Målet med detta protokoll är att bedöma specificiteten av cytostatika in vitro med hjälp av blandade kulturer innehållande både tumör och icke-tumörceller.
Ett förfarande för att bedöma specificiteten av cytostatika in vitro med hjälp av kulturer innehållande både tumör och icke-tumörceller demonstreras. Den viktigaste faktorn är den kvantitativa bestämningen av en tumörspecifik genetisk förändring i förhållande till en universell sekvens med dubbla sond digital PCR-analys och efterföljande beräkning av andelen tumörceller. Analysen utförs på en kultur som innehåller tumörceller av en etablerad linje och spiked-i icke-tumörceller. Den blandade kulturen behandlas med ett testläkemedel vid olika koncentrationer. Efter behandlingen är DNA ställas direkt från de överlevande vidhäftande cellerna i brunnar av 96-brunnars plattor med användning av en enkel och billig metod, och utsattes för en dual-sond digital PCR-analys för mätning av en tumörspecifik genetisk förändring och en referens universell sekvens . I föreliggande demonstration, är en heterozygot deletion av NF1-genen som används som den tumörspecifika genetisk förändring ochen RPP30 gen som referens gen. Använda förhållandet NF1 / RPP30, var andelen tumörceller beräknades. Eftersom den dosberoende förändring av hur stor andel av tumörceller tillhandahåller en in vitro-indikation för specificiteten av läkemedlet, kommer denna genetiska och cellbaserade in vitro-analys sannolikt ha tillämpning potential i läkemedelsutveckling. Dessutom för personlig cancer-care, kan detta genetic- och cellbaserade verktyg bidra till att optimera adjuvant kemoterapi genom att testa effektivitet och specificitet läkemedelskandidater som använder primära odlingar av individuella tumörer.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
Nyckelsteget i denna genetic- och cellbaserade verktyg för att bedöma läkemedels specificitet in vitro är fastställandet av andelen tumörceller med användning av en eller flera tumörspecifika genetiska särdrag. I motsats till konventionella fenotypiska egenskaper 7, genetiska särdrag är specifika, stabil och lätt att kvantifiera. Till exempel, är en tumörspecifik mutation eller kopietal variation närvarande uteslutande i tumörcellerna men inte i icke-tumörceller. En sådan genetisk stigma kan tillförlitligt och exakt kvantifieras, till exempel, med hjälp av digital PCR såsom visats i denna studie.
För digital PCR, är inte väsentligt hög renhet av DNA. Emellertid avsaltning och avlägsnande inhiberande molekyler är nödvändigt vilket kan uppnås genom en drop-dialys med användning av ett lämpligt filter. Den kombinerade lys och drop-dialys är enkel och snabb, kräver inga speciella instrument och kan därför utföras i någon standard laboratorium. Om cellerna inte break väl, kan ytterligare behandling övervägas, såsom frysning av cellerna vid -20 ° C, tillsätta tvättmedel och / eller med hjälp av proteas.
I den aktuella studien var heterozygot deletion av NF1-genen används som tumörspecifika funktion för kvantifiering. På liknande sätt kan deletioner av andra gener eller loci också användas. Vidare kan mutationer också användas för kvantifiering av tumörceller. I ett sådant fall, digital PCR-analyser för mutanten och de normala alleler måste utsträckning valideras för att garantera deras specificitet för var och en av dem.
Dosberoende andel av tumörceller ger en indikation på drug specificitet eller selektivitet. Vidare möjliggör det också att extrahera svar av tumörceller från svars av totala celler av en blandad kultur till ett läkemedel (figur 4). Denna extraktion strategi ger en lösning för det tekniska problemet i att använda primära odlingar (som innehåller både tumör och ingenn-tumörceller) för drogtestning.
Den genetic- och cellbaserade in vitro verktyg visats i denna studie kan därför ha tillämpning potential (1) i läkemedelsupptäckt där det ger en plattform för att bedöma läkemedels specificitet eller selektivitet in vitro och (2) i personlig cancervård där det möjliggör att testa läkemedel i primära kulturer och därmed kan bidra till narkotika val i adjuvant kemoterapi fyra. Vidare kan studeras farmakologiska verkningsmekanismen ett läkemedel med hjälp av detta verktyg, eftersom vissa genetisk förändring eller flera genetiska förändringar kan följas under läkemedelsbehandling.
En svårighet i att använda individualiserade primära odlingar är bristen en universell genetiska särdrag för kvantifiering av tumörcellerna. Men med dagens förväg i hel-genomet sekvensering, är de mest förändrade gener och regioner kända för vanliga tumörer. Till exempel bland huvud och halstumörer, 71%, 23% och 22% har mutationer i TP53, FAT1 och CDKN2A gener, och 60%, 34% och 26% har deletioner i genen regionerna CDKN2A, STK11 och PTEN, respektive 10. Screening 5 till 10 sådana gener eller / och områden med hjälp av riktade-sekvensering och / eller digital PCR kommer därför sannolikt att identifiera en eller flera genetiska förändringar som kan användas för kvantifiering av tumörceller i den härledda primärkulturen. En annan begränsning är ofta otillräcklig mängd utskurna tumörer för att ställa upp primära kulturer.
Trots de fördelaktiga egenskaper och lovande tillämpning potential genetic- och cellbaserade in vitro verktyg, bör dess begränsningar hållas i åtanke och dess in vitro karaktär bör betonas. Till exempel, de differentiella effekter eller cytotoxicitet av ett läkemedel på tumörceller kan snarare på grund av skillnaden i celltyper (fibroblaster kontra Schwann-celler) eller derasolika ursprung (från olika individer). Den starkare effekten av ett läkemedel på tumörceller än på icke-tumörceller kan också förklaras av det faktum att den förra växer snabbare än de senare. Viktigast celler in vitro beteende skiljer sig än celler i människokroppen och därmed resultaten av in vitro-bedömning gör ofta inte alls eller bara delvis återspeglar den verkliga kliniska situationen. Därför, effekt, cytotoxicitet och specificitet av läkemedel erhölls för odlade celler är ganska av biomarkörer naturen men som inte har tillförlitligheten av prekliniskt uppmätt effekt av antibiotika. Ändå flyttar från cellinjer till blandade kulturer och / eller primära kulturer är ett steg framåt för att bedöma läkemedelseffekt och specificitet / selektivitet in vitro. Med omfattande insatser, in vitro förhållanden kan hittas som möjliggör rimlig korrelation av data in vitro med riktiga svaren från patienter, åtminstone för vissa läkemedel.
The authors have nothing to disclose.
Fru Alster, Mr Honrath och Dr. Jiang uppskattas för sin enastående teknisk assistans. Också uppskattat är Dr. Volz och forskargruppen Dr Dandri för att ge tillgång till sin digitala PCR-enhet.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |