L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare la specificità dei farmaci antitumorali in vitro utilizzando colture miste contenenti cellule sia tumorali e non tumorali.
È dimostrata una procedura di valutazione specificità dei farmaci antitumorali in vitro utilizzando colture contenenti cellule sia tumorali e non tumorali. L'elemento chiave è la determinazione quantitativa di un'alterazione genetica tumore-specifica in relazione ad una sequenza universale usando un test PCR digitale dual-sonda e il successivo calcolo della percentuale di cellule tumorali. Il test viene eseguito su una coltura contenente cellule tumorali di una linea consolidata e spillo in cellule non tumorali. La coltura mista è trattato con un farmaco di prova a varie concentrazioni. Dopo il trattamento, il DNA viene preparato direttamente dalle cellule adesive sopravvissute in pozzetti di piastre da 96 pozzetti utilizzando un metodo semplice e poco costoso, e sottoposto ad un test PCR digitale dual-sonda per la rilevazione di una alterazione genetica tumore-specifica e una sequenza universale di riferimento . Nella presente dimostrazione, una delezione eterozigote del gene NF1 è usato come l'alterazione genetica tumore-specifica eun gene RPP30 come gene di riferimento. Utilizzando il rapporto NF1 / RPP30, è stata calcolata la percentuale di cellule tumorali. Poiché il cambiamento dose-dipendente della percentuale di cellule tumorali fornisce un'indicazione in vitro per la specificità del farmaco, questo test genetici e basato su cellule in vitro probabilmente avrà potenziali applicazioni per la scoperta di farmaci. Inoltre, per il cancro personalizzato-cura, questo strumento genetico-e a base di cellule può contribuire ad ottimizzare la chemioterapia adiuvante per mezzo di efficacia sperimentazione e la specificità dei farmaci candidati che utilizzano colture primarie di singoli tumori.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
Il passo fondamentale in questo strumento genetico-e a base di cellule per valutare la specificità dei farmaci in vitro è la determinazione della percentuale di cellule tumorali che utilizzano una o più caratteristiche genetiche tumore-specifici. In contrasto con le caratteristiche fenotipiche convenzionali 7, le caratteristiche genetiche sono specifiche, stabile e facile da quantificare. Ad esempio, una mutazione o variazione del numero di copie tumore-specifico è presente esclusivamente nelle cellule tumorali, ma non nelle cellule non tumorali. Tale stigma genetico può essere affidabile e preciso quantificato, per esempio, utilizzando PCR digitale come dimostrato in questo studio.
Per PCR digitale, ad alta purezza del DNA non è essenziale. Tuttavia, la demineralizzazione e rimozione molecole inibitrici sono necessarie che può essere raggiunto da un drop-dialisi utilizzando un filtro adatto. La lisi e drop-dialisi combinato è semplice e veloce, non richiede strumenti speciali e quindi può essere effettuata in qualsiasi laboratorio standard. Se le cellule non break bene, trattamento aggiuntivo può essere considerato come il congelamento delle cellule a -20 ° C, aggiungendo detergenti o / e con proteasi.
Nel presente studio, la delezione eterozigote del gene NF1 è stato usato come la caratteristica tumore-specifico per la quantificazione. Analogamente, delezioni di altri geni o loci possono anche essere usati. Inoltre, le mutazioni possono essere utilizzati anche per quantificare le cellule tumorali. In tal caso, PCR digitali per il mutante e gli alleli normali devono essere ampiamente validato per garantire la loro specificità per ciascuna di esse.
proporzione dose-dipendente delle cellule tumorali fornisce un'indicazione per droga specificità o selettività. Inoltre, permette anche l'estrazione di risposta delle cellule tumorali la risposta delle cellule totali di una coltura mista a un farmaco (Figura 4). Questa strategia di estrazione fornisce una soluzione al problema tecnico utilizzando colture primarie (che contiene sia tumore e noncellule n-tumorale) per la droga-test.
La genetico-e a base di cellule in vitro strumento dimostrato in questo studio può quindi avere un potenziale di applicazione (1) in farmaco-discovery, dove fornisce una piattaforma per valutare la specificità di droga o di selettività in vitro e (2) nella cura del cancro personalizzato dove consente farmaci di prova in colture primarie e di conseguenza possono contribuire alla droga selezione in chemioterapia adiuvante 4. Inoltre, il meccanismo farmacologico di un farmaco può essere studiata utilizzando questo strumento, dal momento che alcune alterazione genetica o più alterazioni genetiche possono essere seguiti durante la droga-trattamento.
Una difficoltà nel usando colture primarie individualizzati è la mancanza di una funzione genetica universale per la quantificazione delle cellule tumorali. Tuttavia, con l'avanzata di oggi in tutto il sequenziamento del genoma, i geni e le regioni più frequentemente alterata sono noti per i tumori più comuni. Ad esempio, tra testa e collotumori, 71%, 23% e 22% hanno mutazioni nel TP53, FAT1 e geni CDKN2A, e il 60%, 34% e il 26% hanno delezioni in regioni geniche di CDKN2A, STK11 e PTEN, rispettivamente, 10. Screening 5 a 10 tali geni regioni e / o mediante sequenziamento mirato e / o PCR digitale pertanto probabile identificare uno o più alterazioni genetiche che possono essere utilizzati per la quantificazione delle cellule tumorali in coltura principale derivata. Un'altra limitazione è la quantità spesso insufficiente di tumori resecati per la creazione di colture primarie.
Nonostante le caratteristiche vantaggiose e promettente potenziale applicazione della genetico-e a base di cellule in vitro strumento, i suoi limiti devono essere tenuti in mente e la sua natura in vitro deve essere sottolineato. Per esempio, gli effetti differenziali o citotossicità di un farmaco sulle cellule tumorali può piuttosto per differenza di tipi di cellule (fibroblasti contro cellule di Schwann) o loroorigini diverse (da individui diversi). L'effetto più forte di un farmaco sulle cellule tumorali rispetto a cellule non tumorali può essere spiegata dal fatto che il primo crescere più velocemente rispetto al secondo. Ancora più importante, le cellule in vitro comportamento è diverso rispetto alle cellule nel corpo umano e, di conseguenza, i risultati della valutazione in vitro spesso fanno non o solo in parte riflettere la reale situazione clinica. Pertanto, l'efficacia, la citotossicità e la specificità dei farmaci ottenuti per cellule in coltura sono piuttosto dei biomarker natura, ma non hanno l'affidabilità di efficacia preclinically misurata di antibiotici. Tuttavia, passando da linee cellulari di colture miste e / o in colture primarie è un passo avanti nella valutazione della droga-effetto e la specificità / selettività in vitro. Con grandi sforzi, in condizioni in vitro possono essere trovati che consente ragionevole correlazione dei dati in vitro con risposte reali di pazienti, almeno per alcuni farmaci.
The authors have nothing to disclose.
La signora Alster, il signor Honrath e il dottor Jiang sono apprezzati per la loro eccezionale assistenza tecnica. Anche apprezzato è il Dott Volz e il gruppo di ricerca del Dr. Dandri per fornire l'accesso al dispositivo di PCR digitale.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |