Summary
Målet med denne protokol er at vurdere specificitet lægemidler mod cancer in vitro ved hjælp af blandede kulturer, der indeholder både tumor og ikke-tumorceller.
Abstract
En procedure til vurdering specificiteten af anticancerlægemidler in vitro under anvendelse kulturer indeholdende både tumor- og ikke-tumorceller er dokumenteret. Det centrale element er den kvantitative bestemmelse af en tumor-specifik genetisk ændring i forhold til en universel sekvens under anvendelse af en dual-probe digital PCR-assay og den efterfølgende beregning af andelen af tumorceller. Assayet udføres på en kultur indeholdende tumorceller af en etableret linje og spiked-i ikke-tumorceller. Den blandede kultur behandles med et forsøgslægemiddel i forskellige koncentrationer. Efter behandlingen er DNA fremstilles direkte ud fra de overlevede klæbende celler i brønde på plader med 96 brønde under anvendelse af en enkel og billig metode og underkastet en dual-probe digital PCR assay til måling af en tumor-specifik genetisk ændring og en reference universel sekvens . I den foreliggende demonstration, er en heterozygot deletion af NF1 genet anvendes som det tumorspecifikke genetisk ændring ogen RPP30 gen som reference gen. Anvendelse af forholdet NF1 / RPP30 blev andelen af tumorceller beregnet. Da den dosisafhængige ændringer af andelen af tumorceller tilvejebringer en in vitro indikation for specificitet af lægemidlet, vil denne genetiske og cellebaserede in vitro assay sandsynligvis have potentiel anvendelse i lægemiddelforskning. Desuden er der for personlig kræft-pleje, kan dette genetic- og celle-baseret værktøj til at optimere adjuverende kemoterapi ved hjælp af effektivitet og specificitet lægemiddelkandidater test ved hjælp af primære kulturer af individuelle tumorer.
Protocol
1. Forberedelse Mix Culture indeholder både tumorceller og ikke-tumorceller
- Brug tumorceller fra en etableret cellelinje MPNST S462 5. Brug fibroblaster som de ikke-tumorceller 6,7
- Kultur både tumorceller og fibroblaster i standard DMEM-medium med 10% føtalt bovint serum (BSA), 3 mM glutamin, 0,1 mM 2-mercaptoethanol, 500 U / ml penicillin, 500 g / ml streptomycin og 1 mM natriumpyruvat ved 37 ° C og 5% CO2 5-7. Ved sub-sammenløbet, høste cellerne med 0,05% trypsin og tælle dem ved hjælp af et hæmocytometer.
- Bland 400 tumorceller og 1.600 ikke-tumorceller sammen i hver brønd på en 96-brønds kulturplade i 0,2 ml medium. Overvejer hurtigere vækst af tumorceller i perioden af 5 dages behandling, blev den initiale del af tumorceller fastsættes til 25%. Opsætning 4 replikater for hver koncentration lægemiddel. Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO 2 O / N.
2. Drug Behandling
- Brug nilotinib som testen stof. Forbered stamopløsninger af 0, 2, 4 og 20 mM nilotinib i DMSO. Fortynd hver af dem ved 200 gange i 5 ml DMEM-medium, hvilket giver 2-gange koncentreret drug-opløsninger af 0, 10, 20 og 100 uM 6.7.
- Fjern 0,1 ml medium fra hver brønd og tilsæt 0,1 ml medium indeholdende lægemiddel. De endelige koncentrationer er 0, 5, 10 og 50 uM. Fortsæt inkubation af cellerne i medium indeholdende lægemiddel i 5 dage.
- Ved afslutningen af behandlingen, inspicere de vedhæftede celler ved hjælp af et fasekontrast-mikroskop og tage billeder. Aspirer mediet væk, vaskes overlevede klæbende celler en gang med 0,2 ml PBS.
3. Forberedelse DNA for Digital PCR
- Lyserer celler under anvendelse HotShot 8.
- Der tilsættes 50 pi alkalisk lysis-opløsning (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) til hver brønd. Forsegl brøndene med folie. Inkubér pladen ved 95 ° C i en ovn eller på en varmeplade i 30 min. Check under et microscope at sikre, at der ikke mere intakte celler forblev på overfladen af brøndene. I tilfælde af at cellerne ikke lyserer fuldstændigt, øge varme tid eller tilføje vaskemiddel. Fryse dem én gang ved -20 ° C forbedrer også bryde celler.
- Tilsæt 50 pi neutraliserende opløsning (40 mM Tris-HC, pH 4,0) til hver brønd. Overfør alle lysater i U-form brønde i en PCR-plade og tør i en PCR variator ved 95 ° C i 10 til 30 min. Rekonstituér lysaterne med 20 pi destilleret vand.
- Afsalte hjælp Drop-Dialyse 9
- bruge membranfiltre med middelporestørrelse 0,025 um.
- Float filteret destilleret vand med skinnende side op i brønde i en 12-brønds plade. Fugt filteret i 5 minutter. Vær opmærksom på at undgå luftbobler mellem filter og vand.
- Pipetter de rekonstituerede lysater af hver prøve fra trin 3.1.4 omhyggeligt onto på hver af de 4 områder af filteret. Dæk pladen og dialyseres i 30 til 60 min.
- Suck væk vandet under filteret uden flipping over filteret eller forstyrre dråber.
- Overfør lysatet-dråber i brønde på en ny PCR-plade. Tør de DNA-dråber ved opvarmning ved 95 ° C i 10 til 30 min i en PCR cykliseringsapparat. Rekonstituer lysaterne i 10 pi vand.
4. Digital PCR
- Optø frosne komponenter såsom DNA, buffer og assayblandingen ved stuetemperatur, spin ned i 10 sekunder ved maksimal kraft på enhver tilgængelig centrifuge (f.eks VWR mini centrifuge) og derefter holde dem på is.
- Forbered mester blanding indeholdende alle komponenter undtagen DNA (Tabel 1). Overvej dødvolumen og beregne mester blanding ca. 10% mere end det krævede beløb.
BEMÆRK: Brug primere og prober, der anvendes i den kommercielle kit. - Vortex master blanding, spin ned i 10 sekunder ved maksimal kraft på enhver tilgængelig centrifuge (f.eks VWR mini centrifuge) og dispensere 15 pi til hverbrønd i en 96-PCR-plade. Tilføj alle lysat (som indeholder DNA) af hver prøve til brøndene indeholdende master blanding. Transfer 20 pi af hver reaktionsblanding i en brønd på prøvesiden af en patron ved stuetemperatur.
- Dispensere 70 pi lille dråbe generator olie i hver brønd på olien side af en patron. Luk patronen med pakningen og placer indstillingen hele ind i en dråbe generator. Start dråbe generation.
- Transfer 40 pi dråbe-opløsning i brønde i en 96-brønds PCR-plade. Forsegl pladen med en folie og læg pladen i en PCR cycler. Indstil låget temperatur ved 105 ° C og rampe rate ved 2 ° C / sek. Udføre PCR under anvendelse af indstillingerne i tabel 2. Efter PCR, overføre pladen til en dråbe læser og begynde at læse. Alternativt opbevares pladen ved 4 ° C i op til 24 timer.
5. Beregning Andel af tumorceller
- Læg den digitale PCR-data og udføre automatiske analyser.
- Kontrollere resultaterne af hvert assay manuelt ved at inspicere den endimensionale og 2-dimensional fordeling af de positive og negative dråber, og sikre, at de er godt adskilt og grænsen linjer var i de rigtige positioner. Udeluk resultater ikke opfylder kriterierne for eksempel ingen klar adskillelse af positive og negative dråber, fra yderligere analyse. Kopier den resulterende forholdet NF1 / RPP30 i et excel ark.
- Beregn andelen af tumorceller som: 2 x (1- NF1 / RPP30).
6. Dosisafhængig Ændring af Andel af tumorceller
- For hvert lægemiddel-koncentration, beregne middelværdi og standardafvigelse fra de 4 gentagelser. Plot midlerne og standardafvigelserne mod narkotika-koncentrationer.
Representative Results
Kvaliteten af DNA fremstillet ved anvendelse af kombineret HotShot / Drop-Dialyse er tilstrækkelig til tilfredsstillende digital PCR (figur 1B). For 2.000 fibroblaster, cirka 3000 ± 500 positive dråber blev opnået, svarende til 75% af de forventede 4.000 eksemplarer (to kopier i en celle). I denne undersøgelse tumorcellerne var fra en etableret linje MPNST S462, som vides at have en heterozygotisk deletion af NF1 genet 5. Dette gen dosisreduktion 50% blev klart detekteret af dobbelt digital PCR-assay (figur 1B). Derimod blev to kopier af dette gen målt i fibroblaster. Denne genetiske forskel mellem tumor og ikke-tumorceller muliggør beregning af andelen af tumorceller i blandede kulturer (figur 2). Ved at måle den relative gendosis af NF1 til RPP30, kan bestemmes andelen af tumorceller i en blandet kulturved hvert lægemiddel-koncentration (figur 3).
