Målet med denne protokol er at vurdere specificitet lægemidler mod cancer in vitro ved hjælp af blandede kulturer, der indeholder både tumor og ikke-tumorceller.
En procedure til vurdering specificiteten af anticancerlægemidler in vitro under anvendelse kulturer indeholdende både tumor- og ikke-tumorceller er dokumenteret. Det centrale element er den kvantitative bestemmelse af en tumor-specifik genetisk ændring i forhold til en universel sekvens under anvendelse af en dual-probe digital PCR-assay og den efterfølgende beregning af andelen af tumorceller. Assayet udføres på en kultur indeholdende tumorceller af en etableret linje og spiked-i ikke-tumorceller. Den blandede kultur behandles med et forsøgslægemiddel i forskellige koncentrationer. Efter behandlingen er DNA fremstilles direkte ud fra de overlevede klæbende celler i brønde på plader med 96 brønde under anvendelse af en enkel og billig metode og underkastet en dual-probe digital PCR assay til måling af en tumor-specifik genetisk ændring og en reference universel sekvens . I den foreliggende demonstration, er en heterozygot deletion af NF1 genet anvendes som det tumorspecifikke genetisk ændring ogen RPP30 gen som reference gen. Anvendelse af forholdet NF1 / RPP30 blev andelen af tumorceller beregnet. Da den dosisafhængige ændringer af andelen af tumorceller tilvejebringer en in vitro indikation for specificitet af lægemidlet, vil denne genetiske og cellebaserede in vitro assay sandsynligvis have potentiel anvendelse i lægemiddelforskning. Desuden er der for personlig kræft-pleje, kan dette genetic- og celle-baseret værktøj til at optimere adjuverende kemoterapi ved hjælp af effektivitet og specificitet lægemiddelkandidater test ved hjælp af primære kulturer af individuelle tumorer.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
Nøglen skridt i denne genetic- og cellebaseret værktøj til vurdering lægemiddel specificitet in vitro er bestemmelsen af andelen af tumorceller ved anvendelse af en eller flere tumorspecifikke genetiske anlæg. I modsætning til konventionelle fænotypiske træk 7, genetiske anlæg er specifikke, stabil og let at kvantificere. For eksempel en tumor-specifik mutation eller kopital variation er til stede udelukkende i tumorceller, men ikke i ikke-tumorceller. En sådan genetisk stigma kan pålideligt og præcist kvantificeres, for eksempel ved anvendelse digital PCR som påvist i denne undersøgelse.
Til digital PCR, høj renhed af DNA er ikke afgørende. Men afsaltning og fjernelse inhibitoriske molekyler er nødvendigt, og som kan opnås ved en drop-dialyse under anvendelse af et passende filter. Den kombinerede lysis og drop-dialyse er enkel og hurtig, kræver ingen særlige instrumenter, og derfor kan udføres i enhver standard laboratorium. Hvis cellerne ikke break godt, kan yderligere behandling betragtes som frysning af cellerne ved -20 ° C, tilsætning af detergent eller / og ved anvendelse af protease.
I den foreliggende undersøgelse blev den heterozygote deletion af NF1 genet anvendes som det tumor-specifikt træk til kvantificering. Tilsvarende kan også anvendes deletioner af andre gener eller loci. Desuden kan mutationer også anvendes til kvantificering af tumorceller. I så fald digitale PCR assays for mutanten og de normale alleler skal ekstensivt valideres for at sikre deres specificitet for hver af dem.
Dosisafhængig andel af tumorceller tilvejebringer en indikation for lægemiddel-specificitet eller selektivitet. Desuden er det også muligt at ekstrahere respons af tumorceller fra responset af totale celler fra en blandet kultur til et lægemiddel (figur 4). Denne ekstraktion strategi tilvejebringer en løsning på det tekniske problem i at bruge primære kulturer (som indeholder både tumor og ingenn-tumor-celler) for lægemiddel-testning.
Den genetic- og cellebaserede in vitro værktøj demonstreret i den foreliggende undersøgelse kan derfor have mulig anvendelse (1) i lægemiddel-discovery, hvor det giver en platform til at vurdere drug specificitet eller selektivitet in vitro og (2) i personlig kræftbehandling, hvor det muliggør test narkotika i primære kulturer og dermed kan bidrage til lægemiddel-selektion i adjuverende kemoterapi 4. Endvidere kan farmakologiske af et lægemiddel skal undersøges ved hjælp af dette værktøj, da visse genetiske ændring eller flere genetiske ændringer kan følges under lægemiddel-behandling.
En vanskelighed ved anvendelse af individualiserede primære kulturer er manglen en universel genetisk funktion til kvantificering af tumorcellerne. Men med dagens forhånd i hel-genom-sekventering, de hyppigst ændrede gener og regioner er kendt for almindelige tumorer. For eksempel blandt hoved og halstumorer, 71%, 23% og 22% har mutationer i TP53, -fedt1 og CDKN2A gener og 60%, 34% og 26% har sletninger i genet regioner CDKN2A, STK11 og PTEN henholdsvis 10. Screening 5 til 10 sådanne gener og / eller regioner gennem målrettet-sekventering eller / og digital PCR vil derfor sandsynligvis identificere en eller flere genetiske ændringer, der kan anvendes til kvantificering af tumorceller i den afledte primære kultur. En anden begrænsning er det ofte utilstrækkelig mængde resektion tumorer til opsætning primære kulturer.
Trods de fordelagtige egenskaber og lovende anvendelse potentiale genetic- og cellebaserede in vitro værktøj, bør dens begrænsninger skal holdes for øje, og dens in vitro natur bør fremhæves. For eksempel er de differentielle virkninger eller cytotoksicitet af et lægemiddel på tumorceller kan snarere skyldes forskelle i celletyper (fibroblaster vs. Schwann-celler) eller deresforskellige oprindelser (fra forskellige individer). Jo stærkere virkningen af et lægemiddel på tumorceller end på ikke-tumorceller kan også forklares ved, at førstnævnte vokse hurtigere end sidstnævnte. Vigtigst celler in vitro adfærd afviger end celler i den menneskelige krop og dermed resultaterne af in vitro-bedømmelse ofte ikke eller kun delvist afspejler den reelle kliniske situation. Derfor virkningsfuldhed, cytotoksicitet og specificitet af lægemidler opnået for dyrkede celler er temmelig af biomarkør natur, men ikke har pålideligheden af præklinisk målte effekt af antibiotika. Ikke desto mindre, flytter fra cellelinier til blandede kulturer og / eller primære kulturer er et skridt fremad i vurderingen af narkotika effekt og specificitet / selektivitet in vitro. Med omfattende indsats, kan in vitro betingelser findes som muliggør en rimelig korrelation af in vitro-data med virkelige svarene fra patienter, i det mindste for nogle lægemidler.
The authors have nothing to disclose.
Fru Alster, Mr. Honrath og Dr. Jiang er værdsat for deres enestående teknisk bistand. Også værdsat er Dr. Volz og forskningsgruppen Dr. Dandri for at give adgang til deres digitale PCR-enhed.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |