Summary
O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais.
Abstract
Um procedimento para avaliar a especificidade de drogas anticancro in vitro utilizando culturas de células que contêm ambos tumorais e não tumorais é demonstrada. O elemento chave é a determinação quantitativa de uma alteração genética específica do tumor em relação a uma sequência universal usando um ensaio de PCR digital duplo-sonda e o cálculo subsequente da proporção de células de tumor. O ensaio é realizado em uma cultura contendo células de tumor de uma linha estabelecida e cravado-em células não tumorais. A cultura mista é tratado com um fármaco de teste a várias concentrações. Após o tratamento, o DNA é preparado directamente a partir das células adesivas sobreviveram em poços de placas de 96 poços utilizando um método simples e barato, e submetido a um ensaio de PCR digital duplo-sonda para a medição de uma alteração genética específica de tumores e uma sequência universal de referência . Na presente demonstração, uma deleção heterozigoto do gene NF1 é usado como a alteração genética específica de tumores eum gene RPP30 como gene de referência. Usando a relação NF1 / RPP30, calculou-se a proporção de células tumorais. Uma vez que a alteração dependente da dose da percentagem de células de tumor fornece uma indicação in vitro para a especificidade da droga, e este ensaio genético à base de células in vitro provavelmente terão potencial aplicação na descoberta de medicamentos. Além disso, para o cancro de cuidados personalizado, esta ferramenta genético-e à base de células pode contribuir para a optimização de quimioterapia adjuvante, por meio de testes de eficácia e especificidade de fármacos candidatos utilizando culturas primárias de tumores individuais.
Protocol
1. Preparação da mistura de cultura contendo ambas as células tumorais e células não tumorais
- Use de células tumorais a partir de uma linha celular estabelecida MPNST S462 5. Use fibroblastos como as células não tumorais 6,7
- Culturas tanto tumorais células e fibroblastos em meio DMEM padrão com 10% de soro fetal de bovino (BSA), glutamina 3 mM, 2-mercaptoetanol, 500 U / ml de penicilina 0,1, 500 g / ml de estreptomicina e piruvato de sódio 1 mM a 37 ° C e 5% de CO 2 5-7. Na sub-confluência, a colheita das células com 0,05% de tripsina e contá-los usando um hemocitômetro.
- Misturar 400 células tumorais e 1.600 células não tumorais em conjunto em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços em 0,2 ml de meio. Considerando-se um crescimento mais rápido das células de tumor ao longo do período de tratamento de 5 dias, a proporção inicial de células de tumor foi fixada em 25%. Configurar 4 repetições para cada concentração da droga. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N.
2. Drug Tratamento
- Use nilotinib como o fármaco de teste. Preparar soluções estoque de nilotinib 0, 2, 4 e 20 mM em DMSO. Dilui-se cada uma delas por 200 vezes em 5 ml de meio DMEM, dando 2-fold-droga soluções concentradas de 0, 10, 20 e 100 uM 6,7.
- Retirar 0,1 mL de meio de cada poço e adiciona-se 0,1 ml de meio contendo droga. As concentrações finais são 0, 5, 10 e 50 uM. Continuar a incubação das células em meio contendo droga durante 5 dias.
- No final do tratamento, inspeccionar as células ligadas utilizando um microscópio de contraste de fase e tirar fotografias. Aspirar o meio de distância, lavar as células sobreviveram adesivas uma vez com 0,2 ml de PBS.
3. Preparação de DNA para PCR Digital
- Células Lyse usando HotShot 8.
- Adicionar 50 ul de solução de lise alcalina (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) a cada poço. Selar os poços com papel alumínio. Incubar a placa a 95 ° C num forno ou sobre uma placa de aquecimento durante 30 min. Verifique sob um microscope para certificar-se que não há mais células intactas permaneceu na superfície dos poços. No caso de as células não lisar completamente, aumentar o tempo de aquecimento ou adicionar detergente. Congelá-los uma vez a -20 ° C, também aumenta as células quebrar.
- Adicionar 50 ul de solução (40 mM Tris-HC, pH 4,0) a cada poço neutralizantes. Transferir todos os lisados em formato U poços de uma placa de PCR e seco em um aparelho de ciclos de PCR a 95 ° C durante 10 a 30 min. Reconstituir o lisados com 20 l de água destilada.
- Desalt usando Drop-diálise 9
- utilizar os filtros de membrana com tamanho de poro médio de 0,025 | im.
- Flutuador do filtro em água destilada com brilhante para cima lado em poços de uma placa de 12 poços. Molhar o filtro durante 5 min. Prestar atenção para evitar bolhas de ar entre o filtro e água.
- Pipetar os lisados reconstituídas de cada amostra a partir do passo 3.1.4 em cuidadosamente em cada um dos 4 áreas do filtro. Cobrir a placa e dializar durante 30 a 60 min.
- Sugar a água sob o filtro sem capotar o filtro nem perturbar as gotas.
- Transferir o lisado-gotas em poços de uma nova placa de PCR-. Secam-se as ADN-gotas por aquecimento a 95 ° C durante 10 a 30 minutos num termociclador de PCR. Reconstituir o lisados em 10 ul de água.
4. PCR Digital
- componentes congelados descongelamento, tais como DNA, buffer ea mistura de ensaio à temperatura ambiente, spin para baixo por 10 segundos a força máxima de qualquer centrífuga disponível (por exemplo, VWR mini-centrífuga) e, em seguida, mantê-los no gelo.
- Prepare a mistura mestre contendo todos os componentes, excepto o DNA (Tabela 1). Considere o volume morto e calcular mistura mestre cerca de 10% mais do que a quantidade necessária.
Nota: Use os iniciadores e sondas utilizadas no kit comercial. - Vortex da mistura mestre, girar para baixo por 10 segundos a força máxima de qualquer centrífuga disponível (por exemplo, VWR mini-centrífuga) e dispensar 15 ul a cadapoço de uma placa de 96-PCR. Adicionar todos lisado (que contém ADN) de cada amostra para os poços que contêm a mistura mestre. Transferir 20 uL de cada mistura reaccional para dentro de um poço no lado da amostra de um cartucho à TA.
- Pipetar 70 ul de óleo gerador de gotícula em cada cavidade no lado do óleo de um cartucho. Fechar o cartucho com a junta de vedação e colocar a configuração em todo um gerador de gotícula. Iniciar a geração de gotículas.
- Transferência gota-solução de 40 ul nos poços de uma placa de PCR de 96 poços. Selar a placa com uma folha e colocar a placa num aparelho de ciclos de PCR. Definir a tampa temperatura a 105 ° C e de rampa taxa de 2 ° C / seg. Levar a cabo PCR usando as definições na Tabela 2. Após o PCR, transferir a placa para um leitor de gotícula e começar a ler. Alternativamente, armazenar a placa a 4 ° C durante até 24 h.
5. Cálculo Proporção de Células Tumorais
- Carregar os dados PCR digital e executar analys automáticasé.
- Controlar os resultados de cada ensaio manualmente através do controlo da distribuição de uma dimensão e de 2-dimensional das gotículas positivos e negativos, e a certeza de que eles são bem separados e as linhas de limiar foram nas posições certas. Excluem os resultados não satisfaz os critérios, por exemplo, há uma clara separação de gotículas positivos e negativos, a partir de uma análise mais aprofundada. Copie o maior rácio de NF1 / RPP30 em uma folha de excel.
- Calcular a proporção de células tumorais como: 2 x (1- NF1 / RPP30).
Mudança 6. Dose-dependente da proporção de células tumorais
- Para cada fármaco-concentração, calcule a média eo desvio padrão das 4 repetições. Traçar os meios e os desvios-padrão contra o consumo de droga concentrações.
Representative Results
Qualidade de ADN preparado utilizando o HotShot combinado / Drop-diálise é suficiente para PCR digitais satisfatória (Figura 1B). Por 2.000 fibroblastos, aproximadamente, foram obtidas 3.000 ± 500 gotas positivos, correspondendo a 75% dos esperados 4.000 cópias (duas cópias em uma célula). Neste estudo, as células tumorais foram estabelecidos a partir de uma linha MPNST S462 que são conhecidos por ter uma delecção heterozigoto do gene NF1 5. Esta redução da dosagem do gene 50% foi claramente detectado pelo ensaio de PCR digital duplo (Figura 1B). Em contraste, duas cópias deste gene foram medidos nos fibroblastos. Esta diferença genética entre células tumorais e não tumorais permite o cálculo da proporção de células de tumor em culturas mistas (Figura 2). Ao medir a dosagem do gene NF1 a relação de RPP30, proporção de células de tumor numa cultura mista pode ser determinadaem cada uma das drogas da concentração (Figura 3).
Figura 1. Digital PCR. (A) ilustração do princípio. (B) um ensaio de dual-sonda revela quantidade reduzida de um gene alvo (NF1) nas células tumorais MPNST S462 em relação a um gene de referência (RPP30). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. proporção calculada de células tumorais. As células tumorais e não tumorais células foram misturadas em várias proporções e semeadas em cada poço de uma placa de 96. Após a fixação, O / N wit, as células foram lisadash HotShot / Drop-diálise e os lisados foram dessalinizadas sujeito a PCR digital, que deu o rácio de NF1 / RPP30. Com base neste rácio, foi calculada a percentagem de células de tumor em cada poço. Média e desvio padrão da proporção de células tumorais foram calculados a partir de 4 repetições em cada proporção set-up. As proporções calculadas de células tumorais (eixo Y) foram plotados contra as proporções set-up (eixo X). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. dependente da dose Mudança da proporção de células de tumor. (A) a redução dependente da dose de células vitais visíveis. (B) a proporção de células de tumor (média e desvio padrão de 4 réplicas) calculada a partir da proporção de NF1: RPP30, diminuição na gama de 0-10? M. Na maior dose de 50? M, poucas células vitais foram deixados, provavelmente devido ao efeito tóxico para todas as células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 4. Resposta de separação de células tumorais a partir das células não tumorais (A) a viabilidade e / ou proliferação de células totais pode ser medida utilizando ensaios convencionais; Proporção de células de tumor pode ser determinada utilizando o procedimento demonstrado no presente estudo. (B) usando os dois parâmetros, a resposta de células totais numa cultura mista para um fármaco pode ser dividido em resposta das células tumorais e a resposta das células não tumorais..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1 Reaction | ||
| 2 x ddPCR Supermix | 12 | |
| mistura de ensaio para NF1 | 1.2 | |
| mistura de ensaio para RPP30 | 1.2 | |
| HaeIII | 0,6 | |
| Subtotal | 15 | mistura mestre |
| DNA | 9 | |
| Total | 24 | Mistura de PCR finais |
Tabela 1 Configuração dupla ddPCR Reaction
| Passo | Açao | Temperatura | Tempo | Cycles |
| 1 | Polymapagar activação | 95 ° C | 10 min | 1 |
| 2 | desnaturação do DNA | 94 ° C | 30 seg | 40 |
| 3 | Annealing / exetension | 60 ° C | 1 minuto | |
| 4 | desactivação da polimerase | 98 ° C | 10 min | 1 |
| 5 | Espera (opcional) | 4 ° C |
A Tabela 2 Configurações Cycler PCR
Discussion
O passo chave nesta ferramenta genético-e à base de células para avaliar a especificidade de drogas in vitro é a determinação da proporção de células de tumor, utilizando um ou mais recursos genéticos específicos do tumor. Em contraste com características fenotípicas convencionais 7, características genéticas são específicos, estável e fácil de quantificar. Por exemplo, uma mutação ou variação do número de cópias específico do tumor está presente exclusivamente em células tumorais, mas não em células não tumorais. Tal estigma genética pode ser fiável e quantificado precisamente, por exemplo, utilizando PCR digital como demonstrado no presente estudo.
Para a PCR digitais, de alta pureza de ADN não é essencial. No entanto, dessalinização e remoção das moléculas inibidoras são necessários o que pode ser conseguido por uma gota-a diálise utilizando um filtro adequado. A lise e gota-a diálise combinada é simples e rápido, não requer instrumentos especiais e, por conseguinte, pode ser realizado em qualquer laboratório padrão. Se as células não Break bem, tratamento adicional pode ser considerado tal como a congelação das células a -20 ° C, adicionando detergentes e / ou utilizando protease.
No presente estudo, a supressão heterozigoto do gene NF1 foi usado como o recurso específico de tumor para a quantificação. Da mesma forma, também pode ser utilizado deleções de outros genes ou loci. Além disso, as mutações também podem ser utilizadas para quantificar as células tumorais. Em tal caso, os ensaios de PCR para o mutante digitais e os alelos normais têm de ser extensivamente validado para garantir a sua especificidade para cada um deles.
proporção dependente da dose de células de tumor fornece uma indicação para o fármaco-especificidade ou selectividade. Além disso, ela também permite extrair a resposta das células tumorais a partir da resposta do número total de células de uma cultura mista de uma droga (Figura 4). Esta estratégia de extracção fornece uma solução para o problema técnico em utilizar culturas primárias (que contém tanto do tumor e nãocélulas de n-tumor) por drogas-teste.
A genético-celular e baseada na ferramenta vitro demonstrado no presente estudo pode, portanto, tem potencial de aplicação (1) em droga-descoberta, onde ele fornece uma plataforma para avaliar a especificidade de drogas ou a selectividade in vitro e (2) no tratamento personalizado do câncer onde ele permite drogas de teste em culturas primárias e, consequentemente, pode contribuir para a droga-seleção na quimioterapia adjuvante 4. Além disso, o mecanismo farmacológico de uma droga pode ser estudada usando esta ferramenta, uma vez que certa alteração genética ou alterações genéticas múltiplas podem ser seguidas durante a droga do tratamento.
Uma dificuldade na utilização de culturas primárias individualizadas é a falta de uma característica genética universal para a quantificação das células tumorais. No entanto, com o avanço de hoje na sequenciação de todo o genoma, os genes e regiões mais frequentemente alteradas são conhecidos por tumores comuns. Por exemplo, entre cabeça e pescoçotumores, 71%, 23% e 22% têm mutações em TP53, FAT1 e genes CDKN2A, e 60%, 34% e 26% têm deleções nas regiões do gene de CDKN2A, STK11 e PTEN, respectivamente 10. Rastreio de 5 a 10 tais genes e / ou as regiões através de sequenciação-alvo e / ou de PCR digital irá, portanto, provável identificar uma ou mais alterações genéticas que podem ser utilizadas para a quantificação das células tumorais na cultura primária derivada. Outra limitação é a quantidade muitas vezes insuficiente de tumores ressecados para a criação de culturas primárias.
Apesar das características vantajosas ea aplicação potencial promissor da genético-e na ferramenta vitro baseado em células, as suas limitações devem ser mantidos em mente e sua natureza in vitro devem ser enfatizados. Por exemplo, os efeitos diferenciais ou citotoxicidade de um fármaco em células tumorais podem, em vez devido à diferença de tipos de células (células de Schwann contra fibroblastos) ou os seusdiferentes origens (de diferentes indivíduos). O efeito mais forte de um fármaco em células tumorais do que em células não tumorais também pode ser explicada pelo facto de que o primeiro crescer mais rapidamente do que o último. Mais importante, as células no comportamento vitro difere do que as células no corpo humano e, consequentemente, os resultados da avaliação in vitro muitas vezes não ou apenas parcialmente reflectir a situação clínica real. Portanto, a eficácia, a citotoxicidade e a especificidade das drogas obtidos para células cultivadas são em vez de biomarcador natureza, mas não têm a fiabilidade da eficácia pré-clinicamente medido de antibióticos. No entanto, movendo-se de linhas celulares para culturas mistas e / ou culturas primárias é um passo em frente na avaliação fármaco-efeito e especificidade / seletividade in vitro. Com grandes esforços, em condições in vitro, pode ser encontrado o que permite uma correlação razoável de dados in vitro com respostas reais dos pacientes, pelo menos para algumas drogas.
Acknowledgments
Sra Alster, o Sr. Honrath e Dr. Jiang são apreciados pela sua excelente assistência técnica. Também é apreciado Dr. Volz e do grupo de pesquisa do Dr. Dandri para fornecer o acesso ao seu dispositivo de PCR digital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | For drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| Pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
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