Figur 1. Digital PCR. (A) illustration af princippet. (B) en dual-sonde analysen afslører reduceret mængde af et mål (NF1) gen i tumorceller MPNST S462 i forhold til en reference (RPP30) genet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. beregnede brøkdel af tumorceller. Tumorceller og ikke-tumorceller blev blandet i forskellige forhold og udsået i hver brønd af en 96-plade. Efter fastgørelse O / N, blev cellerne lyseret with HotShot / Drop-dialyse og afsaltet lysater blev udsat for digital PCR som gav forholdet NF1 / RPP30. Base på dette forhold, blev andelen af tumorceller i hver brønd beregnet. Middelværdi og standardafvigelse af andelen af tumorceller blev beregnet ud fra fire replikater ved hver opsætning andel. De beregnede andele af tumorceller (Y-akse) blev plottet mod de set-up proportioner (X-akse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dosis-afhængig Ændring af Andel af tumorceller. (A) dosisafhængig reduktion af synlige vitale celler. (B) andel af tumorceller (gennemsnit og standardafvigelse af 4 replikater), beregnet i Forholdet NF1: RPP30, faldt i området fra 0 - 10 pM. Ved den højeste dosis 50 uM blev nogle vitale celler til venstre, sandsynligvis på grund af giftvirkning til alle celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 4. Adskillelse Reaktion af tumorceller fra den af ikke-tumorceller (A) levedygtighed eller / og proliferation af totale celler kan måles ved anvendelse af konventionelle assays; Andel af tumorceller kan bestemmes ved anvendelse af fremgangsmåden demonstreret i den foreliggende undersøgelse. (B) ved hjælp af to parametre, kan reaktion af totale celler i en blandet kultur til et lægemiddel opdeles i reaktion af tumorcellerne og reaktion af de ikke-tumorceller..com / filer / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| 1 Reaktion | ||
| 2 x ddPCR Supermix | 12 | |
| Assay mix for NF1 | 1.2 | |
| Assay mix for RPP30 | 1.2 | |
| HaeIII | 0,6 | |
| Subtotal | 15 | Master blanding |
| DNA | 9 | |
| Total | 24 | Final PCR Blanding |
Tabel 1 Opsætning Dual ddPCR Reaction
| Trin | Handling | Temperatur | Tid | Cykler |
| 1 | Polymslette aktivering | 95 ° C | 10 min | 1 |
| 2 | DNA denaturering | 94 ° C | 30 sek | 40 |
| 3 | Hydraulik / exetension | 60 ° C | 1 min | |
| 4 | Polymerase deaktivering | 98 ° C | 10 min | 1 |
| 5 | Hold (valgfrit) | 4 ° C |
Tabel 2 PCR Cycler Indstillinger
Discussion
Nøglen skridt i denne genetic- og cellebaseret værktøj til vurdering lægemiddel specificitet in vitro er bestemmelsen af andelen af tumorceller ved anvendelse af en eller flere tumorspecifikke genetiske anlæg. I modsætning til konventionelle fænotypiske træk 7, genetiske anlæg er specifikke, stabil og let at kvantificere. For eksempel en tumor-specifik mutation eller kopital variation er til stede udelukkende i tumorceller, men ikke i ikke-tumorceller. En sådan genetisk stigma kan pålideligt og præcist kvantificeres, for eksempel ved anvendelse digital PCR som påvist i denne undersøgelse.
Til digital PCR, høj renhed af DNA er ikke afgørende. Men afsaltning og fjernelse inhibitoriske molekyler er nødvendigt, og som kan opnås ved en drop-dialyse under anvendelse af et passende filter. Den kombinerede lysis og drop-dialyse er enkel og hurtig, kræver ingen særlige instrumenter, og derfor kan udføres i enhver standard laboratorium. Hvis cellerne ikke break godt, kan yderligere behandling betragtes som frysning af cellerne ved -20 ° C, tilsætning af detergent eller / og ved anvendelse af protease.
