Introduction
Proteomik alanında, filtre destekli numune hazırlama (FASP), yaygın olarak, başlangıç malzemesinin miktarını en aza indirmek örnek hazırlama eserler azaltmak ve numune sayısını en üst düzeye çıkarmak 1 kabiliyeti için kabul edilmiştir. Bununla birlikte, bu tür bir yöntem henüz ortaya çıkmakta ve Glikomik alanında için çekiş gücü elde etmek için yer alır. Yüksek verimlilik gelişimi, nicel iş akışları nedeniyle ayrılmaz biyolojik savunma glycoslasyonun rolü ve kanser veya hastalıkların 2,3 ederek modülasyon ihtiyaç vardır. Memelilerde, N -glycans bir çekirdek yapısı dekore sakarit birimi (heksozlar (Hex), hekzoaminler (HexNac), sialik asitleri (NeuAc) ve fucoses (Fuc)), (Hex 3 HexNac 2) 4 kovalent olarak bağlı tekrar oluşur asparajin. Izomerleri sayılır zaman glycospace oldukça geniş olmasına rağmen (> 10 ila 12), bu gibi bir bileşim olarak oldukça küçük ve moleküler ağırlıkları tipik olarak 1,000-8,000 da 5 <arasında değişir/ Sup>. Sınıfının kompozisyon homojenliği ve glıkanların hidrofiliklik saflaştırma, ayırma özel bir sorun teşkil ve kütle spektrometrisi (MS) 6 akışları.
Geleneksel olarak, N -glycans F (PNGase F) ile Peptid N protein veya peptidlerden glikosidaz sindirilir ve daha sonra hidrazid boncuklar 8 ile lektin afinite kromatografisi 7 ile zenginleştirilmiş yakalanan veya katı faz ekstraksiyonu (SPE), 9,10 ile saflaştırılmıştır. Bu yöntemlerin hepsi son derece etkili olsa da, tuzsuzlaştırma için ekstra adımlar tanıtmak ve örnek sayısı aynı anda işleme sınırlamak. Son on yılda, Glikomik için yüksek verimli platformlar bir dizi önerilmiştir. Kim ve ark., Bir vakum çalışan, SPE 96 oyuklu plaka 11 ile, bir yarı-otomatik bir yöntem yayınlanmıştır. Alternatif olarak, bir afinite filtre yöntemi (N -glyco-FASP) fi ilk türetme gerekli Mann grubu tarafından geliştirilenLektinlerin 12 bir kompozit ile ltresi. Son olarak, Thomas-Oates grup glycospace 13 dar kompozisyon boyutunu sömürülen bir yarı-kantitatif bir yöntem, N -Glycan Ayırma (dişleri) Destekli Filtre, önerdi. Molekül ağırlığı kesme filtreleri dayanarak küçük kirletici maddeler ilk atık için yıkandı ve daha sonra N -glycans sindirilir ve yıkandı. Deglikolize proteinler Bu protokol filtre üzerinde kalır ve hat FASP tabi tutulabilir.
Tanımlama ve elektrosprey iyonizasyon ile glıkanların miktar (ESI) MS düşük miktardaki türlerinin tespiti için izomerleri ve türetme (kısmen) çözümlemesi için off-line ayrımları gerektirir. Bireysellik etiketleme glikan hidrazit etiketleri stratejisi ile normalize ters-faz sıvı kromatografisi (RPLC) 14,15 ile uyumluluğu bahşeder. 4-fenetil-benzohidrazid (P2PGN) hidrofobik etiketi enh, glıkanların hidrofilikliğini aracılıkortalama ile iyonizasyon ancing, 16 dört kat. Basit şartlarda stoikiometrik 1: örneğin permethylation 17 ya da amin-reaktif etiketleme kimyaları 18 gibi diğer teknikler, benzer avantajlar sunmaktadır rağmen, hidrazid reaksiyonda, glikanlar 1 tepkimeye sokulur. Rölatif ölçümü yerli (NAT) veya 13 C 6 stabil izotop etiket (SIL) ile derive edilmiş numunelerin ikili analizi ile elde edilmektedir.
Aşağıdaki yöntem doğru göreceli ölçümü için P2GPN hidrofobik etikete plazma uygulamaları ve çiftler bunu için dişlerini geliştikçe. Ayrıca, bu analizler bütünlüğünden ödün vermeden, numunenin tek alikot üzerinde atış-silah proteomik, deamidasyon profilleme ve kantitatif Glikomik gerçekleştirmek için tasarlanmıştır.
Protocol
1. Protein ve glikoprotein denatürasyonu ve alkilasyon
- Standart preparatları, yük 30 kDa'lık üzerine glikoproteinin (örneğin fetuin veya RNaz B) 0.1 ug / ml çözeltisinin 2.5 ul ya da 10 kDa molekül ağırlığı (Mw) kesme filtresi için.
- Biyolojik plazma örnekleri için, bir Bradford 19 standart veya bisinkoninik asit 20 (BCA) protein analizi ile protein konsantrasyonu kontrol edin. Gerekirse 10-100 mg / ml toplam protein arasında içeren ~ 7 arasında bir pH değerinde, H 100 mM amonyum bikarbonat (NH4 HCO3) 2, O (PNGase Digest tamponu), plazma seyreltilir. bir filtre üzerine yük 2.5 ul plazma (25-250 mg protein).
Not: Bu protokol, tek etilendiamintetraasetik asit (EDTA) mevcudiyetinde toplanan kan örneklerinden plazma test edilmiştir.
- Biyolojik plazma örnekleri için, bir Bradford 19 standart veya bisinkoninik asit 20 (BCA) protein analizi ile protein konsantrasyonu kontrol edin. Gerekirse 10-100 mg / ml toplam protein arasında içeren ~ 7 arasında bir pH değerinde, H 100 mM amonyum bikarbonat (NH4 HCO3) 2, O (PNGase Digest tamponu), plazma seyreltilir. bir filtre üzerine yük 2.5 ul plazma (25-250 mg protein).
- Filtrede her numuneye 1 M ditiotreitol solüsyonu (DTT) ve 2 ul ekle.
- 20 ile örnek seyreltilir0 ul tampon sindirimi PNGase.
- yuvasından filtreyi rahatsız etmemek için dikkatli olmak, filtre örnek tüp ve hafifçe vorteks Cap. 30 dakika proteinler ve glikoproteinleri denatüre etmek için 56 ° C'de örnek inkübe edin.
- örnekleri alkillemek için, 50 ul 1 M iyodoasetamid ekleyin ~ 200 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek ve 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
Not: proteomik analizi istenmiyorsa, aşama 1,5 atlanabilir. - 40 dakika 14.000 xg'de örnekleri santrifüj edilerek filtre üzerine denatüre glikoprotein Konsantre. akmasına atın.
2. N Glycan Enzimatik Sindirim -bağlı
- tampon sindirmek PNGase 100 ul örnek yıkayın. 20 dakika boyunca 14.000 xg'de filtre üzerinde glikoprotein Konsantre ve akış atmak.
- Filtre ölü hacim (~ 5 ul) içindeki bir konsantre elde üç kez olmak üzere toplam iki kez yıkanır ve konsantre edilir yineleyin. tüm atınakış-through.
- yıkar kez atın toplama şişesi tamamlandı. yeni bir koleksiyon şişenin gelecekteki tüm yürütücüler ve yıkar toplayın.
NOT: PNGase kimyasal amitsizleştirilmiş hale de-glikosile asparagin siteleri, kararlı izotop etiketleme için PNGase F sindirim adımı sırasında kullanılabilecek H 2 18 O arabelleği sindiremez.
- yeni bir koleksiyonu şişesine transferinden sonra filtre gliserol içermeyen PNGase F (75,000 x birim / ml) 2 ul ekle. PNGase 98 ul 100 ul toplam hacmi getirerek, tampon sindirmek ve hafifçe karıştırın aşağı filtre üzerinde yukarı pipet ve ekleyin. Enzimatik adımlarda 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OR koşullarda glikan sindiremez.
NOT: Proteinlerin Deglikosilasyondan için üç yöntem kullanılabilir. sadece Glikomik analizi (hayır proteomik), adım 2.2.1 uzun inkübasyon önerilir. Glikomik ve proteomik araştırma için, 2.2.2 ve 2.2.3 minimal olmayan sp ile yüksek kaliteli peptitler üretecek adımlarıecific deamidasyon.- Glikomik sadece sindirim protokolü (18hr) enzimatik tüm N -glycans ayırmak için 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Başak sindirim protokolü (SPI): 2 saat, 50 ° C'de inkübe edin. hızlı çalışarak, gliserol-ücretsiz PNGase F (75.000 x birim / ml) ilave 2 ul örnekleri ve başak çıkarın. Hafifçe 1-2 sn karıştırmak için örnekleri girdap. ek olarak 2 saat daha 50 ° C'de inkübe edin.
- Mikrodalga sindirim protokolü (MD): Bir mikrosantrifüj tüp yüzer rafa yerleştirin örnekleri. 1 L'lik bir beher içinde şamandıra örnekleri deiyonize (Di) su, 1 L ile doldurulur. bir döner levha ile bir mikrodalga fırın (950 W) merkezinde beher yerleştirin. 5 dakika boyunca% 60 güç (570 W) mikrodalga. soğutmak için, numunelerin alınması ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında tutun. Daha sonra% 60 güçte ilave bir 5 dakika boyunca mikrodalga.
NOT: Mikrodalga Gücü mikrodalga maksimum güç çıkışı göre ayarlanır gerekecektir.Ortalama güç modelleri arasında sabit tutulmalıdır.
3. N elüsyon -glycans
- 20 ° C'de 20 dakika 14,000 xg'de Örneğin santrifüj ile glikanlar Zehir.
- PNGase 100 ul, 20 ° C'de 20 dakika 14,000 x g'de filtre ve santrifüj tampon sindirimi ekleyin. Kalan N içeren toplayın yıkama, yıkama sıvısı olarak aynı koleksiyon flakon, glıkan -bağlı. İki kez tekrarlayın. Yeni koleksiyon flakon filtre ve yer çıkarın.
- Dondurulmuş (30-60 dakika) kadar -80 ° C'de derin dondurucuda glıkan örnekleri inkübe edin. Vakum yoğunlaştırıcısı (4-6 saat) oda sıcaklığında tamamlanması, Kuru.
Not: N -glycans türetme işleminden önce, altı aya kadar, -20 ° C'de saklanabilir.
4. Protein FASP Sindirim
NOT: proteomik veya deamidasyon sitesi analizi istenmiyorsa, protokol bölümü 4 atlanabilir.
- t durulayıno 8 M üre tampon 400 ul, amitsizleştirilmiş peptidler içeren, filtre. toplama flakon ve karıştırmak için hafifçe vorteks Cap. 15 dakika 14.000 xg filtre üzerinde yoğunlaşın. Tüm flow-through atın.
- Üç üre tampon yıkar toplam adımı yineleyin 4.1 iki ek kez.
- 2 M üre, 10 mM CaCl2 Tampon 400 ul (tripsin tampon sindirmek) ile deamide peptidleri ihtiva eden, durulayın. toplama flakon ve karıştırmak için hafifçe vorteks Cap. 15 dakika 14.000 xg filtre üzerinde yoğunlaşın. Tüm flow-through atın.
- Adımı yineleyin 4.1 iki ek kez, üç tripsin toplam tampon yıkar sindiremez.
- yıkar kez atın toplama şişesi tamamlandı. yeni bir koleksiyon şişenin gelecekteki tüm yürütücüler ve yıkar toplayın.
- 5 tripsin: 1:50 ya da 1 50 ul domuz modifiye tripsin ekleme protein (a / a), buluş veya kantitatif proteomik deneyler için oranı sırasıyla.toplama flakon ve karıştırmak için hafifçe vorteks Cap.
- 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 5 tripsin: protein oranı hızla çalışarak, 1:50 veya 1 de tripsin ek 50 ul örnekleri ve başak çıkarın. Hafifçe 1-2 sn karıştırmak için örnekleri girdap. ek olarak 2 saat daha 50 ° C'de inkübe edin.
- 15 dakika için 14,000 x g'de iplik peptitlerin yıkanması.
- 400 ul% 1 formik asit ve% 0.001 Zwittergent 3-16 (söndürme tamponu) ile filtre kalan peptidler durulayın. 15 dakika boyunca 14.000 xg'de iplik filtreyi devre dışı Zehir.
- Bradford 19 veya BCA 20 tarafından örneklerinde peptit konsantrasyonu ölçmek.
- (30-60 dakika) dondurulmuş kadar ° C derin dondurucuda -80 peptid örnekleri inkübe. Vakum yoğunlaştırıcısı (4-6 saat) oda sıcaklığında tamamlanması, Kuru.
Not: Kuru peptidler üç aya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir. - Liqui için Triptik proteinler hemen önce yeniden süspanseD kromatografisi-kütle spektrometrisi% 2 asetonitril (LC-MS) analizi,% 98 H2O ve istenen konsantrasyona% 0.1 formik asit (mobil faz A). 2.5 ul plazma aralığından triptik peptid konsantrasyonları 100 den - 300 ng / ul.
N 5. türetilmesi Hidrofobik hydrazide Etiketler glıkanlar -bağlı
- 0.25 mg / ml bir son konsantrasyon için, asetik asit (derivatizasyon çözeltisi): 75:25 MeOH 1 ml kurutuldu ağır (SIL) veya ışık (NAT) P2GPN reaktifleri sulandırın. Reaktifler tamamen çözünür hale getirmek için 10 dakika kadar sürer. Yaygın vorteks tam çözülmesini sağlamak.
Durumunda bu türetme protokol standardı N -glycans, karşı saflaştırılmış glukanlardır, P2GPN molar oranı ile kullanılır: Not: glikan yaklaşık (ve az) 17 den olmalıdır: 1. - Etiket kurutuldu N SIL veya NAT P2GPN reaktifi 200 ul (50 ug) ile -glycans. kurutulmuş glıkanları tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipet ve. Vortex saörnek olarak şunlar verilebilir ve daha sonra bir tezgah üstü santrifüj ~ 5 saniye örnekleri aşağı doğru döndürün.
- 56 ° C'de 3 saat reaktif ile glikanlar React.
- Hemen vakum konsantratör için inkübatör glikan taşıyın. 55 ° C (3-5 saat) tamamlanması için kurutulur.
NOT: Bu adım türetme reaksiyonu söndürür; Numune sonraki adımlarda çapraz reaksiyon önlemek için tamamen kuru olmalıdır.
NOT: Kurutulmuş, etiketli örnekler altı aya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir. - Süspanse hemen önce LC-MS analizi için H2O 25-50 ul N -glycans etiketli. N -glycans tamamen çözülmüş olduğundan emin olmak için aşağı yukarı pipet ve.
Not: yeniden süspanse edilmesi için başlangıç hacminin protein konsantrasyonu tahmin edilebilir glikoproteinin başlangıç konsantrasyonu bağlıdır. Ancak aralık Örnek tipine göre farklılık gösterir ve ayrı ayrı optimize edilmesi gerekmektedir. - 5 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüje örnekleri. Süpernatant kaldıratant, dikkatli olmak pipet ucu santrifüj tüpünün alt dokunmasına izin değil.
Not: Aşırı etiket gözle olmayabilir, ama santrifüj azalacaktır. - Tandem analiz için: 1 oranında bir 1, bağıl ölçümü için arzu edildiği takdirde, NAT ve SIL örnekleri bir çift birleştirin.
6. Ultra yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi ve Kütle Spektrometre Analiz
Not: kolay bir NLC-1000 ve Q Exactive Yüksek alan için tarif edilen LC MS koşulları, sırasıyla içi proteomik analizi ve glıkan analizi 21 için optimize edildi. Bu koşullar, diğer ultra yüksek basınç veya nano LC sistemleri ve diğer yüksek çözme gücü kitle spektrometre adapte olabilir, ancak küçük değişiklikler gerekebilir. Yüksek çözme gücü kütle spektrometresi kullanılması glikan tanımlanması ve deamidasyon analizi 22,23 için gereklidir.
NOT: s 6,1-6,3 olabilir AdımlarUygun bir ters-faz kromatografi ya da hidrofilik interaksiyon ticari tuzağı ve sütun kullanıldığında kipped.
- Meiring ve ark., Bir tuzak olarak kullanım için 24 uyarınca 100 uM İD kılcal bir cam hamuru sentez.
- 2,6 uM, 100 A, C 18, ambalaj malzemesi ve 5 cm'lik bir uzunlukta kesilir basınç altında tuzak paketleyin.
- 2.6 uM, 100 A, C 18, ambalaj malzemesi ile basınç altında 75 uM İD yayıcı sütunu paketi ve 30 cm'lik bir uzunlukta kesilir.
- proteomik (6.4.1) ve Glikomik (6.4.2) iş akışları için iki farklı LC-MS yöntemleri hazırlayın.
Not: Protein ve glikan örnekleri herhangi bir sırayla aynı tuzak / sütun ayarına üzerinde çalıştırılabilir.- Protein analizi için, mobil faz A (MPA) kolona protein ~ 400 ng enjekte edilir. 1 ul ön kolon dengeleme (500 bar) ve 5 ul analitik kolon dengeleme birlikte Tablo 1 'e göre, 300 NL / dakika Örnek çalıştırın(500 bar). Tablo 2'de verilen MS koşulları altında proteinleri iyonize.
- glikan analizi için, yeniden süspanse 5 ul enjekte P2GPN kolona NAT / SIL eşit molar örnekleri etiketli. 2 ul ön kolon dengeleme (500 bar) ve 5 ul analitik kolon dengeleme (500 bar), Tablo 3'e göre, 300 NL / dakika Örnek çalıştırın. Tablo 4'te verilen MS koşullarında glikan iyonize.
| Zaman | % MPA | % MPB |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 98 | 2 |
| 105 | 80 | 20 |
| 135 | 68 | 32 |
| 136 | 5 | 95 |
| 151 | 5 | 95 |
| 152 | 100 | 0 |
| 167 | 100 | 0 |
Proteomik analizi için Tablo 1. LC koşulları. Mobil faz B (MPB,% 98 asetonitril,% 2 H2O,% 0.1 formik asit) ile gradyan elüsyonu atış gun proteomik, veri-bağımlı kazanılmasının Peptidlerin elüsyonu için gerçekleştirilmiştir MS deneyler.
| MS 1 Parametreler | |
| Kütle Aralığı (Th) | 375-1500 |
| çözüm | 120.000 |
| AGC | 1 × 10 6 |
| Max İyonizasyon Zaman | 30 |
| S-Lens FR Seviye | 55 |
| kılcal TemP (° C) | 300 |
| Gerilim sprey | 1.75 |
| MS 2 Parametreler | |
| Toplama Tipi | TOP20 |
| çözüm | 15.000 |
| AGC | 1 x 10 5 |
| Max İyonizasyon Zaman | 30 |
| Az dolu bir Oranı | % 2 |
| İzolasyon Pencere (Th) | 1.4 |
| Şarj Devlet Dışlama | 1 |
| Normalize Çarpışma Enerjisi | 27 |
| Dışlama Süre (ler) | 20 |
Tablo 2: Bir Orbitrap enstrüman MS proteomik analizi için koşullar elektrosprey iyonizasyon parametreleri, MS 1 satın alma, ve MS 2 edinimi yüksek enerjili dissociatio kullanarak.n (HCD) verilir.
| Zaman | % MPA | % MPB |
| 0 | 95 | 5 |
| 1 | 70 | 30 |
| 41 | 60 | 40 |
| 46 | 37 | 63 |
| 47 | 10 | 90 |
| 55 | 10 | 90 |
| 56 | 95 | 5 |
| 66 | 95 | 5 |
Tablo 3:. Glıkan analiz için LC koşulları bir gradyan elüsyonu hidrazid N MS analizi için -glycans etiketli elüte etmek için yapıldı.
| MS 1 Parametreler | |
| Kütle Aralığı (Th) | 600-1900 |
| çözüm | 60.000 |
| AGC | 5 × 10 5 |
| Max İyonizasyon Zaman | 64 |
| S-Lens FR Seviye | 65 |
| Kılcal Sıcaklık (° C) | 325 |
| Gerilim sprey | 1.75 |
| MS 2 Parametreler | |
| Toplama Tipi | Top12 |
| çözüm | 15.000 |
| AGC | 5 × 10 4 |
| Max İyonizasyon Zaman | 100 |
| Az dolu bir Oranı | % 1 |
| İzolasyon Pencere (Th) | 1.4 |
| Sabit Birinci Kütle 125 | |
| Kademeli Normalize Çarpışma Enerjisi | 10/20/30 |
| Dışlama Süresi (sn) | 15 |
Tablo 4: hidrazid MS şartları N -glycan analiz etiketli elektrosprey iyonizasyon parametreleri, yüksek enerjili ayrışmasını (HCD) kullanarak bir Orbitrap enstrüman MS 1 satın alma, ve MS 2 edinme verilir..
7. Proteomiks ve deamidasyon Analizi
- Standart biyoinformatik arama araçlarını kullanarak protein / peptidler belirleyin.
Not: Aşağıdaki analiz protokolü UniProtKB Swiss-Prot / TrEMBL veritabanlarını kullanarak ve Proteome Discoverer 1.4 yazılımı SEQUEST üzerinden arama dizayn edilmiştir, ancak, protokol doğrudan bir GUI yazılımı kullanarak herhangi bir protein arama ve puanlama motoruna tercüme edilebilir. Aşağıda verilen tüm komutlar açılan menüleri aracılığıyla yazılım arayüzleri erişilebilir.- <li> oluşturma veya Apweiler ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, genomik veri veya proteom veritabanlarından bir organizma uygun protein dizisi veritabanı indir. 25
Not: Ortak proteom veritabanları Swiss-Prot, TrEMBL ve NCBI içerir, ancak aynı zamanda in-house verilerinden inşa edilebilir. - Perkins ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi yazılım içinde, elde edilen verilerin kalitesi ve istenen arama hassaslığını göre bir veritabanı arama motoru seçin ve parametreleri seçin. MASCOT 26 veya Eng ve arkadaşları. SEQUEST 27 için.
- Yüksek kütle doğruluk verileri için, yazılımda arama için parametrelerini ayarlamak şöyle: max 2 cevapsız bölünmelere, 5 ppm habercisi kitle hoşgörü ve 0.02 Da fragmanı kütle toleransı (optimize doğru deamidasyon tespiti 22) ve aşağıdaki triptik peptit değişiklikleri içerir "carbamidomethyl (C)" statik modifikasyonu ve "deamidasyon (N / Q)" ve "oksoidation (M) "dinamik değişiklikler. 18 O sindirim etiketleme kullanıyorsanız, include" deamidasyon 18 O (1) "ek dinamik değişiklik olarak.
- Arama, seçilen motor, protein veritabanı (7.1.1) karşı ham peptid verileri kullanarak.
Not: Kütle toleranslar kullanılan enstrüman için uygun ve keyfi olarak düşük olmamalıdır.
Not: arama fonksiyonu çeşitli arama motoru özel algoritmalar kullanarak yazılım tarafından otomatik olarak tamamlanır. süzücü algoritması (MASCOT), SEQUEST veya algoritmaların diğer kombinasyonları peptidler proteinleri tespit ve isabet geçerliliğini puan için kullanılmaktadır; bulunan araçlarla ilgili daha fazla bilgi Gonzalez-Galarza ve ark., 28,29 den bir yorumda kaplıdır. yazılıma bağlı olarak, ek bir ara parametre kullanıcının kararına göre seçilebilir gerekebilir.
- kılavuzu küratörlüğü ve Furth için belirlenen peptidler dışaer analizi.
8. Glikan nispi niceliği
Not: Aşağıdaki tanımlama ve miktar XCalibur yazılımı kullanılarak tamamlanmıştır. Ancak, otomatik olarak ham verileri analiz eder ve herhangi bir yazılım kromatografik zirveleri ikame edilebilir bütünleştirir.
- Bir heksozların, deoksi-heksozların, hekzoaminler, sialik asitlerin biyolojik olası kombinasyonların gelen glikan kompozisyonların teorik listesi ve diğer sa oluşturmakccharides. Bu amaçla, bir insan glıkan veritabanı Walker ve arkadaşları. 15 tarafından yayınlanmıştır ve olduğu gibi kullanılabilir. Teorik veritabanları için türe özgü biyolojik kısıtlamalar birleştirici alan empoze edilmelidir ve bu kurallar Kronewitter ve ark., 31 tarafından tarif edilmiştir.
- Proton şarj devletler + 1-3 için her bileşim için atomik kitlelerden glikan Monoizotopik kütleleri (M) hesaplayın. NAT (254,14191 gr / mol) ve SIL (260,162042 g / Mol) P2GPN etiketinin eklenmesi dahil monoizotopik kütleler değiştirin.
- Xcalibur Yol haritası görünümünde "İşleme Kur" programını açın. Tam olarak Walker et al ek malzemenin de tarif edildiği gibi bir işleme yöntemi ayarlayın. 15 teorik monoizotopik kütleler ihtiva eden aşama 8.2'de elde listesini kullanarak [M + H] 1, [M + 2H] 2+ ve [ M + 3H] 3+ tür.
Not: Doğru ötesinde glikan kimliğini onaylamak içinNAT / SIL çalışır dupleks için kitle, kontrol aynı tutma süresi ile NAT ve SIL N -glycan çiftleri eş elute söyledi. Niteliksel okzonyum iyon serisi 32 ait doruklarına içermelidir ki, MS 2 spektrumları ile tanımlamaları çapraz doğrulamak. - Tam Walker ve ark Yan Malzeme açıklandığı gibi SIL ve NAT bolluklarını elde etmek için Excel alanları entegre, çıkarılan iyon kromatogram (XIC) ihracat. 15
- Excel'de, program yeni bir sütunda hücreleri Walker ve arkadaşları tarafından yayınlanan denkleme göre SIL bolluğu ayarlayarak molekül ağırlığı örtüşme için düzeltme hesaplamak için 1 5.:
,
Bir Monoizotopik tepe ve teorik izotop örtüşme olduğu,
, Bağımsız bir şekilde bileşimin her hesaplanabilir. - Walker ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, ikinci sütununda program hücreleri, spektrum başına toplam normalleştirilmiş glıkan faktörü (TGNF) için denklem kullanılarak NAT ve SIL kanalları normalize etmek için 1 ila 5.:
,
N'dir N sayısı miktar sınırının üzerinde -glycans. - iki örnek arasındaki konsantrasyon kat değişimi hesaplamak için NAT glıkanları (veya tersi): yeni bir sütun, programı hücreleri SIL oranını almak.
, 
, Bağımsız bir şekilde bileşimin her hesaplanabilir. 
, Representative Results
Şekil 1:. Kombine proteomik ve Glikomik analizi için dişleri-P2GPN hidrofobik etiketleme birleştiğinde yöntemin şeması (Yöntem A) verilen glikozilasyon sitesi tanımlama ile Glikomik sadece işleme ve tandem Glikomik ve proteomik analizi arasında farklılık adımlar, vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Içinde hat proteomik ve Glikomik, filtre tabanlı P2GPN hidrofobik etiketleme yöntemi (Yöntem A) toplanmış tavuk plazma örnekleri (Şekil 1) kullanılarak belirlenmesi, kantitatif ve molekül ağırlığı önyargı için doğrulandı. Yalnızca Glikomik deneyler için, N bolluk arası karşılaştırmalar Yöntemi ile ekstre -glycansBir SPE (altın standardı, Metot B) yapılmıştır (Şekil 2) carbograph için. İki yöntem arasındaki glukanlardır bolluk açısından anlamlı bir fark yoktu. aynı yöntemle ekstre glıkanların NAT oranı: içi değişkenliği de SIL nicelleştirilmesiyle tayin edilmiştir. Her iki yöntemin günlük 2 dağıtımı: sıfır merkezli, Gauss vardı ve (Şekil 3A-B) anlamlı olarak farklı değildi. Molekül ağırlığı filtresi N molekül ağırlığı aralığı ve hidrofil (Şekil 4) dayalı -glycans ayrımcılık olmadığını düşündüren, tamamen üst üste iki protokol arasında değişmektedir.
Şekil 2:. NAT ve SIL N eşdeğer moldeki bir karışımı Yöntem A veya Yöntem B ile ekstre -glycans 2.5 tavuk plazma ul (n = 4) Örnekler edildi anal hazırlandıHer NAT / SIL kanalında bölüm 6. Her glikan için bolluğu önerilen önerilen parametrelere göre UPLC-MS ile yzed, moleküler düzeltmek, çıkarılan iyon kromatogram (MMA = 3 ppm) altındaki alanların integrasyonu ile hesaplanmıştır TGNF ağırlık örtüşme ve ayarlama. Bu oranlar standart hata ile gösterilir. Yöntem B bolluğu. Yöntem A N -glycans (p> 0.05) anlamlı bir fark yoktu bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3, (A) yöntemi, bir içi değişkenliği (N = 133), ya da (b) Yöntem B (n = 123) stratejiler karşılaştırılmıştır. Aynı çıkarma düzeni N -glycans NAT ve SIL eşit molar karışımları,Üç teknik çoğaltır üzerinde analiz edildi. Günlük 2 dağıtımı: sıfır merkezli ve iki iş akışları arasında. Anlamlı fark edildi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Her stratejiden glıkanların molekül ağırlığı aralıkları karşılaştırıldı. İki iş akışları aynı molekül ağırlığı aralığı kapsayan glıkanları vermiştir. N, diğer sadece algılama (1 × 10 5 bolluk) sınırının üzerinde düştü karşı bir protokolde tespit -glycans ve sistematik önyargı yansıtmıyor. Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.
(Tablo 5) olmadan geleneksel FASP hazırlanması ile karşılaştırılmıştır. FASP tripsin sindirmek (Std protokolü) tarafından takip Bizim tipik 18 saat filtre tabanlı PNGase F sindirim, glycosites tanımlanması engelleyebilir non-spesifik deaminasyondan önemli düzeylerde sonuçlandı. Bu nedenle, yüksek bir sıcaklıkta (50 ° C) ve bir PNGase F başak aşama (SPI protokolü) de kısa bir kuluçkalama süresinde kullanan bir yöntem olup, bir mikrodalga sindirim protokolü (MD protokolü) ile birlikte, bir alternatif olarak araştırılmıştır, sivil en aza indirmek için belirli bir deamidasyon. Yeni sindirim yöntemleri gözlenen glıkanlar, standart 18 saat gelen kompozisyonlar ya da bolluk içinde anlamlı bir farklılık yoktu 37 ° C filtre PNGase F özeti (
| proteinler | peptitler | amitsizleştirilmiş Peptitler | Glycosites | glikoproteinler | |||||||||||||||||||||
| + | - | + | - | + | - | + | - | + | - | ||||||||||||||||
| FASP | 3083 | 795 | 5 | 5 | |||||||||||||||||||||
| 18hr | 217 | 304 | 6013 | 5086 | 1029 | 733 | 257 | 24 | 112 | 18 | |||||||||||||||
| MD | 270 | 266 | 5190 | 5125 | 465 | 455 | 254 | 8 | 102 | 7 | |||||||||||||||
| SPI | 281 | 288 | 4729 | 4482 | 602 | 573 | 232 | 10 | 145 | 8 | |||||||||||||||
. Tablo 5: Standart bir tripsin ile proteomik verilerin karşılaştırılması in-line dişleri-P2GPN etiketleme yöntemi yapılmıştır karşı sindirmek hazırlıklar ile gerçekleştirildi (+) ve olmayan (-) PNGase F non-spesifik deaminasyondan ve tahmin arka plan oranlarını belirlemek için yalancı pozitif oranları glycosite. Proteinler% 1 yanlış keşif oranı (FDR) ile tespit edilmiştir; peptidler Proteome Discoverer 1.4 "yüksek" peptid güvene dayalı filtre edildi (q <0.01); glycosites saptanmasına edildied korunmuş glikosilasyon motifi (NXS / T) deamidasyonu içeren benzersiz dizilerinin dayalı; ve glikoproteinler, en az bir tespit glycosite ihtiva tanımlanan proteinler olarak tanımlandı.
Şekil 5: glikanlara kısaltılmış protokoller örneklerde deaminasyonu en aza indirmek için geliştirilmiş ve 18hr dişleri PNGase F Digest karşılaştırılmıştır. bollukları ortalama farklılıklar% 10 ve sırasıyla MD (2.2.3) ve SPI (2.2.2) protokolleri,% 5 idi. Tespit 48 glukanlardır,% 90 daha az 1,5 kat varyasyon daha. Görüntülenen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid (50%) | Sigma Aldrich | 45754 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916 | Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1) |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable |
| DL-Dithiothreitol, 1 M in solution | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Easy-nLC 1000 | Thermo Scientific | LC120 | Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters). |
| Floating Tube Rack | TedPella | 20831-20 | |
| Fetuin | New England Biolabs | P6042S | |
| Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens | Fisher Scientific | 11-690-625F | Alternate incubators that reach 56 °C are suitable |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| GE Microwave Oven | General Electric | 57B5 E82904 | Any microwave with adjustable power settings is suitable |
| INLIGHT Glycan Tagging Kit | Cambridge Isotope Laboratories | GTK-1000 | The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent. |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | A3221 | |
| Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase | Phenomenex | Bulk Media | Alternative: Any C18 stationary phase 5 mM |
| Mascot Daemon Software and Server | Matrix Science | Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific) | |
| Methanol, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| PicoFrit Self-Pack Column: 360 μm, OD 75 μm ID, 15 μm tip, non-coated, 5 per box, 50 cm | New Objective | 1 5 PF360-75-15-N-5 | |
| PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml | New England BioLabs | P0705L | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Alternate high mass accuracy (5 ppm) mass spectrometers will provide similar data | |
| RNase B | New England Biolabs | P7817S | |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma Aldrich | T6567-5X | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | Alternate vacuum concentrators are suitable |
| Vivacon 500 30 kDa Filters | Sartorius Stedim Biotech | VN01H22 | Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096) |
| Water, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Water, 18O | Cambridge Isotope Laboratories | OLM-240-97-1 | The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence |
| Xcalibur 2.0 | Thermo Scientific | XCALIBUR20 | |
| Zwittergent Test Kit | Merck Millipore | 693030 |
References
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
- Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
- Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
- Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
- Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
- Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
- Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
- Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
- Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
- Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
- Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
- Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
- Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
- Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
- Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
- Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
- Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
- Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
- Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
- Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
- Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
- Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
- Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
- Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
- Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
- Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).
