Summary
Aqui nós utilizamos a metodologia FISH para rastrear LINE-1 retrotransposição no nível núcleos único dos spreads de cromossomos de linhas celulares HepG2 expressam de forma estável LINE-1 sintético.
Introduction
Humano longo Intercaladas Nuclear Elemento-1 (Linha-1 ou L1) é um elemento móvel autônomo que se propaga dentro do genoma através de um "copiar e colar" mecanismo de retrotransposição. Um L1 humano típico é ~ 6 kb de comprimento e é composto por uma 5'UTR (região não traduzida) que serve como um promotor, duas grelhas de leitura abertas (ORFs): L1 e L1 -ORF1 -ORF2, e um 3'UTR com um poliA . -ORF1 cauda proteína L1 tem três domínios distintos: um domínio de bobina da bobina, ARN reconhecimento do motivo e domínio C-terminal, enquanto que a proteína L1 -ORF2 tem endonuclease, transcriptase reversa e rico em cisteína domínios 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 exibe actividades chaperonas de ácido nucleico, enquanto L1 -ORF2 fornece actividades enzimáticas, com ambas as proteínas necessárias para a retrotransposição 1,2,6.
Um ciclo de L1 retrotransposição começa com a transcrição da 5'UTR de L1 L1 -ORF1 exposições quer liga�o ao cis em que empacota o seu próprio RNA ou trans onde liga�o ao empacota outros ARN (isto é, forma de seno / Svas / pseudogenes) para formar uma partícula ribonucleoproteica (RNP) com L1 -ORF2p 7, 8. RNP translocar para o núcleo, onde a actividade de endonuclease de L1 -ORF2p cortes de ADN genómico (ADNg) para expor um OH - Grupo 9, que por sua vez é usado por transcriptase reversa para escorvar e reverso de ARN a sintetizar ADN a partir da extremidade 3 '. Durante a síntese inverso, a segunda cadeia de ADN é cortado 7-20 pb a partir do site original nick para criar quebras escalonados que são preenchidos para formar a assinatura sequências de inserção L1 (por exemplo, TTTTAA) chamados duplicações no local alvo (TSD) 9,10. Este processo é conhecido como o principal alvo da transcrição reversa (TPRT) e leva a insertina de cópias completas ou truncadas de L1 / outros ADNs com TSDs em ambas as extremidades da sequência inserida. L1 retrotransposição também tem sido mostrado para ser mediada através TPRT semelhante de extremidades não homólogas-se juntar, em alguns tipos de células 11.
O vector de L1 retrotransposição empregue nos nossos estudos é não-epissomal e consiste em etiquetado L1 -ORF1 & 2p impulsionado por promotores CMV-L1-5'UTR combinadas (Figura 1) 12. As versões anteriores desta construção foram descritos em estudos utilizando leveduras e culturas de células humanas 13,14,15. Dois promotores de CMV distintas localizadas nas extremidades 5 'e 3' do vector, com a extremidade 3 'colocado na orientação inversa, para dirigir a expressão da neomicina após splicing e integração. A cassete de indicador retrotransposição na extremidade 3 'de um composto anti-sentido do gene inserido a neomicina L1 -ORFs e tornada inactiva por separação em duas metades por uma globno intrão com splicing dador (SD) e locais de splicing aceitador (SA) (Figura 1). Após a integração num cromossoma, L1 é transcrito a partir do promotor comum para produzir um ARNm que consiste de um ARNm bicistrónico e ARNm neomicina inactivo. Durante o processamento de ARN, o intrão de globina é spliced out do gene da neomicina para restaurar um gene da neomicina totalmente funcional. O ARNm híbrido é embalada em uma RNP em cis e translocado para o núcleo, onde ele é integrado no genoma como qualquer um de comprimento completo ou truncadas, utilizando inserções TPRT.
Aqui nós descrevemos uma metodologia que utiliza hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas especificamente dirigidas ao gene neomicina emendado (Sneo) para rastrear padrões de -retrotransposiition L1 e as taxas de inserção no nível de núcleo único. A eficiência e especificidade da detecção foi confirmada usando retrotransposição competente e construções incompetentes e sondas para detect Sneo ou a neomicina e globina junção intron 16. Esta metodologia é responsável por algumas das deficiências de ensaios retrotransposição base de cultura de células, tais como várias inserções, resistência à colónia e expansão clone favorável.
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Protocol
NOTA: Todos os passos devem ser realizados à temperatura ambiente a menos que especificado de outra forma. Consulte a seção Reagentes para obter detalhes sobre como preparar reagentes individuais.
1. Rotulagem L1 Sondas
NOTA: As sondas podem ser marcadas através de marcação química ou PCR.
- marcação química
- Adicione 0,7-1% de gel de agarose em Tris-acetato-EDTA (TAE) tampão, calor num forno de microondas até derreter, permitir que o gel arrefecer, e, em seguida adicionar brometo de etídio (0,5 ug / ml). Verter em tabuleiro de gel, adicionar pentes e para permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente.
- Rotular a sonda Sneo (1-2 ug) com CY3 ou FITC a 37 ° C durante 1 hora de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: o S indica a Sneo pliced gene neo micina expressa após um ciclo completo de retrotransposição. A sonda é ~ 1000 bp de tamanho. Sneo pode ser amplificado por PCR a partir de qualquer vector ou de genomADN IC. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre Estreptavidina-CY3 / reagentes de marcação FITC. - Misturar a solução de sonda Sneo marcado com tampão de carregamento de DNA 1x, a carga em cada poço e executar a 75-100 volts para 15-20 min.
- Visualize a banda sonda usando um Ultra Violeta-Iluminador (UV). Note-se que o tamanho da sonda Sneo podem ser ajustados e que o bloqueio de ácido núcleos (LNA) pode também ser ser adicionado (Figura 2).
- Corte sonda marcada Sneo a partir do gel com uma lâmina de limpeza, solubilizar e purifica-se a sonda Sneo a partir do gel utilizando um kit PCR Clean-Up de acordo com o protocolo do fabricante.
CUIDADO: Tampa todas as partes expostas do corpo com escudos de proteção (isto é, casacos de laboratório e UV máscara clara) ao visualizar e cortando o gel. Veja a Tabela de materiais e reagentes para informação gel purificar produtos de PCR. - Re-run 5 mL de Sneo sonda marcada com uma sonda Sneo marcado com un em gel de agarose 0,7% (ver 1.1.1) para conaumento do tamanho firme e perda de intensidade de sinal (Figura 2).
- Quantificar a quantidade de sonda etiquetada Sneo através da medição da absorvância a 260 nm e diluir a sonda Sneo a 10 ng / mL alíquotas em nuclease livre H 2 O. alíquotas armazenar a -20 ° C.
- PCR Labeling (método alternativo para a rotulagem de sonda)
- Combinar iniciadores específicos Sneo (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'e 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') com reagentes de PCR num único tubo: 13,6 ul de nuclease livre H 2 O; 0,1 ul de dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 jil dTTP (10 nM); 0,05 ul de dUTP-biotina / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul Ir Tag 5x tampão; 0,4 ul Ir Tag polimerase; 1 ul Sneo molde (10 ng). Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre reagentes de PCR.
- Ajustar a quantidade de cada reagente, multiplicando pelo número total de amostras.
- Use o seguinte parâmetro de ciclismo PCRs para amplificar e etiqueta Sneo sondas: 95 ° C durante 2 min; 35 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 62 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 60 seg; 72 ° C durante 2 min; Manter a 4 ° C indefinidamente.
NOTA: A temperatura de recozimento pode ser ajustado ou PCR gradiente pode ser concluída para determinar temperaturas de recozimento ideais para outras sondas. - Faça gel 0,7-1%, como no ponto 1.1.1, carga e visualizar a banda sonda como no ponto 1.1.4.
- Corte e purificar a sonda Sneo rotulado como no ponto 1.1.5.
- Re-run 5 mL de Sneo sonda marcada com sonda Sneo marcado com un para confirmar aumento do tamanho e perda de intensidade do sinal (veja a Figura 2).
- Quantificar a quantidade de sonda Sneo marcado por absorvência de medição a 260 nm e diluir sonda Sneo a 10 ng / mL alíquotas em nuclease H 2 O. livre
2. Preparar Spreads cromossômicas
- Gerar clones estáveis expressando estrutura do vector (control) ou L1 retrotransposição competente, utilizando metodologias padrão de selecção. 12,16 Enquanto repórteres não epissómicos foram usadas para correlacionar os achados com estudos de transcrição, também poderiam ser utilizados vectores epissomais. Cultivar células que expressam de forma estável o controle ou vector L1 (1 x 10 6 células por placa de 10 cm, com ajustes no tamanho da placa feitas conforme necessário) em meio de crescimento completo. Para as células HepG2, utilizar meio RPMI-1600, 10% de FBS e 200 ug / ml de higromicina. Crescer as culturas a 70% de confluência a 37 ° C e 5% de CO 2.
NOTA: A escolha do meio de crescimento é dependente do tipo de célula. Dado que os plasmídeos aqui utilizados para transportar cassetes de selecção tanto higromicina e neomicina, a selecção de clones estáveis de também poderia ser feito com neomicina após selecção em higromicina, mas a quantidade de neomicina tem de ser optimizado para estabelecer os níveis de tolerância para cada tipo de célula. - Adicionar colcemida (0,4 ug / ml) ao meio de cultura e incuba-se durante 90 min para reter as células na metaphase. Se usando diferentes tipos de células para determinar a concentração óptima de colcemida e tempo de exposição (60, 90, e 120 min) para prisão da metafase óptima empiricamente.
- Lavar as células 2x com 10 ml de PBS 1x Dulbecco (DPBS), trypsinize por adição de 3-5 ml de solução de tripsina a 0,25% para as células e incuba-se durante 5 minutos para separar as células. Inactivar a tripsina com uma quantidade igual de meio contendo 10% de FBS.
- Centrifugar as células durante 2 min a 1000 xg, a 4 ° C, aspirar o meio a partir da pelete de células e lava-se as células com DPBS. Aspirar todos os DPBS, deixando 200 mL de DPBS para voltar a suspender as células. células assegurem são misturados bem e que todos os aglomerados estão dispersos. Use cintilação ou pipetagem suave para misturar e dispersar aglomerações e evitar vórtex.
- Adicionar 5 ml de solução hipotónica (isto é, KCl a 75 mM) que é pré-aquecido a 37 ° C, gota a gota enquanto se roda o tubo de 15 ml horizontalmente e incubar a 37 ° C durante 20 min. Veja a Tabela de Materiais e Reagents para obter informações sobre como obter e fazer a solução hipotônica.
- células centrifugar a 120 xg durante 5 min a 4 ° C e os passos de repetição 2,4-2,5 3x deixando aproximadamente 200 ul de solução hipotónica para re-suspender as células após cada lavagem. Certifique-se de que no final dos 3 lavagens, o sedimento é visivelmente branco e inchado.
- Re-suspender o sedimento em 200 ul de solução de Carnoy fixador e fazer 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 diluições em solução de Carnoy fixador. Queda de 10 ul de cada diluição numa lâmina limpa seca de aproximadamente 1 cm acima e expor imediatamente a lado sem se espalhar para o vapor quente da água fervente por 30 segundos. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como fazer a solução de Carnoy fixador.
- Secam-se as propagações à temperatura ambiente, mancha com 0,1 ug / ml de Hoechst-33342 por imersão durante 15-20 min em frasco Coplin e lavar 3x com DPBS. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como fazer a solução Hoechst-33342. <li> Ver espalha em microscópio de fluorescência / de contraste de fase de 40x de ampliação. Depois de otimizar a preparação propagação, os spreads não precisam ser marcadas com Hoechst-33342. Ver se espalha em microscópio de contraste de fase em aumento de 10x para determinar a qualidade disseminação e separação, conforme descrito na seção Resultados (ver Figura 3).
- Escolha e circundar boas para barrar com um diamante ponto do marcador no lado oposto da lâmina (isto é, livre espalhar-lado).
- Loja dissemina-se a -20 ° C durante até um mês. Evitar a exposição à umidade.
3. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)
- A estabilização e a desidratação de barrar
NOTA: Equilibrar cromossoma metáfase se espalha até à temperatura ambiente, se for armazenado a -20 ° C. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como obter e fazer reagentes.- Incubar cromossoma metáfase espalha com 200 ul de ARNase A durante1 h a 37 ° C.
- Lavagem das lâminas em tampão SSC 2x-duas vezes durante 5 min cada seguido por lavagem com solução de HCl 10 mM.
- Incubar barrar com 1% de pepsina durante 10 min a 37 ° C, lavar com H 2 O desionizada e lava-se duas vezes com tampão 2 x SSC-durante 5 min cada.
- Incubar barrar com 4% de paraformaldeído durante 10 minutos e lava-se em tampão SSC 2x duas vezes durante 5 min cada.
- Desidratar espalhar por incubação durante 2 min em série de etanol: 70%, 80%, e 95% de etanol.
- lâminas de ar seco.
- Hibridação espalha com sondas retrotransposição marcado com L1 (ou seja, Sneo)
CUIDADO: Para sondas diretas marcado, manter afastado de luz em todos os momentos. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como obter e fazer reagentes.- Adicione 30 ng de Sneo de tampão de hibridação, aquece-se a 72 ° C durante 10 min e arrefecer durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 30 ml de solução de sonda Sneo para each spread, cubra com lamela e selar as bordas com cimento de borracha. Garantir que não haja formação de bolhas.
- Aquecer a lâmina a 72 ° C durante 5 min num bloco de aquecimento, gradualmente, baixar a temperatura para 37 ° C e incubar durante a noite numa câmara humidificada escuro a 37 ° C.
- Lavar e visualizando (ou adição de anticorpo secundário)
CUIDADO: Para sondas diretas marcado, manter afastado de luz em todos os momentos.
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como se preparar. Uso de um volume suficiente para cobrir toda a propagação cromossoma é recomendado. Lembre-se que o excesso de volume será perdido quando lamela é adicionado.- Imergir as lâminas em tampão SSC 2x para remover lamelas.
- Lavagem das lâminas por imersão em tampão SSC 2x-a 45 ° C durante 5 min.
- Lavagem das lâminas por imersão em tampão de lavagem a 45 ° C durante 5 min, 2x.
- Lavagem das lâminas por imersão em tampão SSC 0,1 x a 45 ° C durante 10 min.
- Lavagem das lâminas por imersão em 2X tampão SSC a 45 ° C durante 10 min.
NOTA: Coloque um frasco Coplin contendo tampão recomendado num banho de água, ajustar a temperatura a 45 ° C. - Frescos lâminas à temperatura ambiente e equilibrar as lâminas em tampão de detecção.
- Para sondas marcadas diretos, pule para o passo 3.4.10.
- Para sondas marcadas indirectos, bloco em tampão de bloqueio durante 20-30 min e lava-se 3x em DPBS.
- Incubar com 50 uL de anticorpo secundário (por exemplo, 5 ug / ml de estreptavidina-FITC, ou αCY3 em tampão de bloqueio) durante 1 h.
- Lavar as lâminas em 2x SSC durante 5 minutos duas vezes.
- Contracoloração com Hoechst-33342 solução (0,1 ug / ml) durante 10 min.
NOTA: Esta coloração é feito para manchar cromossomos para co-localização com a sonda. - Lavar em DPBS 3x, adicione uma gota de meio de montagem, coloque uma lamela e selar as bordas com unha polonês.
- Analisar L1 retrotransposição usando microscópio de fluorescência em 40X magnification.
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Representative Results
Um diagrama esquemático do vector de retrotransposição L1 é apresentado na Figura 1. O vector consiste em um gene da neomicina em orientação anti-sentido para L1 ORFs que é interrompida por um intrão de globina em orientação com sentido e colada por DP Sites e SA. Quando integrado de forma estável no cromossoma, L1 ARNm é transcrito a partir do promotor de CMV e combinado L1-5'UTR (Figura 1). Durante o processamento de ARN, o intrão de globina é spliced out do gene da neomicina. O neo-L1 ARN é empacotado, translocado e integrado no genoma de qualquer uma de comprimento completo ou truncada de inserção. Tal como indicado, a retrotransposição de L1 podem ser rastreados por FISH utilizando sondas específicas para a neomicina splicing (Figura 1).
A Figura 2 mostra uma representação esquemática da sonda de neomicina, com o Labeled sondado que é maior em tamanho e fluorescência deficiente devido a diferenças em comprimentos de onda de excitação. Note-se que a CY3 e FITC excitar a comprimentos de onda diferentes do que o ADN coradas com brometo de etídio.
A densidade dos diferenciais de cromossomas em metafase foi determinada por diluição da solução de reserva original em 1: 2, 1: 4, 1: 8 e 1:16 diluições e cada propagação avaliadas quanto à densidade, e a distribuição da distância para barrar a partir do núcleo no aumento de 10x ( Figura 3A). Os resultados mostram uma alta densidade, agrupado e explodiu spreads (Figura 3A-I-II), bem como distribuído uniformemente e se espalha bem espaçadas (Figura 3A-III-IV). De baixa densidade se espalha com uma distribuição uniforme foram escolhidos para análise posterior.
os spreads de cromossomos foram coradas com Hoechst corante e disseminação de qualidade avaliados com base no comprimento dos cromossomas, arredondamento dos spreads e distância inter-cromossomo (Figura 3B). Estes índices foram influenciados pela duração de tempo, as células foram tratadas com colcemida, solução hipotónica, solução de Carnoy fixador e / ou o modo em que as células foram dividido para libertar cromossomas. Se as células foram incubadas durante um curto período numa solução hipotónica, espalha cromossómicas ficou firmemente atado e cromossomas individuais eram difíceis de visualizar (Figura 3B-i). Por outro lado, mais tempo de incubação em solução hipotónica resultou em ruptura dos núcleos, espalhamento de cromossomas, e / ou perda de cromossomas (Figura 3B-II). Incubações mais longas em colcemida aumentou o número de células em metafase, mas conduzir a condensação de cromossomas (Figura 3B-III). Como tal, uma boa qualidade cromossomo propagação requer períodos de incubação ideais, tanto colcemid e solução de KCl hipotônica. Em nossas mãos, a 90 min de incubação em colcemid, 20 em solução hipotônica a 37° C e a utilização de um vapor quente para rebentar as células mostraram-se condições óptimas para a geração de barrar de alta qualidade (Figura 3B-IV).
Os spreads de cromossomos foram coradas para L1 retrotransposição utilizando sondas que têm como alvo Sneo. A sonda foi marcada tanto com FITC e CY3 para mostrar que em ambos os casos L1 retrotransposição é visto apenas em células que expressam tipo selvagem L1 (Figura 4). Nenhuma coloração foi observada em células que expressam a estrutura do vector sozinho (Figura 4; comparar painéis superior e inferior para cada fluoróforo). Em nossas mãos, sinal da sonda foi detectada em 80-90% dos núcleos, com a esmagadora maioria do sinal representando eventos retrotransposição individuais. Nós só marcou retrotransposição em núcleos com mais de uma inserção e qualidade spread foi sempre examinada antes de FISH.
Figura 1. Diagrama esquemático do L1 retrotransposição vetor. Diagrama mostra o processo de transcrição reversa alvo nobre levando a inserções L1 completo ou truncada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Identificada Sneo e sondas neomicina não marcados. A sonda marcada exibe menos fluorescência e é maior em tamanho em comparação com a sonda não marcada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Fase de contraste (Campo brilhante) e Hoechst spreads de mancha de cromossomos. A) Mostra a diluição dos spreads para obter preparações bem espaçados. Barra de escala é de 50 mm. B) Hoechst cromossomo mancha mostrando a influência de colcemid, solução hipotônica, a solução de Carnoy Fixative ea rebentar sobre a qualidade do spread. Barra de escala é de 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A análise FISH de L1 retrotransposição. Coloração de Sneo está ausente em células de controlo, mas presente em células que expressam L1 de tipo selvagem vetor. barra de escala é de 10 mm.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Metodologias como toda a sequenciação do genoma, PCR inversa e transferência de Southern foram utilizados para estudar L1 retrotransposição. Embora estas metodologias são extremamente valiosas na localização onde ocorrem inserções de L1 dentro de genomas, um desafio de confusão para todos eles, é a necessidade de programação in silico para montar sequências. A metodologia aqui descrita FISH foi concebido para complementar estes métodos, especialmente no caso dos estudos que requerem análises de retrotransposição ectópica L1 em células cultivadas. A abordagem pode ser utilizada tanto para avaliação quantitativa e qualitativa de eventos de retrotransposição e aplicado a interfase núcleos. Esta metodologia possui a precisão dos métodos subseqüentes in silico de alinhamento de sequências empregadas para determinar ectópicas locais de inserção L1 16. Alinhamento de sequências repetitivas podem ser ambígua devido à formação de homopolímeros, enquanto sequen repetitivoces podem ser perdidos durante a amplificação do iniciador de molde resultando em sub-representação das sequências repetitivas. Metodologia de peixes podem superar estes problemas porque sondas de peixe pode emparelhar com homopolímeros e não são susceptíveis de ser tendenciosa contra sequências repetidas intactas 16. Além disso, em comparação com ensaios de retrotransposição baseados em cultura de células, os peixes podem determinar taxas de retrotransposição no nível único núcleo. Como tal, esta abordagem evita sob e sobre a estimativa das taxas de retrotransposição como várias inserções podem ocorrer em núcleos individuais 16. Dados recentes obtidos a partir NGS confirmaram que metodologias baseadas cultura de células subestimar frequências retrotransposição 25.
Ainda não está claro onde os jovens L1 preferem inserir e se um mecanismo de direcionamento existe para dirigir essas inserções dentro do genoma. Utilizando a metodologia acima, temos mostrado que L1 insere preferencialmente no gene pobres reregiões do genoma 16. Outros mostraram que a abundância de sequências L1 é aumento em cromossomas com uma densidade menor do gene 17,18. Juntos, estes resultados sugerem um modo regulado de inserção onde ameaças para a célula são minimizados pela inserção de L1 em regiões menores "activos" do genoma. O padrão de movimento elemento transponível em organismos inferiores emprestou apoio a esta interpretação. Por exemplo, um retrotransposão de levedura de fissão, a TF1, integra-se 95% do tempo a montante dos promotores de genes e a maioria destes genes estão envolvidos na regulação da tensão 19,20. Em células de levedura que não têm acesso ao nitrogênio, Ty5 integra no ORF em vez de regiões de heterocromatina 21. Experiências em milho mostraram que a integração de transposões do ADN levar a fenótipos de cores variadas milho e integração de transposões do ADN Hatvine1-RRM para a região do promotor do gene VvTFL1A foi mostrado para influenzaeCE O padrão de ramificação eo tamanho do fruto da videira 22,23.
Os passos críticos para o sucesso da metodologia FISH detalhados aqui são a geração de bons spreads de cromossômicas e rotulagem adequada, purificação e hibridação de sondas. Se as sondas não são limpos adequadamente, o sinal de fundo elevado resultante irá torná-lo difícil de resolver sonda ligação aos cromossomos. De preferência, as sondas devem ser purificado em gel para eliminar a fluorescência residual da dNTPs. Além disso, o período de tempo de que os diferenciais são incubadas em solução de Carnoy fixador é importante preparar boas para barrar de cromossomas. Se muito tempo, a membrana celular pode estourar prematuramente e causar perda de cromossomo. Se demasiado curto, pode ser difícil a obtenção de barrar adequados por causa da ruptura da membrana deficiente. A quantidade / concentração de formamida determina o foco de cromatídeos e, por conseguinte, é importante para optimizar empiricamente para obter os melhores resultados. Todas as lavagens deve ser minuciosa para ensure que todas as sondas não ligadas e anticorpos secundários são lavados.
Em conclusão, a metodologia aqui descrita FISH pode ser utilizada para detectar tanto comprimento completo e eventos de retrotransposição L1 truncadas ectópicos e pode ser aplicado a outros vectores de retrotransposição utilizando a proteína de fluorescência verde (GFP) como uma cassete indicador retrotransposição. Embora as inserções L1 comprimento completo, pode ser determinada utilizando esta metodologia, não vai discernir novas inserções truncadas endógenos, devido ao número de L1 truncada s dentro do genoma. A acessibilidade da sonda também pode ser restringido por formação aumento heterocromatina 16,24. No entanto, a inclusão de LNA dentro sondas FISH pode ser utilizada para melhorar a sonda de hibridação. Detecção de Sneo depende um ciclo completo de retrotransposição e inserções menor do que a sonda / exclusão pode ser desperdiçada.
Para obter descrições detalhadas de experimentos em which, a utilização destes vectores e a expressão de proteínas L1 e retrotransposição são caracterizados, por favor consulte a trabalhos publicados 12,16.
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Disclosures
Os autores declaram não haver potenciais interesses concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
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