このプロトコルの目的は、腫瘍および非腫瘍細胞の両方を含む混合培養物を用いてインビトロで抗がん剤の特異性を評価することです。
腫瘍および非腫瘍細胞の両方を含む培養物を用いてインビトロで抗がん剤の特異性を評価するための手順が示されています。重要な要素は、デュアルプローブデジタルPCRアッセイおよび腫瘍細胞の割合の後続の計算を使用して、ユニバーサル配列に関連する腫瘍特異的遺伝子変化の定量的な決意です。アッセイは、確立された回線の腫瘍細胞を含む培養で行い、スパイク、非腫瘍細胞れます。混合培養は、様々な濃度の試験薬剤で処理されています。処理の後、DNAを、簡単かつ安価な方法を用いて、96ウェルプレートのウェル中の生存接着細胞から直接調製され、そして腫瘍特異的遺伝子改変および参照ユニバーサル配列を測定するためのデュアルプローブデジタルPCRアッセイに供します。本デモでは、NF1遺伝子のヘテロ接合性欠失は、腫瘍特異的な遺伝子改変として使用され参照遺伝子としてRPP30遺伝子 。比NF1 / RPP30を使用して、腫瘍細胞の割合を算出しました。腫瘍細胞の割合の用量依存的な変化は、薬物の特異性のインビトロでの指標を提供するので、この遺伝的および細胞ベースのインビトロアッセイは、おそらく薬物発見における適用可能性を有することになります。また、パーソナライズされた癌ケアのため、このgenetic-および細胞ベースのツールは、個々の腫瘍の初代培養物を使用して、候補薬物の検査有効性および特異性により、アジュバント化学療法の最適化に寄与することができます。
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
in vitroでの薬物の特異性を評価するためのこのgenetic-および細胞ベースのツールにおける重要なステップは、一つ以上の腫瘍特異的な遺伝子の機能を用いて腫瘍細胞の割合の決意です。従来の表現型の特徴7とは対照的に、遺伝的特徴は、特定の安定および定量化することが容易です。例えば、腫瘍特異的変異またはコピー数の変化は、腫瘍細胞ではなく、非腫瘍細胞に排他的に存在します。そのような遺伝的汚名は、本研究で示されているように、デジタルPCRを使用して、例えば、確実かつ正確に定量することができます。
デジタルPCRは、DNAの高純度は必須ではありません。しかしながら、脱塩および阻害分子を除去するには、適切なフィルタを使用してドロップ透析によって達成することができる必要があります。合わせた溶解およびドロップ透析は、簡単かつ迅速であり、特別な器具を必要とせず、したがって、任意の標準的な実験室で行うことができます。細胞はブレアがない場合よくkは、付加的な治療は、そのような界面活性剤を添加すること及び/又はプロテアーゼを用いて、-20℃で細胞を凍結すると考えることができます。
本研究では、NF1遺伝子のヘテロ接合性欠失は、定量のための腫瘍特異的な特徴として使用しました。同様に、他の遺伝子または遺伝子座の欠失を使用することもできます。さらに、変異は、腫瘍細胞を定量化するために使用することができます。このような場合には、変異体のためのデジタルPCRアッセイおよび正常な対立遺伝子は、広く、それらのそれぞれのためのそれらの特異性を保証するために検証される必要があります。
腫瘍細胞の用量依存性の割合は、薬物特異性または選択のための指標を提供します。さらに、それはまた、薬物( 図4)の混合培養物の全細胞の応答からの腫瘍細胞の応答を抽出することが可能となります。この抽出戦略の両方の腫瘍を含む(一次培養物を使用して技術的問題に対する解決策を提供しません薬物試験のためのn腫瘍細胞)。
genetic-ため、アプリケーションの可能性を有していてもよい本研究で実証試験管ツールでセルベース(1)それは、in vitroでの薬物特異性または選択性を評価し、ためのプラットフォームを提供し、創薬における(2)パーソナライズされたがん治療中のどこにそれを初代培養で試験薬を可能にし、その結果、補助化学療法4に薬剤選択に寄与することができます。特定の遺伝子変化または複数の遺伝的改変は、薬物治療中に追跡することができるので、さらに、薬物の薬理学的メカニズムは、このツールを使用して研究することができます。
個別の初代培養物を使用する際の難しさは、腫瘍細胞の定量のための普遍的な遺伝子機能がないことです。しかし、全ゲノム配列決定における今日の前進で、最も頻繁に変更された遺伝子および領域は、共通の腫瘍のために知られています。例えば、頭頸部のうち腫瘍、71%、23%及び22%がTP53、FAT1およびCDKN2A遺伝子に変異を有し、60%、34%および26%がそれぞれ10、CDKN2A、STK11及びPTENの遺伝子領域に欠失を有します。標的化配列決定および/またはデジタルPCRにより、5〜10このような遺伝子および/または領域をスクリーニングする可能性が高い由来初代培養中の腫瘍細胞の定量化のために使用することができる1つまたは複数の遺伝的変化を同定します。別の制限は、初代培養物を設定するための切除腫瘍のしばしば不十分な量です。
試験管ツールで genetic-とセルベースの有利な特徴と有望な応用の可能性にもかかわらず、その限界は心に留めておくべきであるとそのin vitro性質が強調されるべきです。例えば、腫瘍細胞上の異なる効果、または薬物の細胞毒性ができるむしろによる細胞型(シュワン細胞対線維芽細胞)の差、またはそれらの(異なる個体からの)異なる起源。非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に対する薬物の強い効果はまた、前者が後者よりも速く成長するという事実によって説明することができます。最も重要なことは、 試験管行動中の細胞は人間の体内で細胞よりも異なり、その結果、in vitroでの評価の結果は、多くの場合、実際の臨床状況を反映していないか、部分的にしか行います。そのため、有効性、細胞毒性および培養細胞について得られた薬物の特異性は、むしろバイオマーカーの性質のものであるが、抗生物質の前臨床測定の有効性の信頼性を持っていません。それにもかかわらず、混合培養物および/ または一次培養物に細胞株から移動すると、薬物効果とin vitroでの特異性/選択性を評価する上で一歩前進です。広範な努力で、 インビトロ条件は、少なくともいくつかの薬物のための患者の実際の応答とインビトロのデータの合理的な相関関係を可能に見出すことができます。
The authors have nothing to disclose.
夫人アルスター氏Honrath博士江は、その優れた技術支援のために高く評価されています。また、博士フォルツとそのデジタルPCR装置へのアクセスを提供するための博士Dandriの研究グループは、であることを理解します。
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |