This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
유전 적, 생화학 적 접근 방식을 결합하는 능력은 초파리에게 생화학 및 분자 생물학 연구 1-3에 특히 적합한 유기체했다. 이러한 연구들은 성인 초파리에서, 또한 유생 4, 5 및 번데기 배아 6-8에서뿐만 아니라 생체 재료의 많은 양을 필요로한다. 제품을 다량을 얻기 위해, 연구진은 "인구 케이지를"비행로 알려진 대형 컨테이너를 사용하여 배양 파리 있습니다. 이 케이지 탈출 파리없이 케이지 내의 음식의 도입을 허용하기 위해 양쪽에 순으로 덮여 플라스틱 실린더로 구성된다. 이 케이지는 9-11 제이나 (특정 재료 / 장비의 표 참조) 회사에서 구입 할 수있다.
파리 많은 성장이 시스템을 사용하는 주요 장점은 과일의주기 (12)는 모든 파리 재 발전하는 방식으로 제어 될 수 있다는 비행latively 방식으로 동기화. 이 동기는, 새로운 배아 시드 유충 / 파리를 공급하고 정확한 시간에 성인 파리를 희생함으로써 달성된다. 동기화 된 플라이 인구를 사용하여 개발 연구 (13)에 특히 유용합니다.
몇 파리에서 새로운 인구 케이지의 시작 증폭 9-11의 많은 사이클을 요구하는 시간 소모적 인 과정이다. 심지어 플라이 문화 병 또는 minicages 같은 큰 용기를 사용하여, 전체 프로세스는 몇 달 동안 지속될 수 있습니다. 단계를 소비하는이 시간을 피하기 위해, 많은 초파리 실험실은 정기적으로 같은 새장을 유지한다. 이미 설립 인구 케이지에서 배아 컬렉션에서 시작하는 새 케이지를 시작하는 것이 가장 편리합니다. 일반적으로 대부분의 실험실이 원고 플라이 인구 새장을 유지하기 위해 상세한 프로토콜을 제공합니다 같은 오레곤 R 또는 광저우 S. 등의 야생형 인구 케이지를 유지한다.
재료 하나의 1.5 g로 시작하는 사이클 당 7, 13 g 사이에 수집 된 배아의 수율을 얻을 수 있습니다. 이러한 물질의 양을 얻기 위하여는 플라이주기의 모든 단계에 적합한 배양 조건을 유지하는 것이 중요하다.
가장 중요한 파라미터는 각각 24 ºC 35 %이어야한다 온습도이다. 이러한 두 파라미터는 랩의 정상적인 환경에서 일정하게 유지 될 수 없다면, 하나의 가능성은 인큐베이터 또는 환경 챔버로 즉시 케이지를 배치하는 것이다. 다른 프로토콜은 생산 계란 9, 10의 수율을 높이기 위해 70 %의 습도도 일정하게 24 시간 명암주기를 권장합니다. 그러나 약 35 %의 습도를 유지하는 세균 오염을 방지하고,이 프로토콜의 목적은 인구 케이지의 유지가되기 때문에, 파리는 실험실의 정상적인 광 환경에서 유지된다.
또 다른 중요한 점은 디를 유지하는 것입니다성인에 sturbances는 가능한 한 낮게 날아갑니다. 다른 플라이에서 교차 오염을 방지하기 위해 비행 공간에서 별도의 위치에 케이스를 유지하는 것이 바람직 할 수있다.
그들의 순수성을 유지하기 위해 그들은 많은 인구 케이지 (14)에 뚜렷한 이상 짝짓기 행동을 나타낼 수있다 매우 어렵 기 때문에 형질 전환 및 돌연변이 초파리의 큰 인구의 배양은하지 않는 것이 좋습니다.
한 가지 문제점은 대량 초파리 배양하면서 음식에 대해 경쟁하기 때문에 제조 계란의 수율을 감소 진드기 및 / 또는 몰드와 같은 다른 생물체의 존재이다. 이를 방지하기 위해서는 깨끗하고 모든 장비를 유지 케이지, 그물을 씻는 물과 비누, 모든 사이클 후 일회용 재료 (발포 플러그) 폐기와 함께 상자를 비행하는 것이 매우 중요합니다. 스텝 플라이 음식을 준비 할 때 증가하는 금형을 줄이기 위해, 프로피온산 인산 습식 효모에 첨가당밀을 준비 1.2 Tegosept 단계 3.1 트레이. 시간이 짧고 재료는 즉시 세척 할 수없는 경우 그러한 -20 ˚C에서 플라스틱 상자 또는 자체로 장소 물질에 때때로 도움이됩니다.
배아는 즉시 상자에 파종 마지막 수거 일 끝나는 때부터 15 일 – 전체 콜렉션주기 (14)에서 발생합니다. 이 기간 동안,이 프로토콜 섹션에서 자세한 인구 플라이 케이지의 유지 보수 (그림. 2)에 필요한 모든 단계를 기억하기 위해 일정을 구성하는 것이 좋습니다. 성인 초파리 등장까지 계란, 시딩있는 일로부터, 단지 플라스틱 상자를 검사 할 필요가 있고, 번데기가 발생하면 케이지 내부에 이들을 배치. 배아는 새로운 사이클 시딩까지 3 일 – 그 후, 파리 매 2를 공급해야한다. 전체 프로토콜에서 가장 긴 날은 새로운주기를 시작하는 배아의 수집 및 시드 중입니다. 에이오일 성인 우화 후, 마지막으로 이일 이후 감소 – 프로토콜에 댓글 S, 최고의 계란 생산량은 3입니다. 이것은 계란의 수확이 수행 될하는 일을 선택하기 위해 우리에게 약간의 유연성을 제공합니다.
어떤 이유로 수집 배아 수율 원하는 개시 량 (1.5 g)보다 작은 경우, 하나는 항상 새로운 당밀 트레이를 추가하고 더 알 다음날 수집 할 수있다. 일정한 컬렉션 들어, 평행이 케이지를 유지하도록 권장되고, 배아의 높은 양이 요구되는 경우에, 또한 큰 케이지를 사용하는 것이 가능하다. 단시간 컬렉션을 수행하는 경우, 수율을 증가시키는 하나의 방법은 아침에 알을 낳는 버스트를 활용하는 것이다.
다양한 발달 단계의 대량 수집 많은 장점이있다. 예를 들어, 인구 케이지에서 수집 된 배아는 면역 분석 6-8, 대량 collectio 매우 성공적으로 사용되어왔다해리 유충에서 애벌레 조직, n은 3C 실험 4 및 RNA 준비 (15)에 대해 아주 좋은 소스로 보여 주었다, 성인 파리에서 헤드는 칩 실험 (16)을 위해 이용되고있다. 또한, 성인은 종종 조직 배양 플라이 (17)를 추출 할 필요가있다.
케이지의 가장 유망한 애플리케이션 중 하나는 병원체, 생물학적 분자, 화학 물질 및 전리 방사선의 노출에 반응하여 유전자 전 사체, 단백질 대사 산물의 분석 및 선별을 허용 높은 처리량 검정법을위한 재료를 제공하는 것이다. 이러한 대규모 분석에서 많은 개인이 필요하고, 여기에 설명 된 플라이 인구 케이지는 분석 및 18 스크리닝 초파리 생활주기의 다른 단계 동안 물질의 다량을 얻기 위해 매우 도움이 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |