Introduction
جعلت القدرة على الجمع بين النهج الوراثية والبيوكيميائية ذبابة الفاكهة كائن مناسبة خاصة بالنسبة للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية الدراسات 1-3. وغالبا ما تتطلب هذه الدراسات كميات كبيرة من المواد البيولوجية، ليس فقط من الذباب الكبار، ولكن أيضا من اليرقات 4، 5 الشرانق والأجنة 6-8. للحصول على كميات كبيرة من المواد، الباحثين الذباب مثقف باستخدام الحاويات الكبيرة المعروفة باسم يطير "أقفاص السكان". تتكون هذه الأقفاص من اسطوانة مصنوعة من البلاستيك بواسطة شبكة من الجانبين مغطاة للسماح لإدخال المواد الغذائية داخل القفص دون الذباب الهرب. ويمكن لهذه الأقفاص تكون محلية الصنع 9-11 أو شراؤها من شركة (انظر الجدول المواد / معدات معينة).
والميزة الرئيسية لاستخدام هذا النظام لزراعة أعداد كبيرة من الذباب هي أن دورة من ذبابة الفاكهة 12 يمكن التحكم في الطريقة التي تتطور كل الذباب في إعادةتزامن latively الطريقة. ويتحقق هذا التزامن عن طريق بذر أجنة جديدة، وتغذية اليرقات / الذباب والتضحية الذباب الكبار في أوقات محددة. باستخدام السكان ذبابة متزامنة مفيدة بشكل خاص للدراسات التنموية 13.
بداية قفص السكان الجدد من عدد قليل من الذباب هي عملية تستغرق وقتا طويلا تتطلب العديد من الدورات من التضخيم 9-11. حتى باستخدام حاويات أكبر مثل زجاجات ثقافة ذبابة أو minicages، يمكن أن العملية برمتها تستمر لأشهر. لتجنب هذه تستغرق وقتا طويلا الخطوة، العديد من المختبرات ذبابة الفاكهة تحافظ بانتظام مثل هذه الأقفاص. ومن الأكثر ملاءمة لبدء قفص جديد ابتداء من جمع الأجنة من قفص السكان بالفعل. بشكل عام، فإن معظم معامل تحتفظ أقفاص السكان wildtype، مثل ولاية أوريغون R أو كانتون S. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة للحفاظ على أقفاص السكان الطاير.
Protocol
1. بدء دورة: الأجنة البذر
ملاحظة: تبدأ الدورة مع 1.5 غرام من المواد التي تم جمعها (خليط يتكون من الأجنة و / أو بعض الاولى يرقات العمر) من الدورة السابقة. سيتم وضع هذه المواد في وعاء من البلاستيك (انظر الجدول المواد / معدات معينة) مع الخميرة خليط فعال حتى مرحلة العذراء. سيتم إغلاق الحاوية بعد إدخال خليط البيولوجي للأجنة ويرقات مع غطاء لتجنب السماح لليرقات من الفرار. فمن الضروري لجعل ثقوب في غطاء من أجل السماح للدوران الهواء. لتجنب هروب اليرقات من خلال الثقوب، وتستخدم المقابس رغوة. وأخيرا، ينصح بارتداء القفازات ومعطف المختبر، وليس فقط في هذا القسم ولكن أيضا في البروتوكول كله، لتجنب الحصول على ملابس قذرة أو تلطيخ مع التبييض.
- إعداد الحاويات البلاستيكية.
- جعل ثلاثة ثقوب مربعة بشفرة حلاقة في غطاء حاوية بلاستيكية لpproximately 2.2 سم. إضافة شريط (3/4 بوصة وسم الشريط) إلى أربع زوايا كل ثقب لضمان تناسب ضيق لشمعات الرغوة (50 × 55 مم، DXL)، ثم وضع المكونات رغوة واحدة في كل حفرة.
- تغطية داخل حاوية بلاستيكية مع غلاف بلاستيكي. خلال هذا الفيلم، إضافة طبقة من القطن لتغطية الجزء السفلي من الحاويات البلاستيكية. المسيل للدموع القطن مع أصابعك.
- إعداد الطعام ذبابة.
- إضافة 333 مل من الماء منزوع الأيونات في كوب 500 مل. مع التحريك الكأس مع شريط مغناطيسي، إضافة 167 ميكرولتر من حمض البروبيونيك و1.08 مل من حمض الفوسفوريك، من الحلول الأوراق المالية (99.96٪ و 85٪ على التوالي).
- إضافة ببطء 77.5 غراما من الخميرة الجافة النشطة، وتجنب كتل كبيرة. بعد حل الخميرة الجافة، إضافة 38.8 غرام من السكروز.
ملاحظة: يجب أن يكون السكروز العنصر الأخير لتضاف لمباشرة بعد إضافة هذا المكون، وسوف يبدأ التخمر.
- مباشرة بعد حل السكروز، صبالغذاء على القطن، والتأكد من تغطية القطن بالتساوي. إغلاق وعاء من البلاستيك مع غطاء لتجنب الذباب هرب داخل المختبر تلوث الغذاء.
- و resuspend 1.5 غرام من الأجنة تحصد (لا dechorionated) من الدورة السابقة مع 5 مل من الايثانول 70٪. قطع في نصف اثنين من أوراق الترشيح وتوزيع خليط البيولوجي بالتساوي على 4 قطع باستخدام ملعقة أو الماصة نقل مع طرف واسعة (قطع إذا لزم الأمر). وضع أوراق الترشيح على رأس القطن غارقة وإغلاق الغطاء. وأخيرا، واحتضان الحاويات البلاستيكية في RT (24ºC) والرطوبة (35٪) حتى مرحلة الشرنقة.
ملاحظة: يجب عدم وضع الحاويات البلاستيكية في غرفة رطبة، وإلا فإن هذا سوف يشجع نمو البكتيريا.
2. استمرار دورة: من الأجنة إلى الذباب.
ملاحظة: هذا جزء من دورة يذهب من الأجنة وضعت في حاوية بلاستيكية في يوم 1 حتى وقت لاحق 9 أيام عندما الذباب الكبار ستخرجمن الشرانق. خلال هذه الأيام 8 لابد من عمل شيء لكن رصد تلك الأجنة التقدم بشكل صحيح إلى المراحل التالية من دورة حياة ذبابة الفاكهة حتى eclosion. إذا يرقات تبدأ الموت وتحول الأسود خلال هذا الوقت، تأكد من أن سدادات الرغوة ليست ضيقة جدا، وبشرط أن يكون جيد التهوية. هذه الفترة هي الوقت المناسب لتنظيف القفص السكان يطير من الدورة السابقة.
- أصبحت مراقبة الأجنة 1 شارع الطور اليرقات حوالي 24 ساعة بعد إيداع الإناث الكبار منهم إلى الطعام ذبابة (راجع الخطوة 3). واليرقات الناتجة تغذية من الطعام ذبابة أعدت في الخطوة 1 خلال 4 أيام، وتزايد وطرح الريش مرتين في الثانية 2 و 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات.
- تنظيف القفص السكان الطاير.
- وضع القفص في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لإبطاء نشاط الذباب. إزالة الشبكة التي تغطي جانب واحد من القفص، ومع الحركة السريعة، وكأب الجانب مفتوحة مع البلاستيك واقية كبيرحقيبة. صب محتويات القفص في الكيس.
- مع حقيبة واقية لا يزال يغطي جانب واحد من القفص، وضع القفص عموديا أكثر من بالوعة مع الجانب حقيبة واقية أسفل. بعناية إزالة كيس من البلاستيك لمنع الذباب الهروب وتخلص منه في حاوية نفايات بيولوجية.
- بعناية فتح الشباك العلوي بما فيه الكفاية لخلق ثقب صغير، وشطف داخل القفص مع الماء، والتي سوف يغسل الذباب في الحوض. ببطء زيادة حجم الثقب، والقضاء على كل الذباب داخل القفص.
- تنظيف القفص وكلا شبكات بالماء والصابون. في حين أن شبكات لا تزال رطبة تأمينها على جانبي القفص نظيفة وجافة، وأخيرا وضعت داخل ورقة المختبر معتاد على الثمالة، والتي سوف يمنع الفيلم من البلاستيك أعدت في الخطوة 1.1.2 من الالتصاق إلى القفص. الآن القفص جاهز للدورة المقبلة.
- بعد أربعة أيام من الإعداد الأولي، ومراقبة تخدر تصبح خادرة اليرقات. وسوف تظل اليرقات في هذه المرحلة لمدة 4 أيام أخرى.
وأشارأورينغ هذه المرحلة الشرانق سوف تغطي سطح القطن بأكمله داخل حاوية بلاستيكية. - خلال مرحلة العذراء وقبل ظهور الذباب الأولى، فتح وعاء من البلاستيك ووضع الفيلم البلاستيكية التي تحتوي على القطن مع كل الشرانق على ورقة المختبر معتاد على الثمالة داخل القفص السكان نظيفة. إغلاق الشبكة مع عقدة مزدوجة وتنظيف الحاويات البلاستيكية وغطاء