Das Ziel dieses Protokolls ist die Spezifität von Antikrebs – Arzneimittel in vitro zu beurteilen , Mischkulturen unter Verwendung von sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält.
Ein Verfahren für die Spezifität der Antikrebs – Arzneimittel in vitro Beurteilung unter Verwendung von Kulturen sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält , nachgewiesen wird . Das Schlüsselelement ist die quantitative Bestimmung eines tumorspezifische genetische Veränderung in Bezug auf eine universelle Sequenz, die ein Dual-Sonde digitalen PCR-Assay und die nachfolgende Berechnung des Anteils der Tumorzellen verwendet wird. Der Test wird auf einem Kulturzellen einer etablierten Linie enthaltenden Tumors durchgeführt und versetzt in Nicht-Tumorzellen. Die Mischkultur wird in verschiedenen Konzentrationen mit einem Testwirkstoff behandelt. Nach der Behandlung wird die DNA auf eine Dual-Sonde digitalen PCR Assay direkt von den überlebt Klebstoff Zellen in Wells von 96-Well-Platten eine einfache und kostengünstige Methode und unterzogen unter Verwendung eines tumorspezifische genetische Veränderung und eine Referenz universelle Sequenz zur Messung . In der vorliegenden Demonstration, eine heterozygote Deletion des NF1 – Gens wird als tumorspezifische genetische Veränderung verwendet , undein RPP30 Gen als Referenz – Gen. Verwendung des Verhältnisses NF1 / RPP30 wurde der Anteil der Tumorzellen berechnet. Da die dosisabhängige Veränderung des Anteils der Tumorzellen für die Spezifität des Medikaments eine in vitro Anzeige liefert, diese genetische und zellbasierten in vitro – Assay wird wahrscheinlich Anwendungspotential in der Wirkstoffforschung. Darüber hinaus für die personalisierte Krebsfürsorge, diese Gen- und Zell-basiertes Tool kann zur Optimierung der adjuvanten Chemotherapie durch Prüfung der Wirksamkeit und Spezifität von Wirkstoffkandidaten mit Primärkulturen von einzelnen Tumoren beitragen.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
Der Schlüsselschritt in dieser Gen- und zellbasierte Werkzeug für die Beurteilung der Arzneimittelspezifität in vitro ist die Bestimmung des Anteils der Tumorzellen mit einem oder mehreren Tumor-spezifischen genetischen Merkmale. Im Gegensatz zu herkömmlichen phänotypischen Merkmale 7, sind genetische Merkmale spezifische, stabil und einfach zu quantifizieren. Zum Beispiel ist eine tumorspezifische Mutation oder Veränderung der Kopienzahl vorhanden ausschließlich in die Tumorzellen, jedoch nicht in Nicht-Tumorzellen. Eine solche genetische Stigma zuverlässig werden kann und genau quantifiziert werden, beispielsweise digitale PCR unter Verwendung der in dieser Studie nachgewiesen.
Für die digitale PCR ist eine hohe Reinheit der DNA nicht wesentlich. Jedoch sind Entsalzen und Entfernen inhibitorische Moleküle notwendig, die durch einen Tropfendialyse erreicht werden kann, einen geeigneten Filter. Die kombinierte Lyse und Drop-Dialyse ist einfach und schnell, erfordert keine speziellen Instrumente und daher in jedem Standard-Labor durchgeführt werden kann. Wenn die Zellen nicht Break gut, kann eine zusätzliche Behandlung in Betracht gezogen werden, wie die Zellen bei -20 ° C einfrieren, Zugabe von Reinigungsmittel oder / und unter Verwendung von Protease.
In der vorliegenden Studie wurde die heterozygote Deletion des NF1 – Gen als das tumorspezifische Merkmal für die Quantifizierung verwendet. In ähnlicher Weise kann auch verwendet werden, Deletionen anderer Gene oder Loci. Weiterhin Mutationen können auch zur Quantifizierung von Tumorzellen verwendet werden. In einem solchen Fall digital PCR-Assays für die mutierten und die normalen Allele müssen umfassend validiert werden, um ihre Spezifität für jeden von ihnen zu gewährleisten.
Dosisabhängige Anteil der Tumorzellen liefert eine Anzeige für arzneimittel Spezifität oder Selektivität. Darüber hinaus ermöglicht es auch von Tumorzellen aus der Reaktion der gesamten Zellen einer gemischten Kultur mit einem Medikament (4) Extrahieren Antwort. Diese Extraktion Strategie stellt eine Lösung für das technische Problem bei der Verwendung Primärkulturen (die sowohl Tumor enthält und keinn-Tumorzellen) für Drogentests.
Die Gen- und zellbasierten in vitro – Tool in der vorliegenden Studie gezeigt , daher Anwendungspotenzial aufweisen (1) in der Arzneimittelentdeckung , wo es eine Plattform für die Beurteilung der Arzneimittel Spezifität oder Selektivität in vitro und (2) in der personalisierten Krebsbehandlung bietet , wo es ermöglicht die Prüfung Drogen in Primärkulturen und damit zu arzneimittel Auswahl in der adjuvanten Chemotherapie 4 beitragen können. Darüber hinaus können pharmakologische Mechanismus eines Medikaments untersucht werden dieses Werkzeug verwenden, da bestimmte genetische Veränderung oder mehrere genetische Veränderungen können während der Arzneimittelbehandlung folgen.
Eine Schwierigkeit in individualisierter Primärkulturen ist das Fehlen einer universellen genetischen Merkmal für die Quantifizierung der Tumorzellen. Jedoch mit vorab in der heutigen Gesamtgenom-Sequenzierung, die am häufigsten veränderten Gene und Regionen sind für die gemeinsame Tumoren bekannt. Zum Beispiel unter Kopf und HalsTumoren, 71%, 23% und 22% haben Mutationen im TP53, FAT1 und CDKN2A gene, und 60%, 34% und 26% weisen Deletionen in den Genregionen von CDKN2A, STK11 und PTEN bzw. 10. Screenen von 5 bis 10 solcher Gene oder / und Regionen durch gezielte-Sequenzierung oder / und digitale PCR identifiziert daher wahrscheinlich eine oder mehrere genetische Veränderungen, die zur Quantifizierung von Tumorzellen in der abgeleiteten Primärkultur verwendet werden können. Eine weitere Einschränkung ist die oft unzureichende Menge an reseziert Tumoren für Primärkulturen aufzubauen.
Trotz der vorteilhaften Merkmale und viel versprechende Anwendungsmöglichkeiten der Gen- und zellbasierten in vitro – Tool sollte seine Grenzen gehalten werden , in Geist und seine in – vitro – Natur hervorzuheben. Zum Beispiel können die unterschiedlichen Effekte oder Zytotoxizität eines Arzneimittels auf Tumorzellen kann nicht aufgrund des Unterschieds in Zelltypen (Fibroblasten vs. Schwann-Zellen) oder ihreunterschiedlicher Herkunft (von verschiedenen Individuen). Die stärkere Wirkung eines Arzneimittels auf Tumorzellen als auf Nicht-Tumorzellen können auch durch die Tatsache erklärt werden, daß die erstere schneller wachsen als die letzteren. Am wichtigsten ist , Zellen in vitro Verhalten unterscheidet , als Zellen im menschlichen Körper und folglich Ergebnisse der in vitro Beurteilung oft nicht oder nur teilweise den realen klinischen Situation widerzuspiegeln. Daher Wirksamkeit, Zytotoxizität und Spezifität von Medikamenten für kultivierte Zellen erhalten werden, sind eher von biomarker Natur, aber nicht über die Zuverlässigkeit der gemessenen vorklinisch Wirksamkeit von Antibiotika. Dennoch ist Bewegen von Zelllinien zu Mischkulturen und / oder Primärkulturen ein Fortschritt arzneimittel Wirkung und Spezifität / Selektivität in vitro in der Beurteilung. Mit umfangreichen Bemühungen, in vitro Bedingungen können gefunden werden , die eine angemessene Korrelation von in vitro – Daten mit realen Reaktionen von Patienten, zumindest für einige Medikamente ermöglicht.
The authors have nothing to disclose.
Frau Alster, Herr Honrath und Dr. Jiang sind bekannt für ihre hervorragende technische Unterstützung geschätzt. geschätzt Auch Dr. Volz und die Forschungsgruppe von Dr. Dandri für die Bereitstellung der Zugriff auf ihre digitalen PCR-Gerät ist.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |