이 프로토콜의 목적은 종양 및 비 종양 세포를 모두 포함하는 혼합 된 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하는 것이다.
종양 및 비 종양 세포를 모두 함유하는 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하기위한 절차가 설명된다. 핵심 요소는 이중 디지털 프로브 PCR 분석 및 종양 세포의 비율의 후속 계산을 사용하여, 범용 서열과 관련하여 암 특이 적 유전자 변화를 정량한다. 상기 분석은 종양 설정된 광고의 세포를 함유하는 배양에서 수행되는 스파이크 된 비 – 종양 세포. 혼합 문화는 다양한 농도에서 시험 약물로 치료한다. 처리 후, DNA를 간단하고 저렴한 방법을 사용하여 96- 웰 플레이트의 웰에서 살아 접착 세포로부터 직접적으로 제조되며, 암 특이 적 유전자 변화와 기준 범용 시퀀스를 측정하기위한 이중 프로브 디지털 PCR 분석을 실시 . 본 데모에서, NF1 유전자의 이형 삭제가 암 특이 유전자 변형으로 사용되며기준 유전자와 같은 유전자 RPP30. 비 NF1 / RPP30를 사용하여, 종양 세포의 비율을 계산 하였다. 종양 세포의 비율의 용량 의존적 인 변화는 약물의 특이성에 대한 시험 관내 표시를 제공하기 때문에, 이러한 유전자 및 세포 – 기재 시험 관내 분석 가능성 신약 개발에 응용 가능성을 가질 것이다. 또한, 맞춤형 암 치료를 위해,이 genetic- 및 셀 기반 도구는 개별 종양의 차 문화를 사용하여 테스트 효능 및 후보 약물의 특이성에 의해 보조 화학 요법을 최적화에 기여할 수있다.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
시험 관내 약물 특이성 평가 본 genetic- 셀 기반 도구의 핵심 단계는 하나 이상의 암 특이 유전자의 기능을 이용하여 종양 세포의 비율을 결정한다. 종래의 표현형 특징 7 대조적으로, 유전자 기능은 특정 안정하고 정량화하기 쉽다. 예를 들면, 종양 특이적인 변이 또는 카피 수 변이가 아닌 종양 세포에 독점적으로 종양 세포가 아니라 존재한다. 이러한 유전 적 특질을 확실하고 정확하게 본 연구에서 입증 된 바와 같이 디지털 PCR하여, 예를 들어, 정량 할 수있다.
디지털 PCR의 경우, DNA의 순도가 필수적인 것은 아니다. 그러나, 탈염 및 억제 분자를 제거하는 적절한 필터를 이용하여 드롭 투석에 의해 달성 될 수있는 필요하다. 모은 용해 및 드롭 투석, 간단하고 신속 특별한기구를 필요로하지 않으며, 따라서 임의의 표준 실험실에서 수행 될 수있다. 세포의 브리를하지 않으면또한 K, 추가 처리는, -20 ° C에서 세포를 동결 세제를 추가 및 / 또는 단백질 분해 효소를 사용하는 것으로 간주 될 수있다.
본 연구에서, NF1 유전자의 이형 삭제 정량화 대한 종양 특이 기능을 사용한다. 마찬가지로, 다른 유전자 나 좌위의 결실이 또한 사용될 수있다. 또한 돌연변이는 종양 세포를 정량화하기 위해 사용될 수있다. 이러한 경우에, 디지털 돌연변이 PCR 분석법 정상 대립 유전자는 광범위 그들 각각 특이성을 확인하기 위해 검증되어야한다.
종양 세포의 투여 량 – 의존 비율은 약물 – 특이성 또는 선택성에 대한 표시를 제공한다. 게다가, 그것은 또한 약물 (도 4)에 혼합 배양 총 세포의 반응에서 종양 세포의 추출 반응을 가능하게한다. 이 추출 전략없이 종양 모두 포함 차 배양을 사용의 기술적 문제에 대한 솔루션 (제공약물 테스트를위한 N-종양 세포).
genetic- 때문에 응용 가능성을 가질 수있다 본 연구에서 입증 시험 관내 도구에서 셀 기반 (1)가 시험 관내에서 약물 특이성 또는 선택성을 평가하고 플랫폼을 제공 약물 발견 (2) 맞춤 암 치료에 어디를 차 문화에서 시험 약물을 가능하게하고 결과적으로 보조 화학 요법 사에서 약물 선택에 기여할 수있다. 특정 유전자 변경 또는 여러 유전 적 변화는 약물 치료 중이어서 할 수 있기 때문에 또한, 약물의 약리 메커니즘은이 도구를 사용하여 공부하실 수 있습니다.
개별화 차 배양을 사용에 어려움이 결핍 종양 세포의 정량 범용 유전 기능이다. 그러나, 전체 게놈 시퀀싱 오늘의 진행과 함께 자주 변경 유전자 영역이 공통 종양으로 알려져있다. 예를 들어, 머리와 목 사이종양, 71 %, 23 % 및 22 %는 TP53, FAT1 돌연변이 및 CDKN2A 유전자, 60 %, 34 % 및 26 %가 CDKN2A, STK11 및 PTEN 각각 10 유전자 영역의 결실을 가지고있다. 타겟 시퀀싱 및 / 또는 디지털 PCR을 이용하여 5 내지 10 등의 유전자 및 / 또는 영역을 스크리닝 따라서 가능성 유래 일차 배양에서 종양 세포의 정량에 이용 될 수있는 하나 이상의 유전 적 변형을 확인한다. 또 다른 제한은 차 문화를 설정하는 절제된 종양의 자주 부족한 양이다.
유리한 기능과 genetic-의 유망한 응용 잠재력과 셀 기반 체외 도구가, 그 한계를 염두에 보관해야하고 시험 관내 특성이 강조되어야한다에도 불구하고. 예를 들어, 종양 세포에 대한 약물의 차동 영향이나 독성 수도 인해 오히려 세포 유형의 차이 (슈반 세포 대 섬유 아세포)를하거나(다른 개인의) 다른 기원. 비 – 종양 세포에 비해 종양 세포에 대한 약물의 강력한 효과는 전자가 후자보다 더 빠르게 증가한다는 사실에 의해 설명 될 수있다. 가장 중요한 것은, 체외 동작 셀은 인체 세포보다 다르며 따라서, 시험 관내 평가의 결과들은 실제 임상 상황을 반영하지 않거나 부분적으로 수행. 따라서, 효능, 독성 및 배양 된 세포에 대해 얻어진 약물의 특이성은 오히려 바이오 마커 성격이지만 항생제 전임상 측정 효과의 신뢰성이 없습니다. 그럼에도 불구하고, 혼합 문화 및 / 또는 주 문화에 세포 라인에서 이동하는 생체 외 약물 효과와 특이도 / 선택도를 평가하는데 앞으로 단계입니다. 광범위한 노력으로, 시험관 조건에서 적어도 일부 의약품에 대한 환자의 실제 반응과 체외 데이터의 합리적인 상관 관계를 가능하게하는 찾을 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
부인 스터 씨 Honrath 박사 지앙은 뛰어난 기술 지원을 부탁드립니다. 또한 닥터 VOLZ 및 디지털 PCR 장치에 대한 액세스를 제공하기위한 Dandri 박사의 연구 그룹은 알 것이다.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |