Summary
Hier beschäftigen wir FISH - Methodik LINE-1 - Retrotransposition an der einzelnen Kerne Ebene in Chromosom Spreads von HepG2 - Zelllinien stabil synthetischen LINE-1 exprimieren , zu verfolgen.
Introduction
Menschliche Lange streute Kern Element-1 (Linie-1 oder L1) ist eine autonome mobile Element , das durch eine im Genom ausbreitet "Kopieren und Einfügen" Retrotransposition Mechanismus. Ein typisches menschliches L1 ~ 6 kb lang und besteht aus einer 5' - UTR (untranslatierte Region), die als Promotor dient, zwei offene Leserahmen (ORFs): L1 -ORF1 und L1 -ORF2 und eine 3'UTR mit einem polyA . Schwanz L1 -ORF1 Protein hat drei verschiedene Bereiche: eine Spule-Coil - Domäne, RNA - Erkennungsmotiv und C-terminale Domäne, während L1 -ORF2 Protein Endonuklease hat, reverse Transkriptase und Cystein reiche Domänen 1.2.3.4.5. L1 -ORF1 zeigt Nukleinsäure Chaperon - Aktivitäten, während L1 -ORF2 enzymatischen Aktivitäten bietet, wobei beide für Retrotransposition benötigten Proteine 1,2,6.
Ein Zyklus von L1 Retrotransposition beginnt mit der Transkription von der 5'UTR von L1 L1 -ORF1 weist entweder cis -Bindung , wo es seine eigene RNA oder trans -Bindung Pakete , wo es andere RNAs Pakete (dh Sinus- / SVAS / pseudogenes) 7 ein Ribonukleoprotein Partikel (RNP) mit L1 -ORF2p zu bilden, 8. RNPs Translokation in den Zellkern , wo die Endonuklease - Aktivität von L1 -ORF2p Scharten genomische DNA (gDNA) eine OH zu belichten - Gruppe 9, die wiederum durch die reverse Transkriptase zu primen verwendet wird und synthesize RNA zu DNA vom 3' - Ende umzukehren. Während der Rückwärts Synthese wird der zweite DNA - Strang 7-20 bp von der ursprünglichen nick Website geklaut zu versetzten Pausen schaffen , die die Signatur L1 Insertionssequenzen (zB TTTTAA) genannt Zielstelle Vervielfältigungen (TSD) 9,10 zu bilden , gefüllt sind. Dieser Vorgang wird als Ziel prime reverse Transkription (TPRT) bekannt und führt zu insertiauf der vollständigen oder abgeschnittene Kopien von L1 / andere DNAs mit TSD an beiden Enden der eingefügten Sequenz. L1 Retrotransposition auch durch TPRT artigen nicht-homologe end-joining in einigen Zelltypen 11 vermittelt zu werden hat sich gezeigt.
Der L1 - Vektor Retrotransposition in unseren Studien verwendeten nicht-episomale und besteht aus getaggt L1 -ORF1 & 2p angetrieben durch kombinierte CMV-Promotoren L1-5'UTR (Abbildung 1) 12. Frühere Versionen dieses Konstrukts wurden 13,14,15 in Studien unter Verwendung von Hefe und menschlichen Zellkulturen beschrieben. Zwei verschiedene CMV-Promotoren in der 5 'angeordnet und 3'-Enden des Vektors, mit dem 3'-Ende in umgekehrter Ausrichtung angeordnet Expression von Neomycin nach dem Spleißen und Integration zu fahren. Der Retrotransposition Indikator Kassette an dem 3' - Ende besteht aus einem Neomycin - Gen insertiert Antisense zu L1 -ORFs und durch eine glob inaktiver durch Trennung in zwei Hälften gemachtin Intron mit gespleißten Donor (SD) und gespleißt Akzeptor (SA) -Stellen (Abbildung 1). Bei der Integration in ein Chromosom, wird L1 von dem gemeinsamen Promotor transkribiert , um eine mRNA produzieren , die von einer bicistronischen mRNA und inaktive Neomycin mRNA besteht. Während RNA Verarbeitung wird das Globin-Intron aus dem Neomycin-Gen gespleißt eine voll funktionsfähige Neomycin-Gen wiederherzustellen. Die Hybrid - mRNA wird in ein RNP in cis verpackt und in den Zellkern transloziert , wo es in das Genom entweder in voller Länge oder abgeschnittene Einfügungen Verwendung TPRT integriert ist.
Hier beschreiben wir eine Methode , die Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (FISH) mit Sonden verwendet speziell auf die gespleißten Neomycin - Gen gerichtet (Sneo) an der einzigen Kern Ebene L1 -retrotransposiition Muster und Einbringungsraten zu verfolgen. Die Effizienz und Spezifität des Nachweises wurde unter Verwendung von Retrotransposition kompetenten und inkompetenten Konstrukte und Sonden bestätigt detect Sneo oder das Neomycin und Intron - Übergang Globin - 16. Diese Methodologie macht einige der Mängel der Zellkultur-Assays Retrotransposition, beispielsweise mehrere Einfügungen, kolonieBeständigkeit und günstige clone Expansion.
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Protocol
HINWEIS: Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wenn nicht anders angegeben. Bitte beachten Sie Reagenzien für Details auf, wie einzelne Reagenzien herzustellen.
1. Kennzeichnung L1 Probes
HINWEIS: Die Sonden können durch chemische oder PCR-Kennzeichnung versehen werden.
- chemische Markierung
- Machen 0,7-1% Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA (TAE) -Puffer, Wärme in einer Mikrowelle, bis sie geschmolzen, erlauben das Gel abkühlen, und fügen Ethidiumbromid (0,5 ug / ml). Gießen Sie in Gelträger, fügen Sie Kämme und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu verfestigen.
- Beschriften der Sneo Sonde (1-2 ug) mit CY3 oder FITC bei 37 ° C für 1 Stunde nach dem Protokoll des Herstellers.
HINWEIS: Sneo bezeichnet die S nach einem vollen Zyklus der Retrotransposition ausgedrückt Neo mycin Gen pliced. Die Sonde ist ~ 1000 bp groß. Sneo kann PCR von jedem Vektor verstärkt werden oder von genomic-DNA. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen über Streptavidin-Cy3 / FITC-Markierungsreagenzien. - Mischen Sie die markierten Sneo Sondenlösung mit 1x DNA-Ladepuffer, Last in jede Vertiefung und laufen bei 75-100 Volt für 15-20 min.
- Visualisieren Sie die Sonde Band eine Ultraviolett (UV) Illuminator verwenden. Man beachte , dass die Größe der Sneo Sonde eingestellt werden kann , und dass Lock - Kerne Säure (LNA) können ebenfalls hinzugefügt werden (Abbildung 2).
- Cut Sneo Sonde aus dem Gel mit einem sauberen Messer markiert, löslich zu machen und die Sneo Sonde aus dem Gel unter Verwendung eines PCR-Clean-Up-Kit reinigen dem Protokoll des Herstellers nach.
VORSICHT: Abdeckung jeder exponierten Teil des Körpers mit Schutzschilden (dh Laborkittel und UV - Klargesichtsmaske) beim Betrachten und das Gel zu schneiden. Siehe Tabelle Material- und Reagenzien für die Informationen zu Gel reinigen PCR-Produkte. - Re-run 5 ul Sneo markierten Sonde mit einem nicht-markierten Sneo Sonde auf einem 0,7% Agarose-Gel (siehe 1.1.1) conUnternehmensgröße zu erhöhen und Verlust der Signalintensität (Abbildung 2).
- Quantifizierung der Menge an markiertem Sneo Sonde durch die Absorption bei 260 nm zu messen und verdünnt das Sneo Sonde 10 ng / & mgr; l Aliquots in Nuklease freiem H 2 O. Store Aliquots bei -20 ° C.
- PCR - Labeling (Alternatives Verfahren zur Sondenmarkierung)
- Kombinieren Sie Sneo spezifische Primer (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'und 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') mit PCR - Reagenzien in einem einzigen Rohr: 13,6 ul nukleasefreiem H 2 O; 0,1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ul dTTP (10 nM); 0,05 & mgr; l dUTP-Biotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul gehen Tag 5x Puffer; 0,4 ul gehen Tag Polymerase; 1 ul Sneo-Vorlage (10 ng). Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen über die PCR-Reagenzien.
- Stellen Sie die Menge jedes Reagens durch durch die Gesamtzahl der Proben multipliziert wird.
- Verwenden Sie das folgende PCR-Zyklen Parameters zu amplifizieren und Etiketten Sneo Sonden: 95 ° C für 2 min; 35 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 62 ° C für 30 sec, 72 ° C für 60 sec; 72 ° C für 2 min; Halten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit.
HINWEIS: Die Glühtemperatur eingestellt werden kann oder Gradienten PCR kann optimal Glühtemperaturen für andere Sonden zu bestimmen, durchgeführt werden. - Machen Sie 0,7-1% Gel, wie in Abschnitt 1.1.1, Last und visualisieren die Sonde Band, wie in Abschnitt 1.1.4.
- Schneiden Sie und reinigen die markierten Sneo Sonde, wie in Abschnitt 1.1.5.
- Re-run 5 ul Sneo markierten Sonde mit un-markierten Sneo Sonde Größenzunahme und Verlust der Signalintensität zu bestätigen (siehe Abbildung 2).
- Quantifizierung der Menge an markiertem Sneo Sonde durch Messung der Absorption bei 260 nm und verdünnter Sneo Sonde 10 ng / & mgr; l Aliquots in Nuklease freiem H 2 O.
2. Vorbereitung Chromosome Aufstriche
- Generieren stabile Klone Vektorgerüst exprimieren (control) oder Retrotransposition zuständigen L1 unter Verwendung von Standardauswahlmethoden. 12,16 Während nicht-episomale Reporter wurden verwendet , um Ergebnisse mit Studien der Transkription, episomale Vektoren können auch verwendet werden zu korrelieren. Wachsen Zellen stabil exprimieren Kontrolle oder L1 - Vektor (1 x 10 6 Zellen pro 10 cm Platte, mit Anpassungen in Plattengröße hergestellt nach Bedarf) in komplettem Wachstumsmedium. Für HepG2-Zellen verwenden RPMI-1600, 10% FBS und 200 & mgr; g / ml Hygromycin. Wachsen Kulturen zu 70% Konfluenz bei 37 ° C und 5% CO 2.
HINWEIS: Die Wahl des Wachstumsmediums ist abhängig vom Zelltyp. Da die Plasmide tragen hier Selektionskassetten sowohl für Hygromycin und Neomycin, stabile Selektion von Klonen verwendet, könnte auch mit Neomycin nach Selektion auf Hygromycin durchgeführt werden, aber die Menge an Neomycin muss optimiert werden Toleranzwerte für jeden Zelltyp herzustellen. - In Colcemid (0,4 ug / ml) zu Kulturmedium und Inkubation für 90 min Zellen bei Metaph zu verhaftenase. Wenn verschiedene Zelltypen verwendet, bestimmen die optimale Konzentration von Colcemid und Zeit der Belichtung (60, 90 und 120 min) für eine optimale Verhaftung Metaphase empirisch.
- Wasche die Zellen 2x mit 10 ml 1x Dulbecco-PBS (DPBS), trypsinize von 3-5 ml Zugabe von 0,25% Trypsin-Lösung zu den Zellen und inkubiere für 5 min, um die Zellen zu lösen. Inaktivieren Trypsin mit einer gleichen Menge an Medium 10% FBS enthielt.
- Zentrifugation der Zellen für 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C absaugen Medium vom Zellpellet und wasche die Zellen mit DPBS. Absaugen alle DPBS, so dass 200 ul DPBS, um die Zellen erneut zu suspendieren. Stellen Sie sicher, Zellen sind gut gemischt, und dass alle Klumpen verteilt sind. Verwenden Sie Flackern oder vorsichtiges Pipettieren zu mischen und zu verteilen Klumpen und vermeiden Verwirbelung.
- 5 ml hypotonischer Lösung (dh 75 mM KCl), die auf 37 ° C tropfenweise , während das Drehen des 15 - ml - Röhrchen horizontal und inkubieren bei 37 ° C für 20 min vorgewärmt wird. Siehe Tabelle der Materialien und Reagents für Informationen darüber, wie zu erhalten und hypotonischen Lösung zu machen.
- Zentrifugen Zellen bei 120 xg für 5 min bei 4 ° C und wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 3x etwa 200 ul hypotonischen Lösung verlassen, die Zellen nach jeder Wäsche zu resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass das Pellet sichtbar ist weiß und geschwollen am Ende der 3 Wäschen.
- Re-suspend das Pellet in 200 ul Carnoy Fixativ Lösung und machen 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1.16 Verdünnungen in Carnoy Fixativ Lösung. Drop-10 & mgr; l jeder Verdünnung auf einem trockenen, sauberen Objektträger von etwa 1 cm über und sofort die Ausbreitung freien Seite zu heißen Dampf aus Wasser für 30 Sekunden aus siedendem. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Carnoy Fixativ Lösung zu machen.
- Trocknen Sie die Spreads bei Raumtemperatur, Fleck mit 0,1 ug / ml Hoechst-33342 durch Eintauchen für 15-20 min in Coplin Jar und waschen 3x mit DPBS. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie die Hoechst-33342-Lösung zu machen. <li> Ansicht verbreitet sich auf Fluoreszenz / Phasenkontrast-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Nach Ausbreitung Vorbereitung zu optimieren, braucht nicht Spreads mit Hoechst-33342 gefärbt werden. Ansicht breitet sich auf Phasenkontrast - Mikroskop bei 10 - facher Vergrößerung Ausbreitung Qualität und Trennung , um zu bestimmen , wie im Abschnitt Ergebnisse umrissen (siehe Abbildung 3).
- Wählen und umkreisen gute Spreads mit einem Diamond Point Markierung auf der gegenüberliegenden Seite des Schiebers (dh verteilt freie Seite).
- Store spreizt bei -20 ° C für bis zu einem Monat. Vermeiden Sie die Einwirkung von Feuchtigkeit.
3. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
- Stabilisierende und Entwässern Spreads
HINWEIS: Äquilibrieren Metaphasechromosom breitet sich auf Raumtemperatur gelagert, wenn bei -20 ° C. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Reagenzien zu erhalten und zu machen.- Inkubieren Metaphasechromosom verbreitet mit 200 & mgr; l RNase A für1 h bei 37 ° C.
- Wasch gleitet in 2x SSC-Puffer zweimal für jeweils 5 min, gefolgt von 10 mM HCl-Lösung gespült wird.
- Inkubieren Spreads mit 1% Pepsin für 10 min bei 37 ° C, Spülen mit VE - H 2 O und wäscht zweimal mit 2x-SSC - Puffer für jeweils 5 Minuten.
- Inkubieren Spreads mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten und waschen in 2x SSC-Puffer zweimal für jeweils 5 Minuten.
- Dehydrieren verbreiten, indem sie für 2 Minuten in Ethanol Serie Inkubation: 70%, 80% und 95% Ethanol.
- Lufttrockener Rutschen.
- Hybridization Spreads mit L1 -markierten Sonden Retrotransposition (dh Sneo)
ACHTUNG: Für den direkten markierten Sonden, halten weg von Licht zu allen Zeiten. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Reagenzien zu erhalten und zu machen.- Werden 30 ng von Sneo zu Hybridisierungspuffer, Hitze bei 72 ° C für 10 min und kühl für 2 min bei Raumtemperatur.
- In 30 ul Sneo Sondenlösung bis eACH Ausbreitung, Deckel mit Deckglas und die Ränder mit Gummi-Zement. Achten Sie darauf, keine Blasenbildung.
- Erhitzen Sie die Folie bei 72 ° C für 5 min auf einem Wärmeblock, die Temperatur allmählich auf 37 ° C fallen, und Inkubation über Nacht in einer dunklen feuchten Kammer bei 37 ° C.
- Waschen und Anzeigen (oder Addition von sekundären Antikörper)
ACHTUNG: Für den direkten markierten Sonden, halten weg von Licht zu allen Zeiten.
HINWEIS: Siehe Tabelle von Materialien und Reagenzien für Informationen darüber, wie vorzubereiten. Die Verwendung von genügend Volumen, um die gesamte Chromosomenspreitung abdecken wird empfohlen. Denken Sie daran, dass überschüssiges Volumen verloren gehen, wenn Deck hinzugefügt wird.- Tauchen Sie Dias in 2x SSC-Puffer Deckgläser zu entfernen.
- Waschen Folien durch Eintauchen in 2 × SSC-Puffer bei 45 ° C für 5 min.
- Waschen Folien durch Eintauchen in Waschpuffer bei 45 ° C für 5 min, 2x.
- Waschen Folien durch Eintauchen in 0,1 x SSC-Puffer bei 45 ° C für 10 min.
- Waschen Folien durch Eintauchen in 2 × SSC-Puffer bei 45 ° C für 10 min.
HINWEIS: Einen Coplin Jar enthält empfohlenen Puffer in einem Wasserbad, justieren Temperatur auf 45 ° C. - Kühlen Folien auf Raumtemperatur äquilibrieren und gleitet in Detektionspuffer.
- Für die direkte markierten Sonden, überspringen 3.4.10 Schritt.
- Für die indirekte markierten Sonden, Blockpuffer für 20-30 min in Blockieren und Waschen 3x in DPBS.
- Inkubieren mit 50 & mgr; l sekundärem Antikörper (beispielsweise 5 & mgr; g / ml Streptavidin-FITC oder αCY3 in Blocking - Puffer) für 1 Stunde.
- Waschen Sie Folien in 2 × SSC für 5 min zweimal.
- Gegenfärbung mit Hoechst-33342-Lösung (0,1 ug / ml) für 10 min.
HINWEIS: Diese Färbung erfolgt Chromosomen für die Co-Lokalisation mit der Sonde zu färben. - Waschen Sie in DPBS 3x, fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium, legen Sie ein Deckglas und die Ränder mit Nagellack.
- Analysieren L1 Retrotransposition unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop bei 40facher magnification.
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Representative Results
Ein schematisches Diagramm des L1 Retrotransposition Vektors ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Vektor besteht aus einem Neomycin - Gen in Antisense - Orientierung zu L1 ORFs , die durch ein Globin - Intron in Sense - Orientierung und sandwichartig von SD und SA Seiten unterbrochen ist. Wenn stabil in ein Chromosom integriert ist L1 mRNA aus dem kombinierten CMV transkribiert und L1-5'UTR Promotor (Abbildung 1). Während RNA Verarbeitung wird das Globin-Intron aus dem Neomycin-Gen gespleißt. Die Neo- L1 RNA verpackt ist , transloziert und integriert in das Genom entweder als ein voller Länge oder abgeschnitten Insertion. Wie angegeben, können L1 Retrotransposition durch FISH unter Verwendung von Sonden , die spezifisch für gespleißte Neomycin (Abbildung 1) verfolgt werden.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung der Neomycin - Sonde, mit der labeled sondiert, die größer in der Größe und Fluoreszenz defizienten aufgrund von Unterschieden bei Anregungswellenlängen. Beachten Sie, dass die Cy3 und FITC erregen bei verschiedenen Wellenlängen als Ethidiumbromid gefärbte DNA.
2, 1: 4, 1: Die Dichte des Chromosoms Spreads Metaphase wurde durch Verdünnen der ursprünglichen Stammlösung in 1 bestimmt 8 und 01.16 Verdünnungen und jede Strecke für die Dichte, Verteilung und Entfernung der Spreads aus dem Kern in 10-facher Vergrößerung ausgewertet ( 3A). Die Ergebnisse zeigen eine hohe Dichte, klumpig und brach Spreads (3A-i-ii) sowie gleichmäßig verteilt und gut verteilte Spreads (3A-iii-iv). Niedrige Dichte breitet sich bei gleichmäßiger Verteilung für die nachfolgende Analyse ausgewählt wurden.
Chromosome Spreads wurden gefärbt mit Hoechst-Farbstoff und Ausbreitung Qualität von der Länge der Chromosomen, die Rundheit der s basiert ausgewertetpreads und inter-Chromosoms Abstand (3B). Diese Indizes wurden durch die Länge der Zeit beeinflusst die Zellen mit Colcemid behandelt wurden, hypotonischen Lösung, Carnoy-Fixativ Lösung und / oder die Art und Weise, in der die Zellen wurden gesprengt, um Chromosomen lösen. Wenn Zellen für einen kurzen Zeitraum in hypotonischen Lösung inkubiert wurden, wurde Chromosom - Spreads fest verknotet und einzelne Chromosomen waren schwer zu visualisieren (3B-i). Auf der anderen Seite, eine längere Inkubation in hypotonischen Lösung ergab Bruch der Kerne, Verstreuen von Chromosomen und / oder Verlust von Chromosomen (3B-ii). Längere Inkubationen in Colcemid die Anzahl der Zellen in der Metaphase erhöht, aber zur Kondensation der Chromosomen (3B-iii) führen. Als solches erfordert eine gute Qualität Chromosomenspreitung optimale Inkubationszeiten sowohl Colcemid und hypotone KCl-Lösung. In unseren Händen, eine 90 min Inkubation in Colcemid, 20 in hypotonischen Lösung bei 37° C und die Verwendung eines heißen Wasserdampf wurden die Zellen zum Platzen gefunden für optimale Bedingungen zu Erzeugung hoher Qualität Aufstriche (3B-iv).
Chromosome Spreads wurden gefärbt für L1 Retrotransposition unter Verwendung von Sonden , die Sneo Ziel. Die Sonde wurde sowohl mit FITC und Cy3 markiert zu zeigen , dass in beiden Fällen L1 Retrotransposition nur in Zellen gesehen wird Wildtyp - L1 exprimierenden (Abbildung 4). (; Vergleiche Deckel- und Bodenplatten für jedes Fluorophor Abbildung 4) Keine Färbung wurde in Zellen, die das Vektorgerüst alleine gesehen. In unseren Händen wurde Sondensignals in 80-90% der Kerne, mit der überwältigenden Mehrheit des Signals repräsentieren einzelne Ereignisse Retrotransposition erkannt. Wir erzielte nur in Retrotransposition Kerne mit mehr als einer Einführung und Verbreitung Qualität war immer vor FISH untersucht.
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der L1 Retrotransposition Vektor. Diagramm zeigt den Prozess der Ziel prime reverse Transkription zu voll oder abgeschnittene L1 Einfügungen führen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Beschriftet Sneo und unmarkierten Neomycin - Sonden. Die markierte Sonde zeigt weniger Fluoreszenz und ist größer im Vergleich zu den nicht - markierten Sonde. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Phasenkontrast (Bright Field) und Hoechst Fleck Chromosom Spreads. A) zeigt Verdünnung von Aufstrichen gut verteilte Präparate zu erhalten. Maßstabsbalken ist 50 um. B) Hoechst - Färbung Chromosom den Einfluss von Colcemid, hypotonischen Lösung zeigt, Carnoy Fixativ Lösung und dem Platzen auf Spread - Qualität. Maßstabsbalken ist 10 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. FISH - Analyse von L1 Retrotransposition. Die Färbung der Sneo ist in Kontrollzellen nicht vorhanden, aber in Zellen, die L1 - Wildtyp - Vektor. Maßstabsbalken ist 10 & mgr; m.Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Methodiken wie Sequenzierung ganzer Genome, inverse PCR und Southern - Blotting wurden zu studieren L1 Retrotransposition eingesetzt. Obwohl diese Methoden äußerst wertvoll sind , bei der Suche nach dem L1 Einfügungen treten innerhalb von Genomen, eine verwirrende Herausforderung für alle von ihnen ist die Notwendigkeit für die In-silico - Programmierung zu Sequenzen wieder zusammen. Die FISH - Methodik hier beschrieben entwickelt , um diese Methoden zu ergänzen, insbesondere im Fall von Studien Analysen von ektopischen L1 Retrotransposition in kultivierten Zellen erfordern. Der Ansatz kann sowohl für quantitative als auch qualitative Bewertung der Retrotransposition Veranstaltungen genutzt und angewendet werden Kerne Interphase. Diese Methode bietet die Genauigkeit der nachfolgenden in-silico - Methoden Sequenzabgleich verwendet , um ektopische L1 Insertionsstellen 16 bestimmen. Alignment von repetitiven Sequenzen können aufgrund der Bildung von Homopolymeren mehrdeutig sein, während sich wiederholende Sequenwährend der Primer Amplifikation von Template verloren werden, was zu Unterrepräsentation von repetitiven Sequenzen ces können. FISH - Methodik können diese Probleme zu überwinden , weil FISH - Sonden Homo anlagern können und sind unwahrscheinlich , gegen 16 intakte Wiederholungssequenzen vorgespannt werden. Darüber hinaus, im Vergleich zu Zellkultur-basierten Assays Retrotransposition, können FISH Retrotransposition Preise im einzigen Kern Ebene bestimmen. Als solches verhindert dieser Ansatz sowohl unter als auch über Abschätzung der Retrotransposition Raten als mehrere Einfügungen in einzelne Kerne 16 auftreten können. Die jüngsten Daten von NGS erhalten haben bestätigt , dass die Zellkultur - Methoden unterschätzen Retrotransposition Frequenzen 25.
Es bleibt unklar , wo junge L1s bevorzugen einzusetzen und zu, ob ein Zielmechanismus existiert diese Einfügungen innerhalb des Genoms zu lenken. Unter Verwendung der obigen Methodik haben wir gezeigt , dass L1 - Gen schlecht re bevorzugt in EinsätzeRegionen des Genoms 16. Andere haben gezeigt , dass die Fülle der L1 - Sequenzen ist Zunahme in Chromosomen mit einer geringeren Dichte Gen 17,18. Zusammen deuten diese Ergebnisse einen geregelten Betrieb des Einsetzens , wo Gefahren für die Zelle durch das Einfügen von L1 in die "weniger aktiv" Regionen des Genoms minimiert werden. Das Muster der Transposon-Element Bewegung in niederen Organismen hat die Unterstützung dieser Interpretation verliehen. Zum Beispiel Spalthefe Retrotransposons, Tf1, integriert 95% der Zeit vor Gen - Promotoren und die meisten dieser Gene sind in Stressregulation 19,20 beteiligt. In Hefezellen, die den Zugang zu Stickstoff fehlt integriert TY5 in die ORFs anstelle von Heterochromatin Bereiche 21. Führen zu vielfältigen Farb corn Phänotypen und Integration von Hatvine1-RRM DNA Transposon influen in die Promotorregion des Gens VvTFL1A wurde gezeigt , Versuche in Mais haben , dass die Integration von DNA - Transposons gezeigtenCE Das Verzweigungsmuster und die Fruchtgröße von Weinreben 22,23.
Die Schritte entscheidend für den Erfolg der FISH-Methodik detailliert hier sind die Erzeugung von guten Chromosom-Spreads und ordnungsgemäße Kennzeichnung, Reinigung und Hybridisierung von Sonden. Wenn Sonden nicht richtig gereinigt werden, wird die daraus resultierende hohe Hintergrundsignal machen es schwierig, Sonde Bindung an Chromosomen zu lösen. Vorzugsweise sollten Sonden gelgereinigt sein Restfluoreszenz von dNTPs zu beseitigen. die Länge der Zeit, auch die Spreads in Carnoy Fixativ Lösung inkubiert werden, ist wichtig, um gute Chromosom Spreads vorzubereiten. Wenn zu lange, kann die Zellmembran vorzeitig platzen und Chromosomenverlust führen. Wenn zu kurz, kann es schwierig sein, geeignete Aufstriche Ruptur aufgrund defizienten Membran zu erhalten. Die Menge / Konzentration von Formamid bestimmt den Schwerpunkt der Chromatiden und daher ist es wichtig, für die besten Ergebnisse empirisch zu optimieren. Alle Waschungen sollten gründlich ens seinure, dass alle ungebundenen Sonden und Sekundärantikörper abgewaschen werden.
Abschließend kann die FISH hier beschriebene Methode verwendet werden , um sowohl in voller Länge und abgeschnittene ektopische L1 Retrotransposition Ereignisse zu erkennen und kann auf andere Retrotransposition unter Verwendung von Vektoren grün fluoreszierendes Protein (GFP) als Indikator Retrotransposition Kassette angewendet werden. Obwohl volle Länge L1 Einfügungen mit dieser Methode bestimmt werden kann, wird es nicht neu endogene trunkierten Einfügungen erkennen aufgrund der Anzahl von verkürztem L1 s innerhalb des Genoms. Die Zugänglichkeit der Sonde könnte auch durch eine Erhöhung Heterochromatinbildung 16,24 eingeschränkt werden. Jedoch kann der Einschluss von LNA in FISH-Sonden eingesetzt werden Sonde Tempern zu erhöhen. Der Nachweis von Sneo ist abhängig von einem vollen Zyklus der Retrotransposition und Einfügungen kleiner als die Sonde / Löschen übersehen werden.
Detaillierte Beschreibungen von Experimenten in which die Verwendung dieser Vektoren und die Expression von L1 - Proteine und Retrotransposition gekennzeichnet sind, entnehmen Sie bitte arbeitet 12,16 veröffentlicht.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine potenziellen Interessenkonflikte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
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