L'objectif de ce protocole est d'évaluer la spécificité des médicaments anticancéreux in vitro en utilisant des cultures mixtes contenant des cellules tumorales à la fois et non tumorales.
Un procédé permettant d' évaluer la spécificité de médicaments anticancéreux in vitro en utilisant des cultures contenant des cellules à la fois tumorales et non tumorales est démontrée. L'élément clé est la détermination quantitative d'une altération génétique spécifique de la tumeur par rapport à une séquence universelle utilisant un essai de PCR numérique bi-sonde et le calcul subséquent de la proportion de cellules tumorales. L'essai est effectué sur une culture contenant des cellules tumorales d'une lignée établie et dopés dans des cellules non tumorales. La culture mixte est traitée avec un médicament d'essai à diverses concentrations. Après le traitement, l'ADN est préparé directement à partir des cellules adhérentes ont survécu dans les puits de plaques à 96 puits en utilisant une méthode simple et peu coûteuse, et on le soumet à un test de PCR numérique bi-sonde pour mesurer une modification génétique spécifique de la tumeur et une séquence universelle de référence . Dans la présente démonstration, une délétion hétérozygote du gène NF1 est utilisé en tant que l'altération génétique spécifique de la tumeur etRPP30 un gène en tant que gène de référence. En utilisant le rapport NF1 / RPP30, la proportion de cellules tumorales a été calculée. Etant donné que le changement de dose-dépendante de la proportion de cellules tumorales fournit une indication de la spécificité in vitro du médicament, cet essai in vitro génétique et à base de cellules aura probablement un potentiel d'application dans la découverte de médicaments. En outre, pour le cancer de soins personnalisé, cet outil genetic- et à base de cellules peut contribuer à l'optimisation de la chimiothérapie adjuvante au moyen de tests d'efficacité et la spécificité des médicaments candidats en utilisant des cultures primaires de tumeurs individuelles.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
L'étape clé dans cet outil genetic- et à base de cellules pour évaluer la spécificité des médicaments in vitro est la détermination de la proportion de cellules tumorales en utilisant une ou plusieurs caractéristiques génétiques spécifiques de la tumeur. Contrairement aux caractéristiques classiques phénotypiques 7, les caractéristiques génétiques sont spécifiques, stable et facile à quantifier. Par exemple, une mutation ou d'une variation du nombre de copies spécifique à la tumeur est présent exclusivement dans les cellules tumorales, mais non dans des cellules non tumorales. Un tel stigmate génétique peut être quantifié de manière fiable et précise, par exemple, en utilisant la PCR numérique tel que démontré dans la présente étude.
Pour la PCR numérique, une grande pureté de l'ADN ne soit pas essentiel. Cependant, le dessalage et l'élimination des molécules inhibitrices sont nécessaires, qui peut être atteint par une goutte à la dialyse à l'aide d'un filtre approprié. La lyse et d'abandon dialyse combinée est simple et rapide, ne nécessite pas d'instruments spéciaux et peut donc être effectuée dans un laboratoire standard. Si les cellules ne sont pas Break puits, un traitement supplémentaire peut être considérée comme la congélation des cellules à -20 ° C, en ajoutant un détergent et / ou en utilisant la protéase.
Dans la présente étude, la délétion hétérozygote du gène NF1 a été utilisé comme caractéristique spécifique à une tumeur pour la quantification. De même, des deletions d'autres gènes ou locus peuvent également être utilisés. En outre, des mutations peuvent également être utilisées pour quantifier les cellules tumorales. Dans ce cas, des essais de PCR numériques pour le mutant ainsi que les allèles normaux ont besoin d'être largement utilisée pour assurer leur spécificité pour chacun d'eux.
la proportion dépendant de la dose de cellules tumorales fournit une indication de la spécificité des médicaments ou de la sélectivité. En outre, elle permet également d' extraire une réponse de cellules tumorales à partir de la réponse des cellules totales d'une culture mélangée à un médicament (figure 4). Cette stratégie d'extraction fournit une solution pour le problème technique dans l'utilisation de cultures primaires (qui contient à la fois la tumeur et nonn cellules de la tumeur) pour le dépistage des drogues.
La base de cellules genetic- et outil vitro démontré dans la présente étude peut donc avoir un potentiel d'application (1) dans la découverte de médicaments , où il fournit une plate – forme pour l' évaluation de la spécificité de la drogue ou la sélectivité in vitro et (2) dans le traitement personnalisé du cancer où il permet des médicaments d'essai dans des cultures primaires et par conséquent peut contribuer à la drogue sélection dans la chimiothérapie adjuvante 4. En outre, le mécanisme pharmacologique d'un médicament peut être étudié à l'aide de cet outil, car certaines modifications génétiques ou des altérations génétiques multiples peuvent être suivies au cours du traitement de la toxicomanie.
Une difficulté dans l'utilisation de cultures primaires individualisées est l'absence d'une caractéristique génétique universel pour la quantification de cellules tumorales. Cependant, avec l'avance d'aujourd'hui dans le séquençage du génome entier, les gènes et les régions les plus fréquemment modifiés sont connus pour les tumeurs communes. Par exemple, parmi la tête et du coutumeurs, 71%, 23% et 22% ont des mutations dans le TP53, FAT1 et gènes CDKN2A, et 60%, 34% et 26% ont des délétions dans les régions de gènes de CDKN2A, STK11 et PTEN, respectivement 10. Criblage de 5 à 10 ces gènes et / ou des régions au moyen d'un séquençage ciblé et / ou une PCR numérique risque donc d'identifier une ou plusieurs altérations génétiques qui peuvent être utilisées pour la quantification de cellules tumorales dans la culture primaire dérivée. Une autre limite est la quantité souvent insuffisante des tumeurs réséquées pour la mise en place des cultures primaires.
Malgré les caractéristiques avantageuses et le potentiel d'application prometteuse du genetic- et dans l' outil vitro à base de cellules, ses limites doivent être gardés à l' esprit et sa nature in vitro doit être soulignée. Par exemple, les effets différentiels ou de la cytotoxicité d'un médicament sur les cellules tumorales peuvent plutôt due à la différence dans les types de cellules (fibroblastes par rapport aux cellules de Schwann) ou de leurorigines différentes (à partir de différents individus). L'effet plus fort d'un médicament sur les cellules tumorales que sur des cellules non tumorales peut également être expliquée par le fait que le premier croître plus vite que ce dernier. Plus important encore , les cellules dans le comportement in vitro diffère que les cellules dans le corps humain et par conséquent, les résultats d' une évaluation in vitro font souvent pas ou seulement partiellement le reflet de la situation clinique réelle. Par conséquent, l'efficacité et la spécificité cytotoxicité des médicaments obtenus pour les cellules en culture sont plutôt de nature biomarqueur mais ne possèdent pas la fiabilité de l'efficacité préclinique mesurée des antibiotiques. Néanmoins, le déplacement de lignées cellulaires à des cultures mixtes et / ou des cultures primaires est un pas en avant dans l' évaluation des médicaments à effet et la spécificité / sélectivité in vitro. Avec des efforts considérables, dans des conditions in vitro peut être trouvée qui permet une corrélation raisonnable des données in vitro avec des réponses réelles des patients, au moins pour certains médicaments.
The authors have nothing to disclose.
Mme Alster, M. Honrath et le Dr Jiang sont appréciés pour leur assistance technique exceptionnelle. Aussi apprécié est le Dr Volz et le groupe de recherche du Dr Dandri pour fournir l'accès à leur appareil PCR numérique.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |