Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

8K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/53753

⸱

23. April 2016

 , 
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, University of Arizona College of Medicine, 2Center for Applied Genetics and Genomic Medicine, University of Arizona College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschäftigen wir FISH - Methodik LINE-1 - Retrotransposition an der einzelnen Kerne Ebene in Chromosom Spreads von HepG2 - Zelllinien stabil synthetischen LINE-1 exprimieren , zu verfolgen.

Zusammenfassung

Lange eingestreutes Kernelement-1 (Linie-1 oder L1) macht etwa 17% der im menschlichen Genom vorhandenen DNA aus. Während die Mehrheit der L1s aufgrund von 5'-Trunkierungen inaktiv ist, bleiben ~80-100 dieser Elemente retrotranspositionskompetent und vermehren sich über RNA-Zwischenprodukte an verschiedene Stellen im Genom. Während man davon ausgeht, dass ältere L1-Moleküle auf AT-reiche Regionen des Genoms abzielen, sind die chromosomalen Ziele neuer, aktiverer L1-Moleküle nach wie vor schlecht definiert. Hier beschreiben wir die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (FISH), die verwendet werden kann, um Muster der L1-Insertion und die Raten des ektopischen L1-Einbaus auf Einzelkernebene zu verfolgen. In diesen Experimenten wurden Fluorescein-Isothiocyanat/Cyanin-3 (FITC/CY3)-markierte Neomycin-Sonden verwendet, um die L1-Retrotransposition in vitro in HepG2-Zellen zu verfolgen, die ektopisches L1 stabil exprimieren. Diese Methodik verhindert Fehler bei der Schätzung der durch Toxizität verursachten Retrotranspositionsraten und berücksichtigt das Auftreten mehrerer Insertionen in einen einzigen Zellkern.

Einleitung

Menschliche Lange streute Kern Element-1 (Linie-1 oder L1) ist eine autonome mobile Element , das durch eine im Genom ausbreitet "Kopieren und Einfügen" Retrotransposition Mechanismus. Ein typisches menschliches L1 ~ 6 kb lang und besteht aus einer 5' - UTR (untranslatierte Region), die als Promotor dient, zwei offene Leserahmen (ORFs): L1 -ORF1 und L1 -ORF2 und eine 3'UTR mit einem polyA . Schwanz L1 -ORF1 Protein hat drei verschiedene Bereiche: eine Spule-Coil - Domäne, RNA - Erkennungsmotiv und C-terminale Domäne, während L1 -ORF2 Protein Endonuklease hat, reverse Transkriptase und Cystein reiche Domänen 1.2.3.4.5. L1 -ORF1 zeigt Nukleinsäure Chaperon - Aktivitäten, während L1 -ORF2 enzymatischen Aktivitäten bietet, wobei beide für Retrotransposition benötigten Proteine ​​1,2,6.

Ein Zyklus von L1 Retrotransposition beginnt mit der Transkription von der 5'UTR von L1 bicistronischen mRNA durch RNA-Polymerase II, Translokation in das Cytoplasma und Translation. Im Zytoplasma, L1 -ORF1 weist entweder cis -Bindung , wo es seine eigene RNA oder trans -Bindung Pakete , wo es andere RNAs Pakete (dh Sinus- / SVAS / pseudogenes) 7 ein Ribonukleoprotein Partikel (RNP) mit L1 -ORF2p zu bilden, 8. RNPs Translokation in den Zellkern , wo die Endonuklease - Aktivität von L1 -ORF2p Scharten genomische DNA (gDNA) eine OH zu belichten - Gruppe 9, die wiederum durch die reverse Transkriptase zu primen verwendet wird und synthesize RNA zu DNA vom 3' - Ende umzukehren. Während der Rückwärts Synthese wird der zweite DNA - Strang 7-20 bp von der ursprünglichen nick Website geklaut zu versetzten Pausen schaffen , die die Signatur L1 Insertionssequenzen (zB TTTTAA) genannt Zielstelle Vervielfältigungen (TSD) 9,10 zu bilden , gefüllt sind. Dieser Vorgang wird als Ziel prime reverse Transkription (TPRT) bekannt und führt zu insertiauf der vollständigen oder abgeschnittene Kopien von L1 / andere DNAs mit TSD an beiden Enden der eingefügten Sequenz. L1 Retrotransposition auch durch TPRT artigen nicht-homologe end-joining in einigen Zelltypen 11 vermittelt zu werden hat sich gezeigt.

Der L1 - Vektor Retrotransposition in unseren Studien verwendeten nicht-episomale und besteht aus getaggt L1 -ORF1 & 2p angetrieben durch kombinierte CMV-Promotoren L1-5'UTR (Abbildung 1) 12. Frühere Versionen dieses Konstrukts wurden 13,14,15 in Studien unter Verwendung von Hefe und menschlichen Zellkulturen beschrieben. Zwei verschiedene CMV-Promotoren in der 5 'angeordnet und 3'-Enden des Vektors, mit dem 3'-Ende in umgekehrter Ausrichtung angeordnet Expression von Neomycin nach dem Spleißen und Integration zu fahren. Der Retrotransposition Indikator Kassette an dem 3' - Ende besteht aus einem Neomycin - Gen insertiert Antisense zu L1 -ORFs und durch eine glob inaktiver durch Trennung in zwei Hälften gemachtin Intron mit gespleißten Donor (SD) und gespleißt Akzeptor (SA) -Stellen (Abbildung 1). Bei der Integration in ein Chromosom, wird L1 von dem gemeinsamen Promotor transkribiert , um eine mRNA produzieren , die von einer bicistronischen mRNA und inaktive Neomycin mRNA besteht. Während RNA Verarbeitung wird das Globin-Intron aus dem Neomycin-Gen gespleißt eine voll funktionsfähige Neomycin-Gen wiederherzustellen. Die Hybrid - mRNA wird in ein RNP in cis verpackt und in den Zellkern transloziert , wo es in das Genom entweder in voller Länge oder abgeschnittene Einfügungen Verwendung TPRT integriert ist.

Hier beschreiben wir eine Methode , die Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (FISH) mit Sonden verwendet speziell auf die gespleißten Neomycin - Gen gerichtet (Sneo) an der einzigen Kern Ebene L1 -retrotransposiition Muster und Einbringungsraten zu verfolgen. Die Effizienz und Spezifität des Nachweises wurde unter Verwendung von Retrotransposition kompetenten und inkompetenten Konstrukte und Sonden bestätigt detect Sneo oder das Neomycin und Intron - Übergang Globin - 16. Diese Methodologie macht einige der Mängel der Zellkultur-Assays Retrotransposition, beispielsweise mehrere Einfügungen, kolonieBeständigkeit und günstige clone Expansion.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wenn nicht anders angegeben. Bitte beachten Sie Reagenzien für Details auf, wie einzelne Reagenzien herzustellen.

1. Kennzeichnung L1 Probes

HINWEIS: Die Sonden können durch chemische oder PCR-Kennzeichnung versehen werden.

  1. chemische Markierung
    1. Machen 0,7-1% Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA (TAE) -Puffer, Wärme in einer Mikrowelle, bis sie geschmolzen, erlauben das Gel abkühlen, und fügen Ethidiumbromid (0,5 ug / ml). Gießen Sie in Gelträger, fügen Sie Kämme und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu verfestigen.
    2. Beschriften der Sneo Sonde (1-2 ug) mit CY3 oder FITC bei 37 ° C für 1 Stunde nach dem Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Sneo bezeichnet die S nach einem vollen Zyklus der Retrotransposition ausgedrückt Neo mycin Gen pliced. Die Sonde ist ~ 1000 bp groß. Sneo kann PCR von jedem Vektor verstärkt werden oder von genomic-DNA. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen über Streptavidin-Cy3 / FITC-Markierungsreagenzien.
    3. Mischen Sie die markierten Sneo Sondenlösung mit 1x DNA-Ladepuffer, Last in jede Vertiefung und laufen bei 75-100 Volt für 15-20 min.
    4. Visualisieren Sie die Sonde Band eine Ultraviolett (UV) Illuminator verwenden. Man beachte , dass die Größe der Sneo Sonde eingestellt werden kann , und dass Lock - Kerne Säure (LNA) können ebenfalls hinzugefügt werden (Abbildung 2).
    5. Cut Sneo Sonde aus dem Gel mit einem sauberen Messer markiert, löslich zu machen und die Sneo Sonde aus dem Gel unter Verwendung eines PCR-Clean-Up-Kit reinigen dem Protokoll des Herstellers nach.
      VORSICHT: Abdeckung jeder exponierten Teil des Körpers mit Schutzschilden (dh Laborkittel und UV - Klargesichtsmaske) beim Betrachten und das Gel zu schneiden. Siehe Tabelle Material- und Reagenzien für die Informationen zu Gel reinigen PCR-Produkte.
    6. Re-run 5 ul Sneo markierten Sonde mit einem nicht-markierten Sneo Sonde auf einem 0,7% Agarose-Gel (siehe 1.1.1) conUnternehmensgröße zu erhöhen und Verlust der Signalintensität (Abbildung 2).
    7. Quantifizierung der Menge an markiertem Sneo Sonde durch die Absorption bei 260 nm zu messen und verdünnt das Sneo Sonde 10 ng / & mgr; l Aliquots in Nuklease freiem H 2 O. Store Aliquots bei -20 ° C.
  2. PCR - Labeling (Alternatives Verfahren zur Sondenmarkierung)
    1. Kombinieren Sie Sneo spezifische Primer (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'und 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') mit PCR - Reagenzien in einem einzigen Rohr: 13,6 ul nukleasefreiem H 2 O; 0,1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ul dTTP (10 nM); 0,05 & mgr; l dUTP-Biotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul gehen Tag 5x Puffer; 0,4 ul gehen Tag Polymerase; 1 ul Sneo-Vorlage (10 ng). Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen über die PCR-Reagenzien.
    2. Stellen Sie die Menge jedes Reagens durch durch die Gesamtzahl der Proben multipliziert wird.
    3. Verwenden Sie das folgende PCR-Zyklen Parameters zu amplifizieren und Etiketten Sneo Sonden: 95 ° C für 2 min; 35 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 62 ° C für 30 sec, 72 ° C für 60 sec; 72 ° C für 2 min; Halten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit.
      HINWEIS: Die Glühtemperatur eingestellt werden kann oder Gradienten PCR kann optimal Glühtemperaturen für andere Sonden zu bestimmen, durchgeführt werden.
    4. Machen Sie 0,7-1% Gel, wie in Abschnitt 1.1.1, Last und visualisieren die Sonde Band, wie in Abschnitt 1.1.4.
    5. Schneiden Sie und reinigen die markierten Sneo Sonde, wie in Abschnitt 1.1.5.
    6. Re-run 5 ul Sneo markierten Sonde mit un-markierten Sneo Sonde Größenzunahme und Verlust der Signalintensität zu bestätigen (siehe Abbildung 2).
    7. Quantifizierung der Menge an markiertem Sneo Sonde durch Messung der Absorption bei 260 nm und verdünnter Sneo Sonde 10 ng / & mgr; l Aliquots in Nuklease freiem H 2 O.

2. Vorbereitung Chromosome Aufstriche

  1. Generieren stabile Klone Vektorgerüst exprimieren (control) oder Retrotransposition zuständigen L1 unter Verwendung von Standardauswahlmethoden. 12,16 Während nicht-episomale Reporter wurden verwendet , um Ergebnisse mit Studien der Transkription, episomale Vektoren können auch verwendet werden zu korrelieren. Wachsen Zellen stabil exprimieren Kontrolle oder L1 - Vektor (1 x 10 6 Zellen pro 10 cm Platte, mit Anpassungen in Plattengröße hergestellt nach Bedarf) in komplettem Wachstumsmedium. Für HepG2-Zellen verwenden RPMI-1600, 10% FBS und 200 & mgr; g / ml Hygromycin. Wachsen Kulturen zu 70% Konfluenz bei 37 ° C und 5% CO 2.
    HINWEIS: Die Wahl des Wachstumsmediums ist abhängig vom Zelltyp. Da die Plasmide tragen hier Selektionskassetten sowohl für Hygromycin und Neomycin, stabile Selektion von Klonen verwendet, könnte auch mit Neomycin nach Selektion auf Hygromycin durchgeführt werden, aber die Menge an Neomycin muss optimiert werden Toleranzwerte für jeden Zelltyp herzustellen.
  2. In Colcemid (0,4 ug / ml) zu Kulturmedium und Inkubation für 90 min Zellen bei Metaph zu verhaftenase. Wenn verschiedene Zelltypen verwendet, bestimmen die optimale Konzentration von Colcemid und Zeit der Belichtung (60, 90 und 120 min) für eine optimale Verhaftung Metaphase empirisch.
  3. Wasche die Zellen 2x mit 10 ml 1x Dulbecco-PBS (DPBS), trypsinize von 3-5 ml Zugabe von 0,25% Trypsin-Lösung zu den Zellen und inkubiere für 5 min, um die Zellen zu lösen. Inaktivieren Trypsin mit einer gleichen Menge an Medium 10% FBS enthielt.
  4. Zentrifugation der Zellen für 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C absaugen Medium vom Zellpellet und wasche die Zellen mit DPBS. Absaugen alle DPBS, so dass 200 ul DPBS, um die Zellen erneut zu suspendieren. Stellen Sie sicher, Zellen sind gut gemischt, und dass alle Klumpen verteilt sind. Verwenden Sie Flackern oder vorsichtiges Pipettieren zu mischen und zu verteilen Klumpen und vermeiden Verwirbelung.
  5. 5 ml hypotonischer Lösung (dh 75 mM KCl), die auf 37 ° C tropfenweise , während das Drehen des 15 - ml - Röhrchen horizontal und inkubieren bei 37 ° C für 20 min vorgewärmt wird. Siehe Tabelle der Materialien und Reagents für Informationen darüber, wie zu erhalten und hypotonischen Lösung zu machen.
  6. Zentrifugen Zellen bei 120 xg für 5 min bei 4 ° C und wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 3x etwa 200 ul hypotonischen Lösung verlassen, die Zellen nach jeder Wäsche zu resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass das Pellet sichtbar ist weiß und geschwollen am Ende der 3 Wäschen.
  7. Re-suspend das Pellet in 200 ul Carnoy Fixativ Lösung und machen 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1.16 Verdünnungen in Carnoy Fixativ Lösung. Drop-10 & mgr; l jeder Verdünnung auf einem trockenen, sauberen Objektträger von etwa 1 cm über und sofort die Ausbreitung freien Seite zu heißen Dampf aus Wasser für 30 Sekunden aus siedendem. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Carnoy Fixativ Lösung zu machen.
  8. Trocknen Sie die Spreads bei Raumtemperatur, Fleck mit 0,1 ug / ml Hoechst-33342 durch Eintauchen für 15-20 min in Coplin Jar und waschen 3x mit DPBS. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie die Hoechst-33342-Lösung zu machen.
  9. Ansicht verbreitet sich auf Fluoreszenz / Phasenkontrast-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Nach Ausbreitung Vorbereitung zu optimieren, braucht nicht Spreads mit Hoechst-33342 gefärbt werden. Ansicht breitet sich auf Phasenkontrast - Mikroskop bei 10 - facher Vergrößerung Ausbreitung Qualität und Trennung , um zu bestimmen , wie im Abschnitt Ergebnisse umrissen (siehe Abbildung 3).
  10. Wählen und umkreisen gute Spreads mit einem Diamond Point Markierung auf der gegenüberliegenden Seite des Schiebers (dh verteilt freie Seite).
  11. Store spreizt bei -20 ° C für bis zu einem Monat. Vermeiden Sie die Einwirkung von Feuchtigkeit.

3. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

  1. Stabilisierende und Entwässern Spreads
    HINWEIS: Äquilibrieren Metaphasechromosom breitet sich auf Raumtemperatur gelagert, wenn bei -20 ° C. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Reagenzien zu erhalten und zu machen.
    1. Inkubieren Metaphasechromosom verbreitet mit 200 & mgr; l RNase A für1 h bei 37 ° C.
    2. Wasch gleitet in 2x SSC-Puffer zweimal für jeweils 5 min, gefolgt von 10 mM HCl-Lösung gespült wird.
    3. Inkubieren Spreads mit 1% Pepsin für 10 min bei 37 ° C, Spülen mit VE - H 2 O und wäscht zweimal mit 2x-SSC - Puffer für jeweils 5 Minuten.
    4. Inkubieren Spreads mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten und waschen in 2x SSC-Puffer zweimal für jeweils 5 Minuten.
    5. Dehydrieren verbreiten, indem sie für 2 Minuten in Ethanol Serie Inkubation: 70%, 80% und 95% Ethanol.
    6. Lufttrockener Rutschen.
  2. Hybridization Spreads mit L1 -markierten Sonden Retrotransposition (dh Sneo)
    ACHTUNG: Für den direkten markierten Sonden, halten weg von Licht zu allen Zeiten. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Reagenzien zu erhalten und zu machen.
    1. Werden 30 ng von Sneo zu Hybridisierungspuffer, Hitze bei 72 ° C für 10 min und kühl für 2 min bei Raumtemperatur.
    2. In 30 ul Sneo Sondenlösung bis eACH Ausbreitung, Deckel mit Deckglas und die Ränder mit Gummi-Zement. Achten Sie darauf, keine Blasenbildung.
    3. Erhitzen Sie die Folie bei 72 ° C für 5 min auf einem Wärmeblock, die Temperatur allmählich auf 37 ° C fallen, und Inkubation über Nacht in einer dunklen feuchten Kammer bei 37 ° C.
  3. Waschen und Anzeigen (oder Addition von sekundären Antikörper)
    ACHTUNG: Für den direkten markierten Sonden, halten weg von Licht zu allen Zeiten.
    HINWEIS: Siehe Tabelle von Materialien und Reagenzien für Informationen darüber, wie vorzubereiten. Die Verwendung von genügend Volumen, um die gesamte Chromosomenspreitung abdecken wird empfohlen. Denken Sie daran, dass überschüssiges Volumen verloren gehen, wenn Deck hinzugefügt wird.
    1. Tauchen Sie Dias in 2x SSC-Puffer Deckgläser zu entfernen.
    2. Waschen Folien durch Eintauchen in 2 × SSC-Puffer bei 45 ° C für 5 min.
    3. Waschen Folien durch Eintauchen in Waschpuffer bei 45 ° C für 5 min, 2x.
    4. Waschen Folien durch Eintauchen in 0,1 x SSC-Puffer bei 45 ° C für 10 min.
    5. Waschen Folien durch Eintauchen in 2 × SSC-Puffer bei 45 ° C für 10 min.
      HINWEIS: Einen Coplin Jar enthält empfohlenen Puffer in einem Wasserbad, justieren Temperatur auf 45 ° C.
    6. Kühlen Folien auf Raumtemperatur äquilibrieren und gleitet in Detektionspuffer.
    7. Für die direkte markierten Sonden, überspringen 3.4.10 Schritt.
    8. Für die indirekte markierten Sonden, Blockpuffer für 20-30 min in Blockieren und Waschen 3x in DPBS.
    9. Inkubieren mit 50 & mgr; l sekundärem Antikörper (beispielsweise 5 & mgr; g / ml Streptavidin-FITC oder αCY3 in Blocking - Puffer) für 1 Stunde.
    10. Waschen Sie Folien in 2 × SSC für 5 min zweimal.
    11. Gegenfärbung mit Hoechst-33342-Lösung (0,1 ug / ml) für 10 min.
      HINWEIS: Diese Färbung erfolgt Chromosomen für die Co-Lokalisation mit der Sonde zu färben.
    12. Waschen Sie in DPBS 3x, fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium, legen Sie ein Deckglas und die Ränder mit Nagellack.
    13. Analysieren L1 Retrotransposition unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop bei 40facher magnification.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Ein schematisches Diagramm des L1 Retrotransposition Vektors ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Vektor besteht aus einem Neomycin - Gen in Antisense - Orientierung zu L1 ORFs , die durch ein Globin - Intron in Sense - Orientierung und sandwichartig von SD und SA Seiten unterbrochen ist. Wenn stabil in ein Chromosom integriert ist L1 mRNA aus dem kombinierten CMV transkribiert und L1-5'UTR Promotor (Abbildung 1). Während RN...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Methodiken wie Sequenzierung ganzer Genome, inverse PCR und Southern - Blotting wurden zu studieren L1 Retrotransposition eingesetzt. Obwohl diese Methoden äußerst wertvoll sind , bei der Suche nach dem L1 Einfügungen treten innerhalb von Genomen, eine verwirrende Herausforderung für alle von ihnen ist die Notwendigkeit für die In-silico - Programmierung zu Sequenzen wieder zusammen. Die FISH - Methodik hier beschrieben entwickelt , um diese Methoden zu ergänzen, insbesondere im Fall von Studi...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, keine potenziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 und ES017274) und AstraZeneca an KSR unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Vorbereitung von Chromosomen-Spreads
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Markierungssonden
Go Tag DNA-PolymerasePromegaM3178
GO Tag 10x farbloser PufferPromegaM3178
Individual dNTPSigmaDNTP10Passen Sie die Konzentration von dATP, dGTP, dCTP auf 2  mM und dTTP bis 1,5  mM in nukleasefreiem Wasser.
dUTP-16-Biotin (0,5  mM)Roche11093070910
dUTP-FITC (0,5  mM)Thermo ScientificR0101
dUTP-CY3 (0,5  mM)SigmaGEPA53022
MIRUS FISH MarkierungskitMIRUSMIR3625
MIRUS FISH MarkierungskitMIRUSMIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up Kit Qiagen1410/0030Jedes PCR-Reinreagenz kann anstelle des NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR-Gerätsverwendet werden. Jedes Thermocycler-Gerät kann zur Amplifikation des Etikettenprodukts verwendet werden.
AgaroseSigmaA9539<
ColcemidLife Technologies 15212-012Colcemid direkt zu Wachstumsmedien bis zu einer Endkonzentration von 0,4 μ2 zugeben; &Mikro; g/ml
1  M KClSigmaP9541Verdünnung 1  M KCl-Lösung bis 75  mM Lösung zur Herstellung der hypotonischen Lösung
Carnoy FixierlösungMischen Sie 3 Volumen Methanol und 1 Volumen Essigsäure, um die Carnoy Fixierlösung herzustellen. Machen Sie es jedes Mal frisch.
MethanolSigma322415
EssigsäureSigma320099
Hoechst-33342Thermo Scientific62249Lösen Sie Hoechst-33342 in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1  mg/ml.
Diamant-PunktmarkiererThermo Scientific750
Frosted SlidesThermo Scientific2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)Life Technologies R001100Um Zellen zu detechnieren, inkubieren Sie die Zelle 5 Minuten lang in Trypsin und inaktiv mit dem gleichen Volumen des vollständigen Mediums.
ObjektträgerVWR48366067
Coplin DosenThermo Scientific107
WärmeblockWärmeblock kann für diesen Zweck verwendet werden, obwohl Blöcke empfohlen werden, die für Heizobjektträger geeignet sind.
Becher (600  ml)SigmaCLS1003600Füllen Sie das Becherglas mit Wasser, erhitzen Sie es zum Kochen, verwenden Sie den heißen Dampf, um die Chromosomen zum Platzen zu bringen.
Nikon MikroskopNikon125690Jedes Mikroskop kann verwendet werden, um die Spread-Qualität zu betrachten.
Reagenzien und Materialien für FISH
TrinatriumcitratSigmaS1804
Natrium ChrorideSigmaS3014
FormamidSigmaF9037
Tween-20SigmaF1379
Detran SulfatSigmaD8906
SDSSigmaL3771
Lachs Sperma DNALife Technologies 15632-011
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA8531
HCl (N)Sigma38283
EthylalkoholSigma459844
MethanolSigma322415
DPBSLife Technologies14190-250
NaOHSigmaS8045
Rnase ASigmaR4642
PepsinSigmaP6887
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP6148
Hoechst-33342Thermo Scientific62249Hoechst-33342 in PBS auflösen bis zu einer Endkonzentration von 1  mg/ml.
Gummizement/Cytobond-Dichtstoff 1.00.2020
Seven Coplin GläserThermo Scientific107
Dunkle Befeuchtete KammerSigmaCLS2551
ObjektträgerVWR48366067
Dry Digital Heat BlockVWR13259
Fluoreszenzmikroskop
20x Kochsalz-Natriumcitrat (20x SSC)Kombinieren Sie 175 g NaCl und 88,2 μμl; g Trinatriumcitrat mit 800 ml H2O. Unter Einstellung auf pH 7 umrühren. Sobald sich alle Salze aufgelöst haben, stellen Sie das Volumen auf 1 l ein und filtern Sie durch 0,22 & Mikro; m Filterpapier. Bei 4 °C lagern.
1  mg/ml Rnase A20x SSC-Puffer auf 2x SSC-Puffer verdünnen. RNase A in 2x SSC-Puffer auf eine Endkonzentration von 1  mg/ml. Stellen Sie jedes Mal eine frische Lösung her.
1% Pepsin Pepsin(W/V) in 10 mM HCl bis zu einer Endkonzentration von 1% iger Lösung auflösen. Jedes Mal frisch machen.
4% Paraformaldehyd (4% PFA)4,0 g PFA im Abzug abwiegen, 50 ml 1xPBS zugeben, auf 60  erhitzen; ° C unter Rühren und stellen Sie den pH-Wert mit Tropfen NaOH ein, bis sich das gesamte PFA aufgelöst hat und die Lösung klar wird. Stellen Sie die Lautstärke auf 100  ein ml, Filter durch 0,22 &Mikro; m Filtern Sie das Papier und lagern Sie 5 ml Aliquots bei -20  °C. Auftauen aliquot von PFA bei 37 ° C für 10-15 min für spätere Anwendungen. Passen Sie die Filtergröße in Abhängigkeit von der Menge an Paraformaldehyd an.
Wash BufferKombinieren Sie 100 ml Formamid (20%) mit 2,5 ml 20x SSC, stellen Sie es mit 1,0 M HCl auf pH 7 ein und bringen Sie das Volumen auf 500 ml mit H2O.
HybridisierungspufferKombinieren Sie 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 0,1 % SDS und 300 ng/ml Lachsspermien-DNA in 2x SSC-Puffer. Die Menge an Formamid bestimmt, wie fokussiert die Chromatiden sind; Titrieren Sie den Betrag.
NachweispufferVerdünnen Sie den 20-fachen SSC-Puffer auf das 4-fache und fügen Sie 0,2 % Tween-20 hinzu, um einen Nachweispuffer herzustellen.
KombinierenSie 5 % Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,2 % Tween-20 in 4x SSC-Puffer.
DehydratisierungslösungStellen Sie 70 %, 80 % und 95 % ige Ethanollösungen her.
td colspan="4"> Jeder

Referenzen

  1. Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
  2. Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
  3. Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
  4. Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
  5. Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
  6. Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
  7. Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
  8. Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
  9. Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
  10. Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
  11. Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
  12. Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
  13. Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
  14. Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
  15. Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
  16. Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
  17. Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
  18. Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
  19. Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
  20. Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
  21. Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
  22. McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
  23. Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
  24. Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
  25. Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Fluoreszenz in situ HybridisierungEinzelkernanalyseHepG2 ZellenSNeo SondenmarkierungMetaphase Chromosomenpr parateFITC CY3 SondenBehandlung mit hypotoner L sungCarnoy FixierungsmethodeDAPI Ebettungsmedium
Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.