该协议的目的是评估使用同时含有肿瘤和非肿瘤细胞混合培养抗癌药物在体外的特异性。
一种用于在使用同时含有肿瘤和非肿瘤细胞培养物的体外评估的抗癌药物特异性过程证明。的关键要素是使用双探针数字PCR测定和肿瘤细胞的比例的后续计算定量测定相对肿瘤特异性遗传改变的一个普遍序列。该试验是在含有和已建立的线路的肿瘤细胞的培养进行了掺入-在非肿瘤细胞。混合培养用各种浓度的试验药物进行处理。在处理后,DNA直接从在利用简单和廉价的方法的96孔板孔中的存活粘合剂细胞制备,并进行双探针数字PCR分析,用于测量肿瘤特异性遗传改变和参考普遍序列。在本示范中,NF1基因的杂合缺失用作肿瘤特异性遗传改变和一个RPP30基因作为参考基因。使用比率NF1 / RPP30,肿瘤细胞的比例计算。因为肿瘤细胞的比例的剂量依赖性变化提供了该药物的特异性的体外指示,这种遗传和基于细胞的体外测定法将可能有在药物发现的应用潜力。此外,个性化癌症护理,这genetic-和基于细胞的工具可以有助于通过使用个别肿瘤的原代培养物测试功效和候选药物特异性的手段优化辅助化疗。
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
在用于体外评估药物特异性此genetic-和基于细胞的工具中的关键步骤是使用一个或多个肿瘤特异性的遗传特征的肿瘤细胞的比例的测定。与传统的表型特征7,遗传特性是特定的,稳定的和容易量化。例如,肿瘤特异性突变或拷贝数变异只存在于肿瘤细胞中,但不是在非肿瘤细胞。这样的遗传柱头能够可靠地和精确地定量,例如,使用数字PCR如本研究。
对于数字PCR,DNA的高纯度不是必要的。然而,脱盐并除去抑制分子是必要的,这可以通过使用合适的滤光器的下拉式透析来实现。将合并的裂解和下拉式透析是简单,快速,不需要特殊的工具,因此,可以在任何标准的实验室中进行。如果细胞不布雷亚ķ良好,另外的处理可以被认为是,如冷冻细胞在-20℃,加入洗涤剂和/或使用蛋白酶。
在本研究中,NF1基因的杂合缺失用作定量肿瘤特异性特征。同样地,也可以使用其他的基因或基因座的缺失。此外,突变也可用于定量肿瘤细胞。在这种情况下,对于突变体数字PCR测定和正常等位基因需要被广泛验证,以确保其为每个特异性。
肿瘤细胞的剂量依赖性比例为药物 – 特异性或选择性的指示。此外,它也使从混合培养的总细胞对药物( 图4)的响应的肿瘤细胞中提取的响应。此萃取策略提供了在使用原代培养物的技术问题的解决方案(其中包含肿瘤和无正肿瘤细胞)进行药物测试。
基于细胞在本研究证明因此可能具有应用潜力的体外工具genetic-和(1)在药物发现,其中它提供了用于评估药物特异性或选择性的体外和一平台(2)个性化癌症护理它使测试药物在小学文化,因此可以辅助化疗4有助于药物的选择。此外,可以使用此工具来研究药物的药理作用机制,因为某些遗传改变或多个基因改变可以在药物治疗过程中应遵循。
在使用个别化原代培养物的一个困难是缺乏对肿瘤细胞的量化的通用遗传特征。但是,随着今天的全基因组测序提前,最频繁改变的基因和区域是已知的常见的肿瘤。例如,其中头部和颈部肿瘤,71%,23%和22%具有在TP53,FAT1突变和CDKN2A基因,60%,34%和26%具有在CDKN2A,STK11和PTEN,分别为10的基因区域缺失。因此,通过靶向测序和/或数字PCR方法筛选5至10个这样的基因或/和地区将有可能确定哪些可用于肿瘤细胞中的衍生初级培养定量的一种或多种遗传改变。另一个限制是用于建立原代培养物的切除肿瘤的量往往不足。
尽管有利特征和genetic-的有前途的应用潜力和基于细胞的体外工具,其限制,应牢记及其体外性质应该强调。例如,对肿瘤细胞的差动作用或细胞毒性药物的可能,而由于在细胞类型差异(成纤维细胞与雪旺氏细胞)或它们不同来源(来自不同个体)。在肿瘤细胞上比在非肿瘤细胞的药物中较强的作用也由一个事实,即前者增长比后者快进行说明。最重要的是,细胞在体外行为不同比在人体中的细胞,因此, 在体外评估结果经常没有或只是部分地反映真实的临床情况。因此,功效,毒性和对培养的细胞获得的药物特异性相当的生物标志物的性质,但不具有抗生素临床前测量效力的可靠性。然而,从细胞系混合培养和/或初级培养移动是在评估在体外的药物作用和特异性/选择性前进了一步。具有广泛的努力, 在体外条件可以发现这使得与患者实际响应,至少在某些药物在体外数据的合理相关性。
The authors have nothing to disclose.
阿尔斯特夫人,西洋中部先生和姜医生都赞赏他们出色的技术援助。还赞赏是Volz的博士和提供访问他们的数字PCR设备的研究小组Dandri博士。
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |