This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Förmågan att kombinera genetiska och biokemiska metoder har gjort Drosophila särskilt lämplig organism för biokemi och molekylärbiologi studier 1-3. Dessa studier kräver ofta stora mängder av biologiskt material, inte bara från vuxna flugor, men även från larver 4, puppor 5 och embryon 6-8. För att erhålla stora mängder material, forskare har odlade flugor med hjälp av stora behållare som kallas flyga "populations burar". Dessa burar består av en cylinder tillverkad av plast täckt med ett nät på båda sidor för att möjliggöra införandet av mat inne i buren utan flugorna flyr. Dessa burar kan vara hemlagad 9-11 eller köpas från ett företag (se tabell av specifika material / utrustning).
En stor fördel med att använda detta system för att odla ett stort antal flugor är att cykeln av bananfluga 12 kan styras på ett sätt som alla flugor utvecklas i en redevis synkroniserat sätt. Denna synkronisering uppnås genom sådd nya embryon, utfodring larver / flugor och offra de vuxna flugorna vid exakta tidpunkter. Med hjälp av en synkroniserad fluga befolkning är särskilt användbar för utvecklingsstudier 13.
Starten av en ny population bur från några flugor är en tidskrävande process som kräver många amplifieringscykler 9-11. Även med större behållare som flyga odlingsflaskor eller minicages, kan hela processen pågå i månader. För att undvika detta tidsödande steg, många Drosophila laboratorier upprätthålla regelbundet sådana burar. Det är mest praktiskt att starta en ny bur utgående från en embryosamlings från en redan etablerad population bur. I allmänhet är de flesta labb upprätthålla vildtyp befolknings burar, såsom Oregon R eller Canton S. manuskript presenterar ett detaljerat protokoll för att upprätthålla flyga befolkningen burar.
Från och med 1,5 g material kan man få ett utbyte av insamlade embryon mellan 7 och 13 g per cykel. För att få en sådan mängd material är det viktigt att behålla de rätta odlingsbetingelserna för alla stadier av flugan cykeln.
De viktigaste parametrarna är temperatur och fuktighet, som bör vara 24 ° C och 35% respektive. Om dessa två parametrar inte kan hållas konstant i den normala miljön i labbet, skulle en möjlighet vara att placera flugan buren i en inkubator eller en klimatkammare. Andra protokoll rekommenderar 70% luftfuktighet och även en konstant 24 timmar ljus-mörker-cykel för att öka utbytet av de producerade ägg 9,10. Men att hålla luftfuktigheten ca 35% undviker bakteriell kontamination, och eftersom syftet med detta protokoll är endast upprätthållandet av en population bur är flugorna hålls i normalt ljus miljö labbet.
En annan viktig punkt är att hålla disturbances till vuxna flugor så låg som möjligt. Det kan vara tillrådligt att hålla buren på en plats skild från flugan rum för att undvika korskontaminering från andra flugor.
Odling av stora populationer av transgena och muterade flugor rekommenderas inte, eftersom det är mycket svårt att upprätthålla sin renhet och de kan uppvisa uttalad onormalt parningsbeteende i stora befolknings burar 14.
Ett möjligt problem medan odling Drosophila i stora mängder är närvaron av andra organismer som kvalster och / eller mögel, som kommer att konkurrera för mat och därmed minska utbytet av producerade ägg. För att undvika detta, är det mycket viktigt att hålla all utrustning ren, tvätta buren, nät och flyga lådor med vatten och tvål och kasta engångsmaterial (skumpluggar) efter varje cykel. För att minska mögel växer, är propionsyra och fosforsyra i den våta jäst vid beredning av flugan mat i steg1,2 och Tegosept vid upprättandet av melass facket i steg 3,1. Det är ibland bra att placera material såsom plastlådan eller siktar på -20 ˚C när tiden är kort och material kan inte rengöras direkt.
En hel samling cykel förekommer i 14 – 15 dagar, med början när embryona såddes i flugasken och slutar med den sista samlingen dagen. Under denna tid, är det rekommenderat att organisera ett schema för att komma ihåg alla de åtgärder som krävs för att upprätthålla en population flyga bur (Fig. 2), som beskrivs i protokollet avsnitt. Från den dag då äggen är seedade, tills de vuxna flugorna dyker upp, är det endast nödvändigt att inspektera plastlådan, och när pupation inträffar att placera dem inne i buren. Efter det, flugorna måste matas varje 2 – 3 dagar tills embryon sås ut för en ny cykel. I hela protokollet, är den längsta dagen under insamling och sådd av embryon för att starta en ny cykel. ens kommenterade i protokollet, är den bästa ägg avkastning 3 – 5 dagar efter vuxen eclosion, och slutligen avtar 2 dagar senare. Detta ger oss en viss flexibilitet för att välja den dag då skörden av äggen kommer att utföras.
Om du av någon anledning utbytet av insamlade embryon är mindre än den önskade utgångsbeloppet (1,5 g), en alltid kan lägga till en ny melass fack och samla in mer ägg nästa dag. För konstant samlingar, är det rekommenderat att behålla 2 burar parallellt, och om det krävs större mängder av embryon, även är det möjligt att använda större burar. I händelse av att göra korta tids samlingar, är ett sätt att öka utbytet för att dra nytta av den äggläggande skur på morgonen.
Det finns många fördelar med att samla in stora mängder av olika utvecklingsstadier. Till exempel, har samlats embryon från befolknings burar använts med stor framgång i immunfällningsanalyser 6-8, mass collection larver vävnader från dissocierade larver har visat sig vara en mycket bra källa för 3C experiment 4 och RNA-beredningar 15, och huvuden från vuxna flugor har använts för spån experiment 16. Dessutom är vuxna ofta behövs för att göra flyga extrakt för vävnadsodling 17.
En av de mest lovande tillämpningarna av buren är att tillhandahålla material för high-throughput assays som möjliggör analys och screening av gener, transkript, proteiner och metaboliter som svar på exponering av patogener, biologiska molekyler, kemiska ämnen och joniserande strålning. I dessa storskaliga analyser stort antal individer krävs och flugan befolkningen bur som beskrivs här kan vara till stor hjälp för att få stora mängder material under olika faser av Drosophila livscykeln för sin analys och screening 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |