Introduction
Genetik ve biyokimyasal yaklaşımlar birleştirme yeteneği Drosophila biyokimya ve moleküler biyoloji çalışmaları 1-3 için özellikle uygun bir organizma yapmıştır. Bu çalışmalar genellikle erişkin sinek, aynı zamanda larva 4, pupa 5 ve embriyolar 6-8 değil sadece biyolojik materyalin büyük miktarlarda gerektirir. büyük miktarlarda ham materyal elde etmek için, araştırmacılar "nüfus kafesleri" sinek olarak bilinen büyük kaplar kullanılarak kültürlü sinekler var. Bu kafesler kaçan sinekler olmayan kafes içinde gıda maddenin arzı için her iki tarafta bir ağ kapsamındaki plastik bir silindirden oluşmaktadır. Bu kafesler 9-11 ev yapımı ya da (özel malzemeler / ekipman tabloya bakınız) bir şirketten satın olabilir.
Sinekler sayıda büyümesi için bu sistemi kullanan bir büyük avantajı, meyve döngüsü 12, tüm sineklerin yeniden geliştirmek şekilde kontrol edilebilir hedefi olduğunulatively şekilde senkronize. Bu senkronizasyon, yeni embriyolar ekim larva / sinekler beslenme ve hassas zamanlarda yetişkin sinekler feda ederek elde edilir. Senkronize bir uçucu popülasyonu kullanılarak gelişim çalışmalarında 13 için özellikle yararlıdır.
Birkaç sinekler yeni bir nüfus kafesinin başlangıç amplifikasyonu 9-11 birçok döngülerini gerektiren zaman alıcı bir süreçtir. Hatta sinek kültür şişeleri veya minicages gibi büyük kaplar kullanılarak, tüm süreç aylarca sürebilir. Adım tüketen bu kez önlemek için, birçok Drosophila laboratuarlar düzenli tür kafesleri korumak. Zaten kurulmuş nüfus kafesinden bir embriyo toplama başlayan yeni kafes başlamak için en uygun olduğunu. Genel olarak, çoğu laboratuarları Bu makale sinek nüfus kafesleri korumak için ayrıntılı bir protokol sunar gibi Oregon R veya Canton S. olarak wild tip nüfus kafesleri, korumak.
Protocol
1. Döngüsü Başlangıç: Seeding Embriyolar
Not: döngüsü, önceki periyottan gelen toplanan malzemenin 1,5 g (embriyo ve / veya bazı birinci değişim safhasındaki larva oluşan bir karışımı) ile başlar. Bu materyal, pupa aşamasına kadar aktif maya karışımı ile plastik bir kap (spesifik malzemeleri / ekipman tabloya bakınız) yerleştirilir. konteyner larvaları kaçmak için izin önlemek için kapaklı biyolojik embriyoların karışımı ve larva girmesinden sonra kapalı olacak. Hava dolaşımı sağlamak için kapağın içine delik yapmak için gereklidir. deliklerden larva kaçış zorunda kalmamak için, köpük fişler kullanılır. Son olarak, çamaşır suyu ile kirli ya da boyama giysiler almamak için, bu bölümde değil, aynı zamanda tüm protokol sadece eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek için tavsiye edilir.
- plastik kap ayarlayın.
- Bir plastik kap kapağında bir jilet ile üç köşeli delik açın2,2 cm pproximately. Köpük fişler (50 x 55 mm, dxl) için sıkı bir uyum sağlamak ve daha sonra her deliğe bir köpük fiş yerleştirmek için her deliğin dört bir yanına bant (3/4 inç etiketleme bant) ekleyin.
- plastik film ile plastik kabın içini kaplayın. Bu filmin üzerinde, plastik kabın dibine karşılamak için pamuk katman ekleyin. parmaklarınızla pamuk gözyaşı.
- sinek yemek hazırlamak.
- 500 ml'lik bir beher içinde, deiyonize su 333 ml ilave edilir. manyetik bir çubuk ile kabı karıştırılırken, stok çözeltileri (sırasıyla 99.96 ve% 85,%) ilgili propiyonik asit 167 ul ve fosforik asit 1.08 ml ekleyin.
- Yavaş yavaş büyük topaklar kaçınarak, aktif kuru maya 77.5 g ekleyin. kuru maya çözündürülmesinden sonra, sükroz 38.8 g ekleyin.
NOT: hemen bu bileşeni ekledikten sonra, fermantasyon başlayacak çünkü Sakaroz son madde eklenecek olmalıdır.
- Hemen sükroz çözüldükten sonra, dökmepamuk üzerinde gıda ve eşit pamuk kapsayacak şekilde emin olun. gıda kirlenmesine laboratuvar içinde kaçan sinekler önlemek için kapaklı plastik kap kapatın.
- % 70 5 ml etanol ile bir önceki döngüden hasat embriyolar (değil dechorionated), 1.5 g yeniden süspanse edin. Yarım iki filtre kağıtları kesme ve spatula veya geniş uçlu bir transfer pipeti kullanılarak 4 adet üzerinde eşit biyolojik karışımı dağıtmak (gerekirse kesilmiş). batırılmış pamuk üstüne filtre kağıtları Lay ve kapağını kapatın. Son olarak, pupa aşamasına kadar plastik RT (24 º C) de konteyner ve nem (% 35) kuluçkaya yatmaktadır.
NOT: Plastik kap nemli bir odasında konulmamalıdır, aksi takdirde bu bakterilerin büyümesini teşvik edecektir.
Embriyolar itibaren Sinekler için: Cycle 2. devamı.
NOT: döngüsünün bu bölümü 9 gün sonra yetişkin sinekler ortaya çıkacak zaman kadar günde 1 plastik kap içine yerleştirilir embriyolardan giderpupa dan. Bu 8 gün boyunca hiçbir şey bitmiş ama embriyolar eclosion kadar Drosophila yaşam döngüsünün sonraki aşamalarında doğru ilerleme olduğunu izleme için vardır. Larvalar ölüyor ve bu süre içinde siyah dönüm başlarsanız, köpük fişler çok sıkı olmayan ve yeterli havalandırma sağlanmadığı kontrol edin. Bu dönem bir önceki döngüsü sinek nüfus kafesini temizlemek için iyi bir zamandır.
- Yetişkin dişi sinek gıda (adım 3) içine yatırılır sonra gözlemlemek embriyolar 1. larvası 24 civarında saat olur. Ortaya çıkan larvalar büyüyen ve 2. ve 3. instar larvaları içine iki kez tüy dökme, 4 gün boyunca 1. adımda hazırlanan sinek gıdalardan besleyecek.
- sinek nüfus kafesini temizleyin.
- sinekler aktivitesi yavaşlatmak için en az 30 dakika boyunca 4 ° C'de kafes yerleştirin. Kafesin bir tarafını kapsayan net çıkarın ve hızlı bir hareket ile, büyük bir biyolojik tehlike plastik açık tarafı kapçanta. torbaya kafes içeriğini dökün.
- biohazard çanta hala kafesin bir tarafını kapsayan, dikey olarak aşağı biohazard çanta tarafı lavabonun üzerinde kafes yerleştirin. Dikkatle kaçan sinek önlemek ve biyolojik tehlikeli atık kabı içine atmak için plastik torba çıkarın.
- Dikkatle, küçük bir delik oluşturmak lavabonun içine sinekler yıkayacak su ile kafes, içini yıkamak için yeterince üst net açın. Yavaş yavaş deliğin boyutunu artırmak ve kafes içindeki tüm sinekler ortadan kaldırır.
- kafes ve su ve sabun ile hem ağları temizleyin. ağları hala ıslak iken kuru temizleme kafesin her iki tarafında emniyete ve son kafeste yapışmasını aşama 1.1.2 hazırlanan plastik filmi önleyecek bir laboratuar sağanak kağıt içine konur. Şimdi kafes sonraki döngü için hazırdır.
- Dört gün ilk kurulumdan sonra, larva pupa gözlemlemek. Larvalar 4 gün daha, bu aşamada kalacaktır.
NOT: During bu aşama pupa plastik kap içinde tüm pamuk yüzeyini kapsayacak. - İlk sinekler ortaya pupa evresinde ve önce plastik kap açın ve temiz nüfus kafes içinde laboratuvar Sağanak kağıt üzerinde tüm pupa ile pamuk içeren plastik film yerleştirin. bir çift düğüm ile net kapatın ve plastik kap ve bir sonraki döngü için kapağı temizleyin.
NOT: Kapağın yapıştırılmış Pupa atılır ve otoklav veya eclosion önce dondurularak imha edilmelidir.
3. Yetişkin Sinekler.
NOT: pupa 4 gün pupa çıkacağı ilk sinekler sahne sonra. 24 içinde - 48 saat tüm sinekler eclosed gerekirdi. döngüsünün bu bölümünde, üreme için doğru ortamı yaratmak amacıyla onlara yiyecek temin etmek önemlidir.
- pekmez Tepsileri hazırlayın.
- 1 L'lik bir şişeye deiyonize H2O 556,25 mi, melas 90 ml ve agar 22 g Kombine. Serin 30 dakika boyunca bir karıştırma çubuğuna sahip olan otoklav ve% 95 EtOH içinde% 10 Tegosept 9.25 ilave edin.
- 21 x 14,5 cm et tepsisine karışımı dökün. 17 tepsileri - hacim 15 karşılamak için yeterli olduğundan emin olun. kuvvetlendirmek ve kurumasını önlemek için plastik bir film ile her bir tepsiyi kapsamaktadır için 20 dakika - 10 bekleyin. 1 L çeşitli şişeler, aynı zamanda hazırlanabilir. Gerekli kadar plastik sarılı 4 ° C'de pekmez tepsileri saklayın.
- yetişkin sinekler kafesin içinde ıslak maya ile kaplı bir pekmez tepsi ekleyin.
- plaka eklemeden önce, 30 dakika boyunca soğuk bir odada 4 ° C'de kafes yerleştirin.
- Bir beher içine deiyonize H2O 200 ml ilave edilir ve bir kaşık ile karıştırılırken yavaşça kuru maya dökün. Karışım, yaklaşık sinekler gıda içine saplanıyor önlemek için fıstık ezmesi kıvamına olduğunda kuru maya ekleyerek durdurun.
NOT: gıda çözüm kapsayacak şekilde çok zor olacak, aksi takdirde katılaşmaya izin vermemek önemlidirmelas tepsi ve hasat işleminin (bölüm 4.3'e bakınız) sırasında yumurta ayıklayın. - bir pekmez tepsiden plastik filmi çıkarın ve bir kaşık ya da spatula kullanılarak taze hazırlanmış ıslak maya tabakası ile örtün. tüm yüzey kaplı olduğundan emin olun.
- kafes soğuk oda hala iken, net açın ve dikkatlice kafese ıslak maya ile pekmez tepsi ekleyin. net kapatın ve oda sıcaklığında kafes yerleştirin.
NOT: yerleştirme sırasında boş bir et tepsisi ile plaka kapsayacak şekilde yararlı olabilir, ancak pekmez tepsiye sinek erişimi engellemek için değil emin olabilir.
- çok kuru almak için maya önlemek için 48 saat - Gıda plakası her 24 değiştirin. Yetişkin sinekler kurumaya karşı çok duyarlıdır.
Cycle 4. sonu: Embriyolar Hasat
NOT: En iyi sinek doğurganlık 3'tür - eclosion 5 gün sonra. Bu nedenle, bu süre içinde hasat iyi embriyo verimi alırsınız. Sonra istenilen koleksiyonları komple vardırted, devir bitti. sinekler kurban ve temizlenmiş kafes adım 2.2 belirtilmelidir.
- Tipik olarak, 2 gün sinek eclosion sonra, bölüm 3.2.5 açıklandığı gibi yeni bir pekmez, kafesin içine taze ıslak gıda tepsisi tanıtmak. parmak yardımıyla, yumurta birikimi veriminin arttırılması için, mümkün olduğu kadar yaş maya yüzeyi düzensiz hale. Eski bir gıda tepsi kafeste varsa, yeni plaka eklemeden önce, dikkatlice çıkarın ve bir biyolojik tehlikeli torbaya atın. veriminin arttırılması için bir başka ipucu, tüm yumurtaları gıda atılacak, böylece pamuk katmanı kaldırmaktır. Oda sıcaklığında kafesi koruyun.
- küçük beyaz noktalar olarak embriyolar gözlemleyin.
NOT: yumurta tahsil edilecek hazırız. sinek kafesinin rutin bakım için, 2 gün koleksiyonu önerilen zamandır. Bu koleksiyon, çoğunlukla embriyolar ve birkaç 1 instar larvaları içerecektir. Çeşitli colle için hasat embriyo tipik verim temsilcisi sonuçları görünction zaman noktalarında. - embriyoların hasat
- yaklaşık 30 dakika boyunca soğuk odada kafes yerleştirin. 1. bölümde açıklandığı gibi bu süre içinde sonraki döngü için plastik kap ve sinek yemek hazırlamak.
- 8-otoklav tepsisinde toplam kapasitenin ¼ ve daha sonra% 10 Triton X-100, 1 ml eklemek için su ilave edilir. kafes soğuk oda olmasına rağmen dikkatle pekmez plaka kaldırmak ve bir biyolojik tehlikeli torba içine yerleştirin.
- torbadan tepsisini çıkartın ve otoklav tepsisine deterjan çözeltisi içinde (kaçmasını sinekler önlemek için) hızlı bir şekilde daldırın. biohazard çanta kapatın ve biyolojik tehlike kabı koyun. Sinekler deterjan içermeyen su içinde boğmak olmaz.
- pekmez kapalı embriyo ve mayayı yıkamak için büyük bir fırça ve distile su tabancası kullanın. biohazard kutunun içine plakaları ve pekmez atın.
- Üç elek seti (altta kaba elek üstünde 30, 40 orta ve 100) dikkatle çözüm dökün. Yıkama kümeleri on distile su tabancası ile üst düzey hiçbir kümeleri kalmayıncaya kadar.
NOT: yetişkin sinekler ve 3. instar larvaları elek 30 tutulacaktır.- distile su ile otoklav tepsisini durulayın ve eleklerden durulama suyunu dökün. maya kümeleri kalırsa üst elek ve tekrar sürecini çıkarın. 1. ve 2. evre larvalarının En önemlisi elek 40 kalacaktır.
- İkinci elek çıkarın. Üçüncü (alt) elek sarımsı embriyolar ve küçük 1 instar larvalarının karışımıdır. eleğin bir yanına tüm yumurta taşımak için damıtılmış su tabancası kullanarak. Bir spatula ile toplayın ve bunları tartın.
- Bu döngü sırasında embriyoların toplama verimi / larva 7 ila 13 gr arasında değişmektedir. yeni bir döngü (bölüm 1) başlatmak için bu malzemenin sadece 1,5 gr kullanın. daha ileri işlemler için embriyoların kalanını kullanın veya iptal edilebilir.
5. Ekİşleme
NOT: Nüfusun devamı için kullanılmayan embriyolar alternatif deneyler için hemen kullanılabilir veya -80 ° C'de dondurulabilir. Her iki seçenekte de, embriyolar öncelikle dechorionated gerekebilir.
- dechorionation için,% 50 çamaşır suyu çözeltisi içinde 2 dakika için embriyolar yıkama ve damıtılmış su ile iyice yıkayın.
- Bir kağıt havlu ile iyice bastırarak embriyolar, ilk kuru donma ve ardından 15 ya da 50 ml konik tüp içine, bir spatula yardımıyla, onları tartmak ve yerleştirmek için. Son olarak, bir kaç saniye için sıvı N2 konik bir tüp içinde daldırın.
Representative Results
Bir sinek kafes nüfusun bakım sinek yaşam döngüsü dayanmaktadır. Bu nedenle, plastik kap içinde (Şekil 1A) embriyoları ve larvaları ilk biyolojik karışımını yerleştirdikten sonra döllenmiş yumurtalar en fazla 2 gün içinde larvaları olacak ve larva 4 gün büyüyecek, nispeten (farklı dönem larva aşamalardan senkronize ) Şekil 1B bkz.
Larvalar 3. instar larva sahne tamamladıktan sonra onlar pupa ve kapağın (Şekil 1C) iç yüzeyinde bazı plastik kap içinde pamuk yüzeyini kapsayacak. sinekler metamorfoz süreci bitene kadar bu pupa devresi süresi önümüzdeki 4 gün boyunca devam edecek. Bu dönemde kuvvetle kafese sinekler aktarmak için tavsiye edilir. sonra 10 - ilk yetişkin sinekler 9. günde Eclose başlayacakdöngüsü (Şekil 1D) ve 11. günde hepsi tarafından başlatılması pupa ortaya çıkmıştır olacaktır.
5 gün eclosion (15 gün 13) sonra ve nihayet (7 gün eclosion sonra) günde 17 düşüşler - embriyoların toplama en iyi verimi 3 elde edilir. Nedenle, günde 13 taze gıda son tepsi ekleme ve 15. gün yumurta (Şekil 1E ve F) toplamak için tavsiye edilir. Bu embriyoların maksimum sayıda toplanmasını sağlayacaktır. 6 ardışık döngü koleksiyonları verimi, her döngüde 1.5 g bir başlangıç malzemesi ile toplandı, embriyoların verim azalır bunlara bağlı olarak çok kuru olduğu neden olabilir toplanması ve daha önce üçüncü bir ekstra gün. Tablo 1, ekleme, ve Şekil 2, bütün döngü koleksiyonu için önerilen zamanlama olduğunu.
malzeme 2 gün hasat60; süreleri çok embriyo oluşmaktadır. Ancak larva az sayıda da vardır. asynchronicity bir dereceye beklenen beri kafes bakım amacıyla bu larvalar, bir sorun değildir. Bununla birlikte bazı biyokimyasal deneyler için bu embriyolar, saflığı çok önemlidir, ancak, aynı zamanda, bu deneyler için yumurtaların büyük miktarda toplamak için de gereklidir. Bu nedenle, çok sayıda kısa ardışık koleksiyonları hızlı oda sıcaklığında gıda ile yeni bir levha eklendikten sonra, bu yöntem ile elde edilebilir verim ve saflıkta bir tahmin sağlamak üzere, 1 saat, 3 saat sonra yapıldı (Tablo 2 ve Şekil 3) . 1 saat arka arkaya koleksiyonları çok düşük bir verimle (14.5 mg), fakat daha sonra toplanır, her zaman için yüksek embriyo miktarlarda, ancak son başladı. sinekler yiyecek değişiyor ama daha sonra alıştırma sürecinde vurguladı ilk düşük verim nedeniyle olabilir. Diğer yandan, herhangi bir larVAE kısa koleksiyonları daha yüksek saflıkta elde gösteren beş sıralı koleksiyonları (Şekil 3A) görülmüştür. Pamuk kafes kaldırılır değilse, daha önceki zaman noktalarında gelen larva olasılığı kalır ve taze plaka artar girecek. pamuk çıkarıldığında bile, zaman zaman larvalar kafesin yanında dolaşmak ve bir toplama sırasında yiyecek girin.
3 saat üst üste koleksiyonları için, verim 840 civarında 1 saat koleksiyonları elde edilen verim 10 kat daha fazla olduğu 1250 mg, arasında değişmektedir. Bu embriyoların saflık% 100 (Şekil 3B) yakın oldu. Ara sıra larvalar gözlendi. Bazı gelişimsel çalışmalar toplanan embriyolar için çok sıkı bir senkronizasyon gerektirir. Senkronizasyon saflığını artırmak için, koşulları ideal değilse, dişiler daha olgun yumurta korumak ve yatırabilirsiniz çünkü ilk toplama plakası atmak için tavsiye edilirkoşulları gibi taze plaka tanıtımı ile olduğu gibi, geliştirmek m. Ayrıca eski yetişkin sinekler (> 6 gün) daha az senkronize embriyolar üretmek olduğunu bilmek önemlidir. yüksek doğruluk ile senkronizasyon derecesini doğrulamak için, toplanan embriyoların bir DAPI boyama önerilir.
Şekil 1. Fly Nüfus Cage Drosophila melanogaster Yaşam Döngüsü. Döngüsünün (A) Başlangıç plastik kutu kap içine embriyoların 1.5 g tohumlama. Bir referans olarak, alt panelde, filtre kağıdı uzunluğu 8.5 cm dir. (B) Larva nispeten 5 gün döngüsünün başlangıcından sonra senkronize büyüyen. 8. günde (C), sinekler en pupa içindedir. B (b '), ve C alt paneller (C '), üst panel belirtilen alanlarında büyütme bulunmaktadır. (D) Yetişkin sinekler 10 gün döngüsü başlandıktan sonra pupa ortaya çıktı. (E) Yetişkin sinek gıda 15. günde de, sarımsı materyal embriyoları toplama işlemine başlamadan önce nüfus kafes içinde uçar döllenmiş yumurta. 100 kaba elek dibinde toplanan (F) Embriyolar (ve birkaç larva), bir bütün kafes döngüsünden sonra. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Tüm Döngüsü Toplama Programı. Şekil 2, bir tam döngü toplanması için önerilen program gösterilmektedir. t = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 1 saat ve 3 saat ardışık koleksiyonları 3. Saflık. 1 saat (A) ve gıda yeni bir tepsi ekledikten sonra 3 saat (B) toplanan embriyoların Temsilcisi görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Çevrim numarası | Verim: (g) |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 9.5 |
| 3 | 10.3 |
| 4 | 12.7 |
| 5 | 10 |
| 6 | 7.1 |
| Collection # | Koleksiyonun Uzunluğu (saat) | Verim: (mg) |
| 1 | 1 | 14.5 |
| 2 | 1 | 21.6 |
| 3 | 1 | 56.1 |
| 4 | 1 | 160.1 |
| 5 | 1 | 106.1 |
| 1 | 3 | 960 |
| 2 | 3 | 840 |
| 3 | 3 | 1250 |
Tablo 2. 1 saat ve 3 saat Ardışık Koleksiyonlar Verim. Tablo 2 Yeni pekmez plaka yerleştirdikten sonra yeni gıda ve arka arkaya 3 koleksiyonları 3 saat ekledikten sonra 1 saat 5 ardışık koleksiyonları verimini gösterir.
Discussion
Malzeme bir 1.5 g başlayarak döngü başına 7 ile 13 g arasında toplanan embriyolar bir verim elde edebilir. materyal Böyle bir miktarda almak için uçucu döngüsünün tüm aşamaları için doğru kültür koşulları sağlamak için çok önemlidir.
en önemli parametreler sırasıyla 24 ºC ve% 35 olmalıdır sıcaklık ve nem vardır. bu iki parametre laboratuar normal bir ortamda sabit tutulması mümkün değilse, bir olasılık, bir inkübatör veya bir çevre odasına sinek kafesi yerleştirmek olacaktır. Diğer protokoller üretilen yumurta 9,10 verimini artırmak için% 70 nem ve aynı zamanda sabit bir 24 saat aydınlık-karanlık döngüsü önerilir. Ancak% 35 civarında nem tutma bakteri kontaminasyonu önler ve bu protokolün amacı, nüfus kafesin sadece bakım olduğundan, sinekler laboratuar normal ışık ortamında tutulur.
Bir diğer önemli nokta di tutmaktıryetişkin sturbances mümkün olduğunca düşük uçar. Diğer sinekler çapraz bulaşmayı önlemek için sinek odasından ayrı bir yere kafesi tutmak için tavsiye edilebilir.
Onların saflığını korumak ve büyük nüfus kafeslerde 14 belirgin anormal çiftleşme davranışı sergileyebilir çok zor olduğundan transgenik ve mutant sinekler büyük popülasyonlarının kültür, tavsiye edilmez.
Olası bir sorun büyük miktarlarda Drosophila kültür gıda için rekabet edebilir ve dolayısıyla üretilen yumurta verimi azaltacak akarları ve / veya küf gibi diğer organizmalar, varlığıdır. Bunu önlemek için, o temiz, tüm ekipman tutmak kafesi, ağlar yıkama su ve sabunla ve her döngüden sonra atılabilir malzeme (köpük fişler) atarak kutuları uçmak için çok önemlidir. adımda sinek yiyecek hazırlarken büyüyen kalıp azaltmak için, propiyonik ve fosforik asit ıslak maya ilave edilirpekmez hazırlanması 1.2 ve Tegosept adım 3.1 tepsi. zaman kısa ve malzemeler hemen temizlenmelidir olamaz zaman böyle -20 ˚C plastik kutu veya elek gibi bir yerde malzemelere bazen yararlı olabilir.
Embriyolar sinek kutunun içine ekilmiş ve son toplama gününde biten zaman başlayan, 15 gün - Bütün bir koleksiyon döngüsü 14 oluşur. Bu süre boyunca, protokol bölümünde ayrıntılı bir nüfus sinek kafes bakımı (Şek. 2) için gerekli tüm adımları, hatırlamak için bir program düzenlemek için tavsiye edilir. yetişkin sinekler ortaya kadar yumurta, numaralı seribaşı olduğu günden itibaren, sadece plastik kutu incelemek için gerekli olan ve pupa devresi oluştuğunda, kafesin içine yerleştirmek için. Embriyolar, yeni bir çevrim için tohumlanmıştır kadar 3 gün - Daha sonra sinekler her 2 beslenmeleri gerekmektedir. Bütün protokolde, en uzun gün yeni bir döngü başlatmak için embriyoların toplama ve tohumlama sırasında. bir5 gün yetişkin eclosion sonra ve nihayet 2 gün sonra azalır - protokolde yorumladı s, en iyi yumurta verimi 3'tür. Bu yumurtaların hasat yapılacak olan güne seçmek için bize bazı esneklik verir.
Herhangi bir nedenle toplanan embriyoların verimi arzu edilen çıkış miktarı (1.5 g) daha az olması durumunda, tek bir zaman yeni bir pekmez tepsi ekleme ve daha fazla yumurta ertesi gün toplayabilir. Sabit koleksiyonları için, paralel 2 kafesleri korumak için tavsiye edilir, ve embriyoların yüksek miktarlarda gerekiyorsa, aynı zamanda büyük kafesleri kullanmak mümkündür edilir. Kısa süre koleksiyonları yapmanın durumunda, verimi artırmak için tek yönlü sabah yumurtlama patlama yararlanmak etmektir.
Çeşitli gelişim evreleri büyük miktarlarda toplanması pek çok avantajı vardır. Örneğin, nüfusun kafesleri toplanan embriyolar immüno-çökeltme tahlilleri 6-8 kütle collectio çok başarılı bir şekilde kullanılmıştırayrışmış larvaları larva dokuların N 3C deney 4 ve RNA preparatları 15 için çok iyi bir kaynağı olduğu göstermiştir, ve yetişkin sinek kafaları ChIP deneyler 16 kullanılmıştır. Buna ek olarak, yetişkinler genellikle doku kültürü 17 için sinek özleri yapmak için ihtiyaç vardır.
kafesin en umut verici uygulamalardan biri patojenlerin biyolojik moleküller, kimyasal maddeler ve iyonizan radyasyon maruz kalmaya yanıt olarak genler, transkript, proteinler ve Metabolitlerin analiz ve tarama izin yüksek verimli deneyleri için bir materyal sunmaktır. Bu büyük ölçekli deneylerde bireylerin çok sayıda gereklidir, ve burada açıklanan sinek nüfus kafes onların analiz ve 18 taranması için Drosophila yaşam döngüsünün farklı aşamalarında malzemenin büyük miktarlarda elde etmek için çok yararlı olabilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila. Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).
- Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 26, 148-159 (2013).
- Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen. Mol Cell. 8, 485-499 (2014).
- Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex. Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).
- Maksimenko, O. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99 (2015).
- Lei, E. P., Corces, V. G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 38, 936-941 (2006).
- Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P.
- King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner. J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Roberts, D. B., Standen, G. N. The elements of Drosophila biology and genetics. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. , Oxford University Press. Oxford. 1-53 (1998).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: The laboratory setup. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development. PLOS Genet. 13, e1004971 (2015).
- Zhang, S. D., Odenwald, W. F. Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).
- Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA. 21, 375-384 (2015).
- Moshkovich, N., Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLOS Genet. 12, e1000880 (2010).
- Drosophila RNAi Screening Center [Internet]. , Available from: http://www.flyrnai.org/DRSC-PRC.html (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).
