מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ספציפי של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרבויות מעורבות המכילות הוא גידול ותאי שאינו סרטני.
הליך להערכה ספציפי של תרופות נגד הסרטן במבחנה באמצעות תרביות המכילות גם תאים סרטניים ולא-סרטניים מודגם. אלמנט המפתח הוא נחישות כמותי של שינוי גנטי ספציפי גידול ביחס רצף אוניוורסלי באמצעות assay PCR דיגיטלי כפולה חללית לבין חישוב בדיעבד של הפרופורציה של תאים סרטניים. את assay מתבצעת על תרבות המכילה תאים סרטניים של קו הוקם ומשובץ-בתאים שאינם סרטניים. התרבות המעורבת מטופל בתרופת מבחן בריכוזים שונים. לאחר הטיפול, ה- DNA הוא מוכן ישירות מתאי הדבק שרדו בבארות של צלחות 96-היטב באמצעות שיטה פשוטה וזולה, ועברתי assay PCR הדיגיטלי כפולה בדיקת למדידת שינוי גנטי ספציפי גידול רצף ייחוס אוניוורסלי . בהפגנה הנוכחית, במחיקה הטרוזיגוטיים של הגן NF1 משמש שינוי גנטי ספציפי הגידולגן RPP30 כמו גן ההתייחסות. באמצעות יחס NF1 / RPP30, חלקם של תאים סרטניים חושב. מאז השינוי תלוי במינון של הפרופורציה של תאים סרטניים מספק אינדיקציה במבחנה עבור סגוליות של התרופה, גנטי מבוסס תאים זה assay במבחנה סביר להניח כי יש פוטנציאל יישום של גילוי תרופות. יתר על כן, עבור סרטן טיפול אישית, כלי genetic- ו מבוסס תאים זה עשוי לתרום לאופטימיזציה של כימותרפיה אדג'ובנטי באמצעות יעילויות בדיקות וספציפיות של תרופות מועמדות באמצעות תרבויות עיקריות של גידולים בודדים.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
צעד מפתח כלי genetic- ו מבוסס תא זו להערכת סגוליות תרופה במבחנה הוא קביעת שיעור של תאים סרטניים באמצעות אחד או יותר מאפיינים גנטיים ספציפי גידול. בניגוד לתכונות פנוטיפי קונבנציונליות 7, מאפיינים גנטיים ספציפיים, יציבים וקלים לכמת. לדוגמא, וריאצית מספר מוטציה או עותק ספציפי גידול קיימת אך ורק בתאים הסרטניים אך לא בתאים שאינם סרטניים. כזה הסטיגמה גנטי ניתן באופן מהימן ומדויק לכמת, למשל, באמצעות PCR הדיגיטלי כפי שמודגם במחקר זה.
לקבלה הדיגיטלי PCR, טוהר גבוה של DNA אינו הכרחי. עם זאת, Desalting והסרת מולקולות מעכבות נחוצים אשר יכולה להיות מושגת על ידי א-דיאליזה ירידה באמצעות מסנן מתאים. תמוגה בשילוב טיפה-הדיאליזה היא פשוט ומהירה, לא דורשת מכשירים מיוחדים ולכן יכולה להתבצע בכל מעבדה סטנדרטית. אם התאים אינם בריk היטב, יכול להיחשב טיפול נוסף כגון הקפאת התאים ב -20 ° C, הוספת חומר ניקוי ו / או באמצעות פרוטאז.
במחקר הנוכחי, את המחיקה הטרוזיגוטיים של גן NF1 שמשה תכונה מסוימת גידולים עבור כימות. באופן דומה, מחיקות של גנים או לוקוסים אחרים יכולות לשמש גם. יתר על כן, מוטציות יכולות לשמש גם לכימות תאים סרטניים. במקרה כזה, מבחני PCR דיגיטליים עבור המוטציה ואת אללים הנורמלי צריכים להיות מאומתים נרחב כדי להבטיח הספציפיות שלהם עבור כל אחד מהם.
תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים מספקת אינדיקציה-סגולי סמים או סלקטיביות. יתר על כן, הוא גם מאפשר בתגובה לחילוץ של תאים סרטניים מן התגובה של תאים כוללים של תרבות מעורבת לתרופה (איור 4). מיצוי אסטרטגיה זו מספקת פתרון עבור הבעיה הטכנית באמצעות תרבויות עיקריות (המכיל הוא גידול ולאn-גידול תאים) עבור בדיקות סמים.
Genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה הראה במחקר הנוכחי עשויים ולכן יש פוטנציאל יישום (1) ב-גילוי תרופות שבה היא מספקת פלטפורמה להערכה סגולי סמים או סלקטיביות במבחנה (2) בטיפול בסרטן אישית איפה זה מאפשר תרופות בדיקות בתרבויות עיקריות וכתוצאה מכך עשוי לתרום בחירת התרופה אדג'ובנט כימותרפיה 4. יתר על כן, מנגנון תרופתי של תרופה ניתן ללמוד באמצעות הכלי הזה, מאז שינוי גנטי מסוים או שינויים גנטיים מרובים ניתן בעקבות במהלך-הטיפול התרופתי.
קושי בשימוש תרבויות עיקריות אישיות הוא חוסר תכונה גנטית אוניברסלית עבור כימות של התאים הסרטניים. עם זאת, עם מקדמה בשיעור היום רצף שלם של הגנום, הגנים ואזורים שינו בתדירות הגבוהה ביותר ידועים גידולים נפוצים. לדוגמה, בין הראש והצווארגידולים, 71%, 23% ו -22% יש מוטציות TP53, FAT1 וגנים CDKN2A, ו -60%, 34% ו -26% יש מחיקות באזורי הגן של CDKN2A, STK11 ו PTEN, בהתאמה 10. הקרנת 5 עד 10 גנים או / ואזורים כגון באמצעות-רצף ממוקד ו / או דיגיטלי PCR יהיה ולכן סביר לזהות אחד או יותר שינויים גנטיים אשר ניתן להשתמש בהם עבור כימות של תאים סרטניים בתרבות העיקרי נגזר. מגבלה נוספת היא הכמות המספיקה של גידולי כריתה להקמת תרבויות עיקריות.
למרות תכונות יתרון ופוטנציאל יישום מבטיח של genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה, מגבלותיו צריכים להישמר נפש שלה בטבע במבחנה יודגש. לדוגמא, ההשפעות השונות או הרעיל של תרופה על תאים סרטניים רשאי למדי בשל הבדל בסוגי תאים (פיברובלסטים לעומת בתאי שוואן) או שלהםמקורות שונים (מאנשים שונים). ההשפעה החזקה יותר של תרופה על תאים סרטניים מאשר תאים שאינם סרטניים עשויה גם להיות מוסברת על ידי העובדה כי לשעבר לגדול מהר יותר מאשר האחרון. והחשוב מכל, תאים בהתנהגות במבחנה שונה מאשר תאים בגוף האדם וכתוצאה מכך, תוצאות הערכה במבחנה לעתים קרובות לא או רק חלקית לשקף את המצב קליני האמיתי. לכן, יעילה, cytotoxicity וספציפית של תרופות שהתקבלו עבור תאים בתרבית הם די טבע סמן ביולוגי, אך אין להם את האמינות של יעילות preclinically הנמדד של אנטיביוטיקה. אף על פי כן, נע שורות תאים לתרבויות מעורבות ו / או תרבויות עיקריות הוא צעד קדימה בהערכה ותוצאת תרופה וספציפית / סלקטיביות במבחנה. עם מאמצים רבים, בתנאים במבחנה ניתן למצוא האפשר מתאם סביר של נתונים במבחנה עם תגובות אמיתיות של חולים, לפחות עבור חלק מתרופות.
The authors have nothing to disclose.
גברת אלסטר, מר Honrath וד"ר ג'יאנג זוכים להערכה לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל שלהם. כמו כן העריך ד"ר Volz ואת קבוצת המחקר של ד"ר Dandri למתן גישה למכשיר דיגיטלי PCR שלהם.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |