Цель этого протокола заключается в оценке специфичности противоопухолевых препаратов в пробирке с использованием смешанных культур , содержащих как опухолевые и не опухолевые клетки.
Процедура оценки специфичности противоопухолевых препаратов в пробирке с использованием культур , содержащих как опухолевые , так и не-опухолевые клетки демонстрируется. Ключевым элементом является количественное определение опухоли специфических генетических изменений по отношению к универсальной последовательности с использованием цифрового анализа ПЦР с двойным зондом и последующий расчет доли опухолевых клеток. Анализ проводят на культуре, содержащей клетки опухоли налаженной линии и шипами в неопухолевых клетках. Смешанной культуры обрабатывают тестируемого лекарственного средства в различных концентрациях. После обработки ДНК получают непосредственно из уцелевших адгезивных клеток в лунки 96-луночных планшетов с использованием простой и недорогой способ, и подвергают двойной зонд цифровой ПЦР для измерения опухолеспецифичного генетического изменения и универсальной ссылочной последовательности , В данной демонстрации, гетерозиготным делеция гена NF1 используется в качестве опухолеспецифичного генетических изменений иген RPP30 в качестве контрольного гена. Используя отношение NF1 / RPP30, рассчитывалась доля опухолевых клеток. Поскольку дозозависимое изменение доли опухолевых клеток обеспечивает индикацию в пробирке на специфичность препарата, этот генетический и на основе клеток для анализа ин витро, вероятно , имеют потенциал применения в лекарственных препаратах. Кроме того, для персонализированного рака ухода, это genetic- и на основе клеток инструмент может способствовать оптимизации адъювантной химиотерапии с помощью тестирования эффективности и специфичности кандидатов лекарственных средств с использованием первичных культур отдельных опухолей.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
Ключевым шагом в этом genetic- и на основе клеток инструментом для оценки специфичности лекарственного средства в пробирке является определение доли опухолевых клеток с использованием одного или более опухольспецифические генетические особенности. В отличие от обычных фенотипических признаков 7, генетические особенности характерны, стабильны и легко поддаются количественному определению . Например, опухоль-специфичный мутагенез или число копий изменение присутствует исключительно в опухолевых клетках, но не в неопухолевых клетках. Такая генетическая клеймо может быть надежно и точно количественно, например, с использованием цифровой ПЦР, как показано в этом исследовании.
Для цифровой ПЦР, высокая чистота ДНК не является существенным. Тем не менее, обессоливание и удаление ингибирующих молекулы необходимы, которые могут быть достигнуты с помощью капельного диализа с использованием соответствующего фильтра. Комбинированный лизис и раскрывающихся диализ является простым и быстрым, не требует каких-либо специальных инструментов и, следовательно, могут быть выполнены в любой стандартной лаборатории. Если клетки не Breaа K, дополнительное лечение можно считать такие, как замораживание клеток при -20 ° С, при добавлении моющего средства или / и с помощью протеазы.
В настоящем исследовании, гетерозиготного делеция гена NF1 был использован в качестве признака опухолеспецифичного для количественной оценки. Аналогичным образом, могут быть также использованы делеции других генов или локусов. Кроме того, мутации могут также быть использованы для количественной оценки опухолевых клеток. В таком случае, цифровые ПЦР-анализы для мутантом и нормальные аллели должны быть тщательно проверены, чтобы гарантировать их специфичность в отношении каждого из них.
Дозозависимый доля опухолевых клеток обеспечивает индикацию для лекарственной специфичности или селективности. Кроме того, это также дает возможность извлекающий реакцию опухолевых клеток из ответа общего количества клеток смешанной культуры к лекарственному средству (рисунок 4). Эта стратегия извлечения обеспечивает решение для поставленной технической задачи в использовании первичных культур (который содержит в себе как опухоль и нетн-опухолевых клеток) для тестирования наркотиков.
Genetic- и на основе клеток в пробирке инструмента показано в настоящем исследовании , поэтому может иметь потенциал применения (1) в лекарственной открытия , где она обеспечивает платформу для оценки специфичности лекарственного средства или селективности в пробирке и (2) в персонализированного лечения рака , где его позволяет проводить тестирование лекарств в первичных культурах и , следовательно , может способствовать лекарственной селекции в адъювантной химиотерапии 4. Кроме того, фармакологический механизм лекарственного средства могут быть изучены с помощью этого инструмента, так как определенные генетические изменения или множественные генетические изменения могут последовать в течение лекарственной терапии.
Трудность в использовании индивидуализированных первичных культур является отсутствие универсальной генетической особенностью для количественной оценки опухолевых клеток. Тем не менее, с сегодняшнего продвижения в целом-генома, наиболее часто видоизмененные гены и регионы известны общие опухолей. Например, среди головы и шеиопухоли, 71%, 23% и 22% имеют мутации в TP53, FAT1 и гены CDKN2A, а 60%, 34% и 26% имеют делеции в гене регионах CDKN2A, STK11 и PTEN, соответственно 10. Скрининг от 5 до 10 таких генов или / и регионов посредством целенаправленного секвенирование / или цифровой ПЦР будет, следовательно, скорее всего, идентифицировать один или более генетических изменений, которые могут быть использованы для определения количества опухолевых клеток в полученной первичной культуре. Другим ограничением является часто недостаточное количество резекции опухоли для создания первичных культур.
Несмотря на выгодные особенности и перспективно применение потенциала genetic- и на основе клеток в пробирке инструмента, его ограничения следует иметь в виду , и его в пробирке природы следует подчеркнуть. Например, дифференциальные эффекты или цитотоксичность препарата на опухолевые клетки могут скорее из-за разницы в типах клеток (фибробласты против шванновских клеток) или ихразличного происхождения (от разных людей). Чем сильнее воздействие препарата на опухолевые клетки, чем на неопухолевых клетках также может быть связано с тем, что бывший растут быстрее, чем последний. Самое главное, что клетки in vitro на поведение отличается , чем клетки в организме человека и , следовательно, результаты оценки ин витро часто не имеют или только частично отражают реальную клиническую ситуацию. Таким образом, эффективность, цитотоксичность и специфичность препаратов, полученных для культивируемых клеток, являются скорее биомаркеров природы, но не имеют надежности доклинически измеренной эффективности антибиотиков. Тем не менее, переход от клеточных линий смешанных культур и / или первичных культур является шагом вперед в оценке наркотиков эффект и специфичности / селективности в лабораторных условиях . При обширных усилий, в условиях лабораторных можно найти , что позволяет разумную корреляцию данных в пробирке с реальными ответами пациентов, по крайней мере , для некоторых лекарств.
The authors have nothing to disclose.
Г-жа Альстер, г-н Honrath и д-р Цзян ценят за их выдающуюся техническую помощь. Также понятно, доктор Фольц и исследовательская группа доктора Dandri для обеспечения доступа к их цифровым устройствам PCR.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |