Summary
Målet med detta protokoll är att bedöma specificiteten av cytostatika in vitro med hjälp av blandade kulturer innehållande både tumör och icke-tumörceller.
Abstract
Ett förfarande för att bedöma specificiteten av cytostatika in vitro med hjälp av kulturer innehållande både tumör och icke-tumörceller demonstreras. Den viktigaste faktorn är den kvantitativa bestämningen av en tumörspecifik genetisk förändring i förhållande till en universell sekvens med dubbla sond digital PCR-analys och efterföljande beräkning av andelen tumörceller. Analysen utförs på en kultur som innehåller tumörceller av en etablerad linje och spiked-i icke-tumörceller. Den blandade kulturen behandlas med ett testläkemedel vid olika koncentrationer. Efter behandlingen är DNA ställas direkt från de överlevande vidhäftande cellerna i brunnar av 96-brunnars plattor med användning av en enkel och billig metod, och utsattes för en dual-sond digital PCR-analys för mätning av en tumörspecifik genetisk förändring och en referens universell sekvens . I föreliggande demonstration, är en heterozygot deletion av NF1-genen som används som den tumörspecifika genetisk förändring ochen RPP30 gen som referens gen. Använda förhållandet NF1 / RPP30, var andelen tumörceller beräknades. Eftersom den dosberoende förändring av hur stor andel av tumörceller tillhandahåller en in vitro-indikation för specificiteten av läkemedlet, kommer denna genetiska och cellbaserade in vitro-analys sannolikt ha tillämpning potential i läkemedelsutveckling. Dessutom för personlig cancer-care, kan detta genetic- och cellbaserade verktyg bidra till att optimera adjuvant kemoterapi genom att testa effektivitet och specificitet läkemedelskandidater som använder primära odlingar av individuella tumörer.
Protocol
1. Förbereda Mix kultur innehållande både tumörceller och icke-tumörceller
- Använda tumörceller från en etablerad cellinje MPNST S462 5. Använd fibroblaster som icke-tumörceller 6,7
- Kultur både tumörceller och fibroblaster i standard DMEM-medium med 10% fetalt bovint serum (BSA), 3 mM glutamin, 0,1 mM 2-merkaptoetanol, 500 U / ml penicillin, 500 g / ml streptomycin och 1 mM natriumpyruvat vid 37 ° C och 5% CO2 5-7. Vid underflödet, skörda cellerna med 0,05% trypsin och räkna dem med hjälp av en hemocytometer.
- Blanda 400 tumörceller och 1.600 icke-tumörceller tillsammans i varje brunn i en 96-brunnars odlingsplatta i 0,2 ml medium. Med tanke på snabbare tillväxt av tumörceller under perioden behandling av 5 dagar, var den initiala andelen tumörceller satt till 25%. Inrätta fyra replikat för varje läkemedelskoncentration. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2 O / N.
2. Drug Behandling
- Använda nilotinib som testläkemedlet. Framställa stamlösningar av 0, 2, 4 och 20 mM nilotinib i DMSO. Späd ut varje av dem med 200-faldigt i 5 ml DMEM-medium, vilket ger 2-faldiga koncentrerade läkemedels-lösningar av 0, 10, 20 och 100 | iM 6,7.
- Avlägsna 0,1 ml medium från varje brunn och tillsätt 0,1 ml av medium innehållande drogen. De slutliga koncentrationerna är 0, 5, 10 och 50 ^ M. Fortsätta inkubering av cellerna i medium innehållande läkemedel i 5 dagar.
- Vid slutet av behandlingen, inspektera de bifogade cellerna med användning av ett faskontrastmikroskop och ta foton. Aspirera mediet bort, tvätta levde vidhäftande cellerna en gång med 0,2 ml PBS.
3. Förbereda DNA för Digital PCR
- Lyserar celler med användning av HotShot 8.
- Tillsätt 50 | il alkalisk lys-lösning (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) till varje brunn. Täta brunnarna med folie. Inkubera plattan vid 95 ° C i en ugn eller på en värmeplatta under 30 min. Kolla under en microscope för att se till att inga fler intakta celler förblev på ytan av brunnarna. I fall cellerna inte lyse helt öka uppvärmningstiden eller lägga till tvättmedel. Frysa dem en gång vid -20 ° C ökar också bryta celler.
- Tillsätt 50 | il neutraliserande lösning (40 mM Tris-HC, pH 4,0) till varje brunn. Överföra alla lysat till U-form brunnar i en PCR-platta och torka i en PCR-cycler vid 95 ° C under 10 till 30 min. Rekonstituera lysaten med 20 | il destillerat vatten.
- Avsalta använder Drop-Dialys 9
- använda membranfilter med en genomsnittlig porstorlek 0,025 um.
- Flyta filtret på destillerat vatten med blanka sidan upp i brunnarna i en 12-brunnars platta. Väta filtret i 5 min. Uppmärksamma att undvika luftbubblor mellan filtret och vatten.
- Pipettera de rekonstituerade lysat av varje prov från steg 3.1.4 försiktigt på på var och en av de 4 områden av filtret. Täck plattan och dialysera under 30 till 60 min.
- Suga bort vattnet under filtret utan att vända över filtret eller störa dropparna.
- Överför lysat-droppar i brunnar i en ny PCR-platta. Torka de DNA-droppar genom upphettning vid 95 ° C under 10 till 30 min i en PCR-cykelapparat. Rekonstituera lysaten i 10 | il vatten.
4. Digital PCR
- Tina frysta komponenter såsom DNA, buffert och analysblandningen vid RT, spinn ner i 10 sekunder vid maximal kraft av vilken som helst tillgänglig centrifug (t.ex. VWR minicentrifug) och sedan hålla dem på is.
- Förbereda huvudblandning innehållande alla komponenter förutom DNA (tabell 1). Överväga död volym och beräkna mästare blandning ca 10% mer än det begärda beloppet.
OBS: Använd primers och prober som används i kommersiellt kit. - Vortex befälhavaren blandning, spinn ner i 10 sekunder vid maximal kraft alla tillgängliga centrifug (t.ex. VWR minicentrifug) och fördela 15 mikroliter till varjebrunn i en 96-PCR-platta. Lägg till alla lysat (som innehåller DNA) av varje prov till brunnarna innehållande masterblandningen. Överföring 20 | il av varje reaktionsblandning i en brunn på provsidan av en patron vid RT.
- Dispensera 70 pl av droppgenerator olja i varje brunn på oljesidan av en patron. Stäng patron med packningen och placera hela inställningen till en droppgenerator. Starta dropp generation.
- Överföring 40 | il droppe-lösningen i brunnar i en 96-brunnars PCR-platta. Förslut plattan med en folie och placera plattan i en PCR-cykelapparat. Ställa locket-temperaturen vid 105 ° C och ramphastighet vid 2 ° C / sek. Utföra PCR med hjälp av inställningarna i tabell 2. Efter PCR, överföra plattan i en dropp läsare och börja läsa. Alternativt förvara plattan vid 4 ° C i upp till 24 timmar.
5. Beräkning Andel av tumörceller
- Ladda digitala PCR data och utföra automatiska analysär.
- Styr resultaten av varje analys manuellt genom att inspektera den endimensionella och två-dimensionell fördelning av de positiva och negativa droppar, och se till att de är väl separerade och tröskel raderna var på rätt plats. Uteslut resultat som inte uppfyller kriterierna, till exempel, ingen klar åtskillnad mellan positiva och negativa droppar, från vidare analys. Kopiera den resulterande förhållandet NF1 / RPP30 i ett Excel-ark.
- Beräkna andelen tumörceller som: 2 x (1- NF1 / RPP30).
6. Dosberoende Ändring av Andel av tumörceller
- För varje läkemedel-koncentration, beräkna medelvärdet och standardavvikelsen från de 4 replikaten. Rita medel och standardavvikelser mot läkemedelskoncentrationer.
Representative Results
Kvaliteten på DNA som prepareras med den kombinerade HotShot / Drop-Dialys är tillräcklig för en tillfredsställande digital PCR (Figur 1B). För 2.000 fibroblaster, ca 3000 ± 500 positiva droppar erhölls, vilket motsvarar 75% av de förväntade 4.000 exemplar (två kopior i en cell). I denna studie, tumörcellerna var från en etablerad linje MPNST S462 som är kända för att ha en heterozygot deletion av NF1-genen 5. Denna 50% gen dosreduktion tydligt detekteras av dubbla digitala PCR-analys (Figur 1B). Däremot har två kopior av denna gen mätt i fibroblaster. Denna genetiska skillnaden mellan tumör och icke-tumörceller möjliggör beräkning av den andel av tumörceller i blandade kulturer (Figur 2). Genom mätning av den relativa genen doseringen av NF1 till RPP30, kan andelen av tumörceller i en blandad kultur bestämmasvid varje läkemedelskoncentration (figur 3).
Figur 1. Digital PCR. (A) illustration av principen. (B) en dual-sond analys avslöjar reducerad mängd av ett mål (NF1) genen i tumörceller MPNST S462 i förhållande till en referens (RPP30) genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Beräknat Andel av tumörceller. Tumörceller och icke-tumörceller blandades vid olika förhållanden och såddes i varje brunn i en 96-platta. Efter fastsättning O / N, lyserades cellerna with HotShot / Drop-dialys och den avsaltade lysaten utsattes för digital PCR som gav förhållandet mellan NF1 / RPP30. Bas på detta förhållande, var andelen tumörceller i varje brunn beräknades. Medelvärde och standardavvikelse för proportioner av tumörceller beräknades från fyra replikat vid varje set-up proportion. De beräknade proportionerna av tumörceller (Y-axeln) avsattes mot installations proportioner (X-axeln). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dosberoende Förändring av Andel av tumörceller. (A) dosberoende reduktion av synliga vitala celler. (B) andel av tumörceller (medelvärde och standardavvikelse av 4 replikat) beräknas från den Förhållandet mellan NF1: RPP30 minskade i intervallet 0-10 | iM. Vid den högsta dosen 50 ^ M, har några viktiga celler kvar, sannolikt på grund av toxisk effekt till alla celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 4. Separerande Response av tumörceller från den hos icke-tumörceller (A) viabilitet och / eller proliferation av totala celler kan mätas med användning av konventionella analyser; Andel av tumörceller kan bestämmas med användning av förfarandet visat i föreliggande studie. (B) med användning av de två parametrarna, kan svaret av totala celler i en blandad kultur till ett läkemedel delas upp i svaret hos de tumörceller och svaret hos de icke-tumörceller..com / filer / ftp_upload / 53.752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 Reaktion | ||
| 2 x ddPCR Supermix | 12 | |
| Analysblandning för NF1 | 1,2 | |
| Analysblandning för RPP30 | 1,2 | |
| Haelll | 0,6 | |
| Delsumma | 15 | mastermix |
| DNA | 9 | |
| Total | 24 | Slutliga PCR Blandning |
Tabell 1 Konfigurera Dual ddPCR Reaktion
| Steg | Handling | Temperatur | Tid | cykler |
| 1 | Polymradera aktivering | 95 ° C | 10 min | 1 |
| 2 | DNA-denaturering | 94 ° C | 30 sek | 40 |
| 3 | Annealing / exetension | 60 ° C | 1 min | |
| 4 | polymeras deaktivering | 98 ° C | 10 min | 1 |
| 5 | Hold (tillval) | 4 ° C |
Tabell 2 PCR Cycler Settings
Discussion
Nyckelsteget i denna genetic- och cellbaserade verktyg för att bedöma läkemedels specificitet in vitro är fastställandet av andelen tumörceller med användning av en eller flera tumörspecifika genetiska särdrag. I motsats till konventionella fenotypiska egenskaper 7, genetiska särdrag är specifika, stabil och lätt att kvantifiera. Till exempel, är en tumörspecifik mutation eller kopietal variation närvarande uteslutande i tumörcellerna men inte i icke-tumörceller. En sådan genetisk stigma kan tillförlitligt och exakt kvantifieras, till exempel, med hjälp av digital PCR såsom visats i denna studie.
För digital PCR, är inte väsentligt hög renhet av DNA. Emellertid avsaltning och avlägsnande inhiberande molekyler är nödvändigt vilket kan uppnås genom en drop-dialys med användning av ett lämpligt filter. Den kombinerade lys och drop-dialys är enkel och snabb, kräver inga speciella instrument och kan därför utföras i någon standard laboratorium. Om cellerna inte break väl, kan ytterligare behandling övervägas, såsom frysning av cellerna vid -20 ° C, tillsätta tvättmedel och / eller med hjälp av proteas.
I den aktuella studien var heterozygot deletion av NF1-genen används som tumörspecifika funktion för kvantifiering. På liknande sätt kan deletioner av andra gener eller loci också användas. Vidare kan mutationer också användas för kvantifiering av tumörceller. I ett sådant fall, digital PCR-analyser för mutanten och de normala alleler måste utsträckning valideras för att garantera deras specificitet för var och en av dem.
Dosberoende andel av tumörceller ger en indikation på drug specificitet eller selektivitet. Vidare möjliggör det också att extrahera svar av tumörceller från svars av totala celler av en blandad kultur till ett läkemedel (figur 4). Denna extraktion strategi ger en lösning för det tekniska problemet i att använda primära odlingar (som innehåller både tumör och ingenn-tumörceller) för drogtestning.
Den genetic- och cellbaserade in vitro verktyg visats i denna studie kan därför ha tillämpning potential (1) i läkemedelsupptäckt där det ger en plattform för att bedöma läkemedels specificitet eller selektivitet in vitro och (2) i personlig cancervård där det möjliggör att testa läkemedel i primära kulturer och därmed kan bidra till narkotika val i adjuvant kemoterapi fyra. Vidare kan studeras farmakologiska verkningsmekanismen ett läkemedel med hjälp av detta verktyg, eftersom vissa genetisk förändring eller flera genetiska förändringar kan följas under läkemedelsbehandling.
En svårighet i att använda individualiserade primära odlingar är bristen en universell genetiska särdrag för kvantifiering av tumörcellerna. Men med dagens förväg i hel-genomet sekvensering, är de mest förändrade gener och regioner kända för vanliga tumörer. Till exempel bland huvud och halstumörer, 71%, 23% och 22% har mutationer i TP53, FAT1 och CDKN2A gener, och 60%, 34% och 26% har deletioner i genen regionerna CDKN2A, STK11 och PTEN, respektive 10. Screening 5 till 10 sådana gener eller / och områden med hjälp av riktade-sekvensering och / eller digital PCR kommer därför sannolikt att identifiera en eller flera genetiska förändringar som kan användas för kvantifiering av tumörceller i den härledda primärkulturen. En annan begränsning är ofta otillräcklig mängd utskurna tumörer för att ställa upp primära kulturer.
Trots de fördelaktiga egenskaper och lovande tillämpning potential genetic- och cellbaserade in vitro verktyg, bör dess begränsningar hållas i åtanke och dess in vitro karaktär bör betonas. Till exempel, de differentiella effekter eller cytotoxicitet av ett läkemedel på tumörceller kan snarare på grund av skillnaden i celltyper (fibroblaster kontra Schwann-celler) eller derasolika ursprung (från olika individer). Den starkare effekten av ett läkemedel på tumörceller än på icke-tumörceller kan också förklaras av det faktum att den förra växer snabbare än de senare. Viktigast celler in vitro beteende skiljer sig än celler i människokroppen och därmed resultaten av in vitro-bedömning gör ofta inte alls eller bara delvis återspeglar den verkliga kliniska situationen. Därför, effekt, cytotoxicitet och specificitet av läkemedel erhölls för odlade celler är ganska av biomarkörer naturen men som inte har tillförlitligheten av prekliniskt uppmätt effekt av antibiotika. Ändå flyttar från cellinjer till blandade kulturer och / eller primära kulturer är ett steg framåt för att bedöma läkemedelseffekt och specificitet / selektivitet in vitro. Med omfattande insatser, in vitro förhållanden kan hittas som möjliggör rimlig korrelation av data in vitro med riktiga svaren från patienter, åtminstone för vissa läkemedel.
Acknowledgments
Fru Alster, Mr Honrath och Dr. Jiang uppskattas för sin enastående teknisk assistans. Också uppskattat är Dr. Volz och forskargruppen Dr Dandri för att ge tillgång till sin digitala PCR-enhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | For drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| Pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).
- McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Edwards, A. M., et al. Preclinical target validation using patient-derived cells. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).
- Frahm, S., et al. Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients. Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).
- Jiang, W., et al. Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro. J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).
- Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures. J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).
- Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).
- Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
- Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).
