Summary
Här använder vi FISH metod för att spåra LINE-1 retrotransposition vid den enda kärnor nivån i kromosomspreadarna HepG2 cellinjer som stabilt uttrycker syntetiska LINE-1.
Introduction
Human Long varvat Nuclear Element-1 (Linje-1 eller L1) är en autonom rörligt element som fortplantar sig i genomet genom en "kopiera och klistra" retrotransposition mekanism. En typisk mänsklig L1 är ~ 6 kb lång och består av en 5'UTR (otranslaterad region) som fungerar som en promotor, två öppna läsramar (ORF): L1 -ORF1 och L1 -ORF2, och en 3'UTR med en polyA . svans L1 -ORF1 protein har tre distinkta domäner: en spole-coil domän, RNA erkännande Motiv och C-terminal domän, medan L1 -ORF2 proteinet har endonukleas, omvänt transkriptas och cysteinrika domänerna 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 uppvisar nukleinsyra eskorte aktiviteter, medan L1 -ORF2 ger enzymatiska aktiviteter, med både proteiner som krävs för retrotransposition 1,2,6.
En cykel av L1 retrotransposition börjar med transkription från 5'UTR L1 L1 -ORF1 utställningar antingen cis -bindande där det paket sin egen RNA eller trans -bindande där det paket andra RNA (dvs sinus / SVAS / pseudo) bildar en ribonukleoprotein partikel (RNP) med L1 -ORF2p 7, 8. RNP translokerar in i kärnan där endonukleasaktiviteten av L1 -ORF2p nicks genomiskt DNA (gDNA) för att exponera en OH - grupp 9, som i sin tur används av omvänt transkriptas för att prima och omvända syntetisera RNA till DNA från 3'-änden. Under omvänd syntes är den andra strängen av DNA nicked 7-20 bp från den ursprungliga nick site för att skapa sicksack anordnade raster som är fyllda för att bilda signaturen L1 införingssekvenser (t.ex. TTTTAA) kallas målställen dupliceringar (TSD) 9,10. Denna process är känd som mål-prime omvänd transkription (TPRT) och leder till insertipå av hela eller trunkerade kopior av L1 / andra DNA med TSD: er vid båda ändarna av den införda sekvensen. har L1 retrotransposition även visats vara förmedlade genom TPRT liknande icke-homolog slut gå med i vissa celltyper 11.
L1 retrotransposition vektor som används i våra studier är icke-episomala och består av taggade L1 -ORF1 & 2p drivs av kombinerade CMV-L1-5'UTR promotorer (Figur 1) 12. Tidigare versioner av denna konstruktion har beskrivits i studier med jäst och humana cellkulturer 13,14,15. Två distinkta CMV-promotorer belägna vid 5'- och 3'-ändarna av vektorn, med 3'-änden placerad i omvänd orientering för att driva uttryck av neomycin efter skarvning och integration. Den retrotransposition indikator kassetten vid 3'-änden består av en neomycin gen insatt antisens till L1 -ORFs och görs inaktivt genom separation i två halvor genom en globi intron med skarvade donator (SD) och skarvade acceptor (SA) platser (Figur 1). Vid integrering i en kromosom, är L1 transkriberas från den gemensamma promotom för att producera en mRNA som består av en bicistronisk mRNA och inaktiv neomycin mRNA. Under RNA-bearbetning, är globin intron skarvas ut ur neomycingenen för att återställa en fullt funktionell neomycin-genen. Hybrid mRNA är förpackad i en RNP i cis och translokeras in i kärnan då den är integrerad i genomet antingen full längd eller stympade insättningar med hjälp av TPRT.
Här beskriver vi en metod som använder fluorescens in situ hybridisering (FISH) med prober specifikt riktade mot skarvade neomycingenen (SNeo) för att spåra L1 -retrotransposiition mönster och inför priser på den inre kärnan nivå. Effektiviteten och specificiteten för upptäckt bekräftades genom att använda retrotransposition kompetent och inkompetenta konstruktioner och prober för att DETect SNeo eller neomycin och globin intron Junction 16. Denna metod utgör en del av bristerna i cellodling baserade retrotranspositionsanalyser, till exempel flera insättningar, koloni motstånd och god klon expansion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTERA: Alla steg bör utföras vid rumstemperatur om inget annat anges. Se Reagens för detaljer om hur man förbereder enskilda reagens.
1. Märkning L1 Probes
OBS: Sönder kan märkas genom kemisk eller PCR märkning.
- kemisk märkning
- Gör 0,7-1% agarosgel i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert, värme i en mikrovågsugn tills smält, låt gelen svalna, och sedan lägga till etidiumbromid (0,5 mikrogram / ml). Häll i gelbricka, lägga till kammar och låta gelén stelna vid rumstemperatur.
- Märka SNeo sonden (1-2 ug) med CY3 eller FITC vid 37 ° C under en timme enligt tillverkarens protokoll.
OBS: SNeo betecknar S pliced Neo mycin genen uttrycks efter en hel cykel av retrotransposition. Sonden är ~ 1000 bp i storlek. SNeo kan PCR-amplifieras från vilken vektor som helst eller från GENOMic-DNA. Se tabell över material och reagenser för information om Streptavidin-CY3 / FITC märkningsreagens. - Blanda märkt SNeo sondlösningen med 1x DNA laddningsbuffert, belastning i varje brunn och köra på 75-100 volt under 15-20 min.
- Visualisera sonden band med hjälp av en Ultra-Violet (UV) Illuminator. Notera att storleken på SNeo proben kan justeras och att Lock kärnor syra (LNA) kan också tillsättas (figur 2).
- Cut märkt SNeo sond från gelén med en ren blad, solubilisera och rena den SNeo sonden från gelén med användning av en PCR Clean-Up kit enligt tillverkarens protokoll.
VARNING: Täck varje exponerad del av kroppen med skyddande sköldar (dvs, laboratorierockar och UV klar ansiktsmask) när du visar och skär gelén. Se tabell av material och reagenser för information till gel rena PCR-produkter. - Repris 5 pl SNeo märkt sond med en omärkt SNeo sond på en 0,7% agarosgel (se 1.1.1) för att lurafast storlek ökar och förlust av signalstyrka (Figur 2).
- Kvantifiera mängden märkt SNeo sonden genom mätning av absorbansen vid 260 nm och späda ut SNeo sond till 10 ng / | il alikvoter i nukleasfritt H 2 O. Förvara alikvoter vid -20 ° C.
- PCR Labeling (Alternativ metod för sondmärkning)
- Kombinera SNeo specifika primrar (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'och 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') med PCR-reagens i ett enda rör: 13,6 pl nukleasfritt H2O; 0,1 pl dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 l dTTP (10 nM); 0,05 l dUTP-biotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 pl Gå Tag 5x buffert; 0,4 pl Gå Tag-polymeras; 1 | il SNeo mall (10 ng). Se tabell över material och reagenser för information om PCR-reagens.
- Justera mängden av varje reagens genom att multiplicera med det totala antalet prov.
- Använd följande PCR-cykling parameters för att förstärka och etikett SNeo sonder: 95 ° C under 2 min; 35 cykler av 95 ° C under 30 sek, 62 ° C under 30 sek, 72 ° C under 60 sek; 72 ° C under 2 min; Håll vid 4 ° C på obestämd tid.
OBS! Glödgningstemperaturen kan justeras eller lutning PCR kan slutföras för att bestämma optimala glödgningstemperaturer för andra sonder. - Gör 0,7-1% gel som i punkt 1.1.1, last och visualisera sondbandet som i avsnitt 1.1.4.
- Klipp och rena den märkta SNeo sonden som i avsnitt 1.1.5.
- Repris 5 pl SNeo märkt sond med omärkt SNeo prob för att bekräfta storleksökning och förlust av signalstyrka (se figur 2).
- Kvantifiera mängden märkt SNeo sond genom att mäta absorbansen vid 260 nm och utspädda SNeo sond till 10 ng / | il alikvoter i nukleasfritt H 2 O.
2. Förbereda Kromosom Spreads
- Generera stabila kloner som uttrycker vektorryggrad (Control) eller retrotransposition behöriga L1 med användning av standardselektionsmetoder. 12,16 Medan icke-episomala reportrar användes för att korrelera resultaten med studier av transkription, kan episomala vektorer också användas. Odla celler som stabilt uttrycker styr- eller L1 vektor (1 x 10 6 celler per 10 cm platta, med justering i plåtstorlek som gjorts efter behov) i komplett tillväxtmedium. För HepG2-celler, använda RPMI-1600, 10% FBS och 200 mikrogram / ml hygromycin. Växa kulturer till 70% sammanflytning vid 37 ° C och 5% CO2.
OBS: Valet av tillväxtmediet är beroende av celltyp. Med tanke på att de plasmider som används här bär urvalskassetter för både hygromycin och neomycin, kan stabil urval av kloner också göras med neomycin efter val på hygromycin, men mängden neomycin måste optimeras för att fastställa toleransnivåer för varje celltyp. - Lägg kolcemid (0,4 | j, g / ml) till odlingsmediet och inkubera under 90 min för att stoppa celler vid metaphase. Vid användning av olika celltyper, bestämma den optimala koncentrationen av kolcemid och tid för exponering (60, 90, och 120 min) för optimal metafas stillestånd empiriskt.
- Tvätta cellerna 2x med 10 ml 1x Dulbeccos PBS (DPBS), trypsinize genom tillsats av 3-5 ml 0,25% trypsinlösning till cellerna och inkubera i 5 min för att lösgöra cellerna. Inaktivera trypsin med en lika stor mängd media som innehåller 10% FBS.
- Centrifugera cellerna för 2 min vid 1000 xg vid 4 ° C, aspirera mediet från cellpelleten och tvätta cellerna med DPBS. Aspirera alla DPBS, lämnar 200 pl DPBS att återsuspendera cellerna. Säkerställa cellerna blandas väl och att alla klumpar är dispergerade. Använd flimmer eller försiktig pipettering att blanda och sprida klumpar och undvika virvelbildning.
- Tillsätt 5 ml hypoton lösning (dvs., 75 mM KCl), som är förvärmda till 37 ° C droppvis under rotation av 15 ml röret horisontellt och inkubera vid 37 ° C under 20 min. Se tabell över material och Reagents för information om hur man får och göra hypoton lösning.
- Centrifugera cellerna vid 120 xg under 5 minuter vid 4 ° C och upprepa steg från 2,4 till 2,5 3x lämnar cirka 200 pl hypoton lösning för att återsuspendera cellerna efter varje tvätt. Så att vid slutet av 3 tvättningar, är synbart vita och svullna pelleten.
- Återsuspendera pelleten i 200 pl Carnoy Fixative lösning och göra 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 utspädningar i Carnoy fixeringslösning. Drop 10 il av varje utspädning på en torr, ren bild från ca 1 cm ovanför och omedelbart avslöja spridningen fria sidan för het ånga från kokande vatten under 30 sekunder. Se tabell över material och reagenser för information om hur man gör Carnoy Fixative lösning.
- Torka spread vid rumstemperatur, fläck med 0,1 mikrogram / ml Hoechst-33342 genom nedsänkning i 15-20 minuter i Coplin burk och tvätta 3x med DPBS. Se tabell över material och reagenser för information om hur man gör Hoechst-33342 lösning. <li> Se sprids på fluorescens / faskontrastmikroskop vid 40X förstoring. Efter att optimera spridningen förberedelse behöver sprider inte färgas med Hoechst-33342. Visa sprids på faskontrastmikroskop vid 10X förstoring för att bestämma spridningen kvalitet och separation som beskrivs i avsnittet resultat (se figur 3).
- Välj och ringa bra uppslag med Diamond Point markör på den motsatta sidan av bilden (dvs sprida fri sida).
- Store sprider vid -20 ° C i upp till en månad. Undvika exponering för fukt.
3. Fluorescens in situ-hybridisering (FISH)
- Stabiliserande och dehydratisering uppslag
OBS: Jämvikta metafas kromosom sprider sig till rumstemperatur om den förvaras vid -20 ° C. Se tabell över material och reagenser för information om hur man får och göra reagens.- Inkubera metafaskromosom sprider med 200 pl RNas A för1 h vid 37 ° C.
- Tvätta objektglasen i 2 x-SSC-buffert två gånger under 5 min vardera följt av sköljning med 10 mM HCl-lösning.
- Inkubera uppslag med en% pepsin under 10 minuter vid 37 ° C, sköljdes med avjoniserat H2O och tvätta två gånger med 2x-SSC-buffert under 5 minuter vardera.
- Inkubera uppslag med 4% paraformaldehyd under 10 minuter och tvätta i 2x SSC-buffert två gånger under 5 min vardera.
- Dehydratisera sprids av inkubation under 2 min i etanol serien: 70%, 80% och 95% etanol.
- Lufttorka objektglasen.
- Hybridisering Sprider med L1 -märkta retrotranspositionssonder (dvs SNeo)
VARNING: För direkt märkta sönder, hålla sig borta från ljus vid alla tidpunkter. Se tabell över material och reagenser för information om hur man får och göra reagens.- Tillsätt 30 ng av SNeo till hybridiseringsbuffert, värm vid 72 ° C under 10 min och svalna i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 30 | il av SNeo sondlösning till eACH spridning, täck med täckglas och försegla kanterna med gummicement. Se till att ingen bubbelbildning.
- Upphetta slid vid 72 ° C under 5 min på ett värmeblock, gradvis sänka temperaturen till 37 ° C, och inkubera över natten i en mörk fuktig kammare vid 37 ° C.
- Tvätt och visa (eller Tillsats av sekundär antikropp)
VARNING: För direkt märkta sönder, hålla sig borta från ljus vid alla tidpunkter.
OBS: Se tabell över material och reagenser för information om hur man förbereder sig. Användning av tillräcklig volym för att täcka hela kromosomspridning rekommenderas. Kom ihåg att överskottsvolym kommer att förloras när täckglas tillsätts.- Doppa objektglasen i 2 x SSC buffert för att avlägsna täck.
- Tvätta objektglasen genom nedsänkning i 2x-SSC-buffert vid 45 ° C under 5 min.
- Tvätta objektglasen genom nedsänkning i tvättbuffert vid 45 ° C under 5 min, 2x.
- Tvätta objektglasen genom nedsänkning i 0,1 x SSC-buffert vid 45 ° C under 10 min.
- Tvätta objektglasen genom nedsänkning i 2 x SSC-buffert vid 45 ° C under 10 min.
OBS: Placera en Coplin burk innehållande rekommenderade buffert i ett vattenbad, justera temperaturen till 45 ° C. - Cool diabilder till rumstemperatur och jämvikt diabilder i buffert upptäckt.
- För direkta märkta sönder, gå till steg 3.4.10.
- För indirekta märkta prober, block i blockerande buffert under 20-30 minuter och tvätta 3x i DPBS.
- Inkubera med 50 | il sekundär antikropp (t.ex., 5 | ig / ml streptavidin-FITC, eller αCY3 i blockeringsbuffert) under 1 timme.
- Tvätta bilderna i 2x SSC under 5 minuter två gånger.
- Motfärga med Hoechst-33342-lösning (0,1 | ig / ml) under 10 min.
OBS: denna färgning görs för att färga kromosomer för samlokalisering med sond. - Tvätta i DPBS 3x, tillsätt en droppe monteringsmedium, placera en täckglas och försegla kanterna med nagellack.
- Analysera L1 retrotransposition med hjälp av fluorescensmikroskop vid 40X magnification.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett schematiskt diagram av L1 retrotransposition vektor presenteras i fig 1. Vektorn består av en neomycin-genen i antisense-orientering till L1 ORF som är avbruten av en globin intron i sensorientering och inklämt av SD och SA webbplatser. När stabilt integrerad i en kromosom, är L1 mRNA som transkriberats från den kombinerade CMV och L1-5'UTR promotorn (Figur 1). Under RNA-bearbetning, är globin intron skarvas ut ur neomycingenen. Den neo- L1 RNA packas, translokeras och integreras in i genomet antingen som en full längd eller stympade införing. Såsom angivits, kan L1 retrotransposition spåras genom FISH användning av prober som är specifika för skarvade neomycin (Figur 1).
Figur 2 visar en schematisk representation av det neomycin sonden, med labeled sonde som är större i storlek och fluorescens deficient grund av skillnader i exciteringsvåglängder. Observera att CY3 och FITC exciterar vid olika våglängder än etidiumbromidfärgade DNA.
Densiteten för metafas kromosomspread bestämdes genom att späda den ursprungliga stamlösningen in i 1: 2, 1: 4, 1: 8 och 1:16 spädningar och varje uppslag utvärderades med avseende på densitet, distribution och avstånd av uppslag från kärnan vid 10X förstoring ( Figur 3A). Resultaten visar hög densitet, klumpiga och brast ut uppslag (Figur 3A-I-II), liksom jämnt fördelad och väl fördelade uppslag (Figur 3A-III-IV). Låg densitet sprids med jämn fördelning valdes för efterföljande analys.
Kromosom uppslag färgades med Hoechst färgämne och sprida kvalitet utvärderas baserat på längden av kromosomer, rundhet av spreads och inter-kromosom avstånd (figur 3B). Dessa index påverkades av den tid cellerna behandlades med kolcemid, hypoton lösning, Carnoy Fixative lösning och / eller det sätt på vilket cellerna busted att frigöra kromosomer. Om cellerna inkuberades under en kort period i hypoton lösning, blev kromosomspread tätt knutna och individuella kromosomer var svåra att visualisera (Figur 3B-i). Å andra sidan, längre inkubation i hypoton lösning resulterade i brott på kärnorna, spridning av kromosomer, och / eller förlust av kromosomer (Figur 3B-ii). Längre inkubationer i kolcemid ökade antalet celler i metafasen, men leder till kondensering av kromosomer (Figur 3B-iii). Som sådan kräver en god kvalitet kromosomspridning optimala inkubationsperioder i både kolcemid och hypoton KCl-lösning. I våra händer, en 90 minuters inkubation i kolcemid, 20 i hypoton lösning vid 37° C och användning av en varm ånga för att spränga cellerna befanns vara optimala betingelser för generering av högkvalitativa sprider (Figur 3B-IV).
Kromosom uppslag färgades för L1 retrotransposition med hjälp av prober som riktar SNeo. Sonden märktes med både FITC och CY3 för att visa att L1 retrotransposition i båda fallen ses endast i celler som uttrycker vildtyp L1 (Figur 4). Ingen färgning sågs i celler som uttrycker vektorryggraden enbart (Figur 4; jämför övre och undre paneler för varje fluorofor). I våra händer, var sondsignal detekteras i 80-90% av kärnor, med överväldigande majoritet av den signal som representerar enstaka retrotranspositionshändelser. Vi gjorde bara retrotransposition i kärnor med mer än en insättning och sprida kvalitet alltid undersökas innan FISH.
Figur 1. Skiss av L1 retrotransposition vektor. Diagram visar processen av mål prime omvänd transkription leder till full eller stympade L1 insättningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Märkta SNeo och omärkta neomycin sonder. Den märkta proben uppvisar mindre fluorescens och är större i storlek jämfört med den omärkta sonden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Fas-kontrast (Bright Field) och Hoechst fläcken kromosom uppslag. A) visar utspädning av uppslag för att få väl fördelade preparat. Skala bar är 50 pm. B) Hoechst fläcken kromosom visar påverkan av kolcemid, hypoton lösning, Carnoy Fixative lösning och spricker på spridnings kvalitet. Skala bar är 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. FISH analys av L1 retrotransposition. Färgning av SNeo är frånvarande i kontrollceller, men förekommer i celler som uttrycker L1 vildtyp vektor. Skala bar är 10 mikrometer.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder som hela genom sekvensering, omvänd PCR och Southern blotting har använts för att studera L1 retrotransposition. Även om dessa metoder är mycket värdefulla i att lokalisera där L1 insättningar sker inom genomet, är en förbryllande utmaning för dem alla behovet av in silico programmering att sätta ihop sekvenser. FISH metoder som beskrivs här är avsett att komplettera dessa metoder, särskilt när det gäller studier som kräver analyser av ektopisk L1 retrotransposition i odlade celler. Tillvägagångssättet kan användas för både kvantitativ och kvalitativ utvärdering av retrotranspositionshändelser och tillämpas på interfaskärnornas. Denna metod har riktigheten i efterföljande in silico sekvensinriktnings metoder som används för att bestämma ektopiska L1 insättningsställen 16. Inriktning av repetitiva sekvenser kan vara tvetydig på grund av bildningen av homopolymerer, medan repetitiva sequences kan förloras under primer förstärkning av mall som resulterar i underrepresentation av repetitiva sekvenser. FISH metoden kan lösa dessa problem eftersom FISH prober kan hybridisera till homopolymerer och kommer sannolikt inte att vara partisk mot intakta upprepade sekvenser 16. Dessutom, jämfört med cellodling baserade retrotranspositionsanalyser kan FISH bestämma retrotranspositionshastigheter vid den enda kärnan nivå. Som sådan, förhindrar detta tillvägagångssätt både under- och överskattningen av retrotranspositionshastigheter som flera insättningar kan inträffa i enstaka kärnor 16. Nya data som erhållits från NGS har bekräftat att cellodlingsbaserade metoder underskattar retrotranspositionsfrekvenser 25.
Det är fortfarande oklart var unga L1s föredrar att sätta in och huruvida en målsökande mekanism finns för att styra dessa tillägg inom genomet. Användning av ovanstående metod har vi visat att L1 infogar företrädesvis i gen dålig reregioner av genomet 16. Andra har visat att överflödet av L1-sekvenser är ökning av kromosomer med en mindre gen densitet 17,18. Tillsammans utgör dessa fynd tyder på en reglerad läge för insättning där hot mot cellen minimeras genom insättning av L1 i "mindre aktiva" regioner av genomet. Mönstret av transponerbara ämnet rörelse i lägre organismer har lånat stöd till denna tolkning. Exempelvis fissionsjäst retrotransposon, TF1, integrerar 95% av tiden uppströms genpromotorer och majoriteten av dessa gener är inblandade i spänningsreglering 19,20. I jästceller som saknar tillgång till kväve, integrerar Ty5 i ORF i stället för heterokromatin regioner 21. Experiment i majs har visat att integrationen av DNA-transposoner leda till brokiga majs färg fenotyper och integrering av Hatvine1-RRM DNA transposon in promotorregionen för VvTFL1A genen har visats influenEC förgrening mönster och frukten storleken på vinrankor 22,23.
Stegen kritiska till framgång för FISH metoden beskrivs här är den generation av god kromosom uppslag och korrekt märkning, rening och hybridisering av sonder. Om prober inte rengörs ordentligt, kommer den resulterande höga bakgrundssignalen gör det svårt att lösa prob binder till kromosomer. Företrädesvis bör prober vara gel-renas för att avlägsna kvarvarande fluorescens från dNTP. Dessutom är den tidslängd som sprider inkuberas i Carnoy Fixative lösning viktigt att förbereda goda kromosomspridningar. Om alltför lång, kan cellmembranet brista i förtid och orsaka kromosomskador. Om alltför kort, kan det vara svårt att erhålla lämpliga bredbara på grund av bristande membran bristning. Mängden / koncentrationen av formamid bestämmer inriktningen av kromatider och därför är det viktigt att optimera empiriskt för bästa resultat. Alla tvättar bör vara noggrann med ENSure att alla obundna prober och sekundära antikroppar tvättas bort.
Sammanfattningsvis kan FISH metod som beskrivs här kan användas för att detektera både full längd och stympade ektopisk L1 retrotranspositionshändelser och kan tillämpas på andra retrotranspositionsvektorerna med hjälp av grönt fluorescerande protein (GFP) som en retrotransposition indikator kassett. Även full längd L1 insättningar kan bestämmas med hjälp av denna metod, kommer det inte att urskilja nya endogena stympade insättningar på grund av antalet av stympade L1 är inom genomet. Tillgängligheten av sonden kan också begränsas av ökning heterokromatin bildning 16,24. Emellertid kan inbegripandet av LNA inom FISH-prober användas för att förbättra prob glödgning. Detektion av SNeo är knuten till en hel cykel av retrotransposition och insättningar mindre än sondens / radering kan missas.
För detaljerade beskrivningar av experiment i which användningen av dessa vektorer och uttryck av L1-proteiner och retrotransposition kännetecknas hänvisas till publicerade verk 12,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga potentiella konkurrerande intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