I den foreliggende undersøgelse blev den heterozygote deletion af NF1 genet anvendes som det tumor-specifikt træk til kvantificering. Tilsvarende kan også anvendes deletioner af andre gener eller loci. Desuden kan mutationer også anvendes til kvantificering af tumorceller. I så fald digitale PCR assays for mutanten og de normale alleler skal ekstensivt valideres for at sikre deres specificitet for hver af dem.
Dosisafhængig andel af tumorceller tilvejebringer en indikation for lægemiddel-specificitet eller selektivitet. Desuden er det også muligt at ekstrahere respons af tumorceller fra responset af totale celler fra en blandet kultur til et lægemiddel (figur 4). Denne ekstraktion strategi tilvejebringer en løsning på det tekniske problem i at bruge primære kulturer (som indeholder både tumor og ingenn-tumor-celler) for lægemiddel-testning.
Den genetic- og cellebaserede in vitro værktøj demonstreret i den foreliggende undersøgelse kan derfor have mulig anvendelse (1) i lægemiddel-discovery, hvor det giver en platform til at vurdere drug specificitet eller selektivitet in vitro og (2) i personlig kræftbehandling, hvor det muliggør test narkotika i primære kulturer og dermed kan bidrage til lægemiddel-selektion i adjuverende kemoterapi 4. Endvidere kan farmakologiske af et lægemiddel skal undersøges ved hjælp af dette værktøj, da visse genetiske ændring eller flere genetiske ændringer kan følges under lægemiddel-behandling.
En vanskelighed ved anvendelse af individualiserede primære kulturer er manglen en universel genetisk funktion til kvantificering af tumorcellerne. Men med dagens forhånd i hel-genom-sekventering, de hyppigst ændrede gener og regioner er kendt for almindelige tumorer. For eksempel blandt hoved og halstumorer, 71%, 23% og 22% har mutationer i TP53, -fedt1 og CDKN2A gener og 60%, 34% og 26% har sletninger i genet regioner CDKN2A, STK11 og PTEN henholdsvis 10. Screening 5 til 10 sådanne gener og / eller regioner gennem målrettet-sekventering eller / og digital PCR vil derfor sandsynligvis identificere en eller flere genetiske ændringer, der kan anvendes til kvantificering af tumorceller i den afledte primære kultur. En anden begrænsning er det ofte utilstrækkelig mængde resektion tumorer til opsætning primære kulturer.
Trods de fordelagtige egenskaber og lovende anvendelse potentiale genetic- og cellebaserede in vitro værktøj, bør dens begrænsninger skal holdes for øje, og dens in vitro natur bør fremhæves. For eksempel er de differentielle virkninger eller cytotoksicitet af et lægemiddel på tumorceller kan snarere skyldes forskelle i celletyper (fibroblaster vs. Schwann-celler) eller deresforskellige oprindelser (fra forskellige individer). Jo stærkere virkningen af et lægemiddel på tumorceller end på ikke-tumorceller kan også forklares ved, at førstnævnte vokse hurtigere end sidstnævnte. Vigtigst celler in vitro adfærd afviger end celler i den menneskelige krop og dermed resultaterne af in vitro-bedømmelse ofte ikke eller kun delvist afspejler den reelle kliniske situation. Derfor virkningsfuldhed, cytotoksicitet og specificitet af lægemidler opnået for dyrkede celler er temmelig af biomarkør natur, men ikke har pålideligheden af præklinisk målte effekt af antibiotika. Ikke desto mindre, flytter fra cellelinier til blandede kulturer og / eller primære kulturer er et skridt fremad i vurderingen af narkotika effekt og specificitet / selektivitet in vitro. Med omfattende indsats, kan in vitro betingelser findes som muliggør en rimelig korrelation af in vitro-data med virkelige svarene fra patienter, i det mindste for nogle lægemidler.
Acknowledgments
Fru Alster, Mr. Honrath og Dr. Jiang er værdsat for deres enestående teknisk bistand. Også værdsat er Dr. Volz og forskningsgruppen Dr. Dandri for at give adgang til deres digitale PCR-enhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | For drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| Pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).
- McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Edwards, A. M., et al. Preclinical target validation using patient-derived cells. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).
- Frahm, S., et al. Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients. Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).
- Jiang, W., et al. Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro. J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).
- Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures. J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).
- Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).
- Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
- Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).
