna för manuell säkring och furthER-analys.
8. glykan Relativ Kvantifiering
Obs: Följande identifiering och kvantifiering genomfördes med hjälp av Xcalibur programvara. Men någon programvara som analyserar rådata och automatiskt integrerar kromatografiska toppar kan ersättas.
- Generera en teoretisk lista över glykan kompositioner från biologiskt möjliga kombinationer av hexoser, deoxi-hexoser, hexosaminer, sialinsyror och andra saccharides. För detta ändamål har en mänsklig glykan databas publicerad av Walker et al. 15 och kan användas som den är. Teoretiska databaser måste artspecifika biologiska begränsningar införas på kombiutrymme, och dessa regler beskrivs av Kronewitter et al. 31.
- Beräkna glykan monoisotopisk massorna (M) från atommassan för varje komposition för protonladdningstillstånd + 1-3. Ändra form av enkla isotoper massorna att inkludera tillsatsen av NAT (254,14191 g / mol) eller SIL (260,162042 g / mol) P2GPN tag.
- Öppna "Processing Setup" program från färdplanen vyn i Xcalibur. Ställa in en bearbetningsmetod enligt vad exakt beskrivits i det kompletterande materialet från Walker et al. 15 med hjälp av listan genererades i steg 8,2, innehållande de teoretiska monoisotopisk massorna för [M + H] 1+, [M + 2H] 2+, och [ M + 3H] 3+ arter.
Obs: För att bekräfta glykan identitet bortom korrektmassa, för NAT / SIL dubbelsidigt körningar, kontrollera att NAT och SIL N-glykan par co-elueras med samma retentionstid. Kvalitativt kors validera identifikationer med MS 2 spektra, som måste innehålla toppar som hör till oxonium jon-serien 32. - Exportera den integrerade, extraherade jonkromatogram (XIC) områden till Excel för att erhålla SIL och NAT bestånd som exakt beskrivits i det kompletterande materialet från Walker et al. 15
- I Excel, program cellerna i en ny kolumn för att beräkna korrigeringen för molekylvikt överlappningen genom att justera SIL överflöd enligt ekvationen utgiven av Walker et al 1 5.:
,
där A är enkla isotoper topp och den teoretiska isotopen överlappning,
, Kan oberoende beräknas per sammansättning. - I en andra kolonn, program cellerna att normalisera NAT och SIL kanaler med hjälp av ekvationen för den totala normaliserade glykan faktor (TGNF), per spektrum, som beskrivs av Walker et al 1 5.:
,
där N är antalet N-glykaner över kvantifieringsgränsen. - I en ny kolumn, program cellerna att ta förhållandet mellan SIL: NAT glykaner (eller vice versa) för att beräkna flerfaldiga förändringen i koncentration mellan de två proven.
, 
, Kan oberoende beräknas per sammansättning. 
, Representative Results
Figur 1:. Ordningen av huggtänderna-P2GPN hydrofoba märkning kopplad metod (metod A) för kombinerade proteomik och glycomics analys ges steg som skiljer sig mellan glycomics endast för bearbetning och tandem glycomics och proteomik analys, med glykosyleringsställe identifiering markeras. klicka här för att se en större version av denna siffra.
In-line proteomik och glycomics ades filterbaserade P2GPN hydrofoba märkning metoden (metod A) validerats för identifiering, kvantifiering, och molekylvikt partiskhet med hjälp av sammanslaget höna plasmaprover (Figur 1). För enbart glycomics experiment, inter-jämförelser i bestånd av N-glykaner heras genom metodA till carbograph SPE (guld-standard, metod B) framställdes (figur 2). Det fanns inga signifikanta skillnader i bestånd av glykaner mellan de två metoderna. Intra-variabilitet bedömdes också genom att kvantifiera SIL: NAT förhållandet mellan glykaner extraherats med hjälp av samma metod. Logg 2 -distributions av båda metoderna var Gaussian, centrerad på noll, och inte signifikant olika (Figur 3A-B). Molekylvikten varierar mellan de två protokollen helt överlappade, vilket tyder på att filtret inte diskriminerade N-glykaner baserat på molekylviktsområdet och hydrofilicitet (figur 4).
Figur 2: En ekvimolär blandning av NAT och SIL N-glykaner heras enligt metod A eller metod B framställdes av 2,5 | il av höna plasma (N = 4) Prover var anal.yzed av UPLC-MS enligt de rekommenderade parametrarna som föreslås i avsnitt 6. bestånd för varje glykan, i varje NAT / SIL kanal, beräknades genom att integrera ytan under den extraherade jonkromatogram (MMA = 3 ppm), korrigering för molekylär vikt överlappning och justering av TGNF. Dessa förhållanden visas med sina standard fel. Bestånd av metod B: Metod A N-glykaner skilde sig inte signifikant (p> 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inom variationen i (A) Metod A (N = 133) eller (B) Metod B (N = 123) strategier jämfördes. NAT och SIL ekvimolära blandningar av N-glykaner, från samma extraktion systemet, Analyserades under tre tekniska replikat. Logg 2 -distributions var centrerad på noll och var inte signifikant olika mellan de två arbetsflöden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Molekylvikts sortiment av glykanema från varje strategi jämfördes. De två arbetsflöden gav glykaner som spänner över samma molekylviktsområdet. N-glykaner upptäcks i ett protokoll jämfört med andra föll strax ovanför detektionsgränsen (1 x 10 5 överflöd) och återspeglar inte systematisk partiskhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(Tabell 5). Vår typiska 18 timmar filter baserat PNGas F matsmältningen, följt av FASP trypsin Digest (Std-protokoll) resulterade i en hög grad av icke-specifik deamidering, som kan störa identifieringen av glycosites. Därför var ett förfarande som utnyttjar en kortare inkubationstid vid förhöjd temperatur (50 ° C) och en PNGas F spike-i steg (SPI-protokoll) utforskas som ett alternativ, tillsammans med en mikrovågsnedbrytning protokoll (MD-protokollet), för att minimera icke- specifik deamidering. Glykanema som observerats i de nya digestionsmetoderna skilde sig inte signifikant i kompositioner eller bestånd från standard 18 timmar, 37 ° C filter PNGas F Digest (
| proteiner | peptider | deamiderade Peptider | Glycosites | glykoproteiner | |||||||||||||||||||||
| + | - | + | - | + | - | + | - | + | - | ||||||||||||||||
| FASP | 3083 | 795 | 5 | 5 | |||||||||||||||||||||
| 18 timmar | 217 | 304 | 6013 | 5086 | 1029 | 733 | 257 | 24 | 112 | 18 | |||||||||||||||
| MD | 270 | 266 | 5190 | 5125 | 465 | 455 | 254 | 8 | 102 | 7 | |||||||||||||||
| SPI | 281 | 288 | 4729 | 4482 | 602 | 573 | 232 | 10 | 145 | 8 | |||||||||||||||
. Tabell 5: Jämförelser av proteomik data från en standard trypsin smälta kontra in-line HUGGTÄNDER-P2GPN tagg metoden gjordes Beredningar utfördes med (+) och utan (-) PNGas F för att bestämma bakgrunds andelen icke-specifik deamidering och uppskattning glycosite falska positiva värden. Proteiner identifierades med 1% falsk upptäckten hastighet (FDR); peptider filtrerades baserat på "hög" peptid förtroende för Proteome Discoverer 1,4 (q <0,01); glycosites ades identified baserad på unika sekvenser innehållande deamidering av den konserverade glykosylering motivet (NXS / T); och glykoproteiner definierades som identifierade proteiner som innehåller åtminstone en identifierad glycosite.
Figur 5: Förkortad protokoll för glykaner har utvecklats för att minimera deaminering i proverna och jämfördes med 18 h HUGGTÄNDER PNGas F-digerering. Den genomsnittliga skillnader i förekomster var 10% och 5% för MD (2.2.3) och SPI (2.2.2) protokoll, respektive. Av de 48 glykaner identifierats, 90% visade mindre än 1,5 gånger variation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid (50%) | Sigma Aldrich | 45754 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916 | Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1) |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable |
| DL-Dithiothreitol, 1 M in solution | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Easy-nLC 1000 | Thermo Scientific | LC120 | Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters). |
| Floating Tube Rack | TedPella | 20831-20 | |
| Fetuin | New England Biolabs | P6042S | |
| Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens | Fisher Scientific | 11-690-625F | Alternate incubators that reach 56 °C are suitable |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| GE Microwave Oven | General Electric | 57B5 E82904 | Any microwave with adjustable power settings is suitable |
| INLIGHT Glycan Tagging Kit | Cambridge Isotope Laboratories | GTK-1000 | The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent. |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | A3221 | |
| Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase | Phenomenex | Bulk Media | Alternative: Any C18 stationary phase 5 mM |
| Mascot Daemon Software and Server | Matrix Science | Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific) | |
| Methanol, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| PicoFrit Self-Pack Column: 360 μm, OD 75 μm ID, 15 μm tip, non-coated, 5 per box, 50 cm | New Objective | 1 5 PF360-75-15-N-5 | |
| PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml | New England BioLabs | P0705L | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Alternate high mass accuracy (5 ppm) mass spectrometers will provide similar data | |
| RNase B | New England Biolabs | P7817S | |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma Aldrich | T6567-5X | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | Alternate vacuum concentrators are suitable |
| Vivacon 500 30 kDa Filters | Sartorius Stedim Biotech | VN01H22 | Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096) |
| Water, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Water, 18O | Cambridge Isotope Laboratories | OLM-240-97-1 | The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence |
| Xcalibur 2.0 | Thermo Scientific | XCALIBUR20 | |
| Zwittergent Test Kit | Merck Millipore | 693030 |
References
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
- Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
- Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
- Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
- Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
- Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
- Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
- Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
- Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
- Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
- Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
- Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
- Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
- Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
- Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
- Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
- Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
- Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
- Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
- Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
- Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
- Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
- Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
- Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
- Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
- Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).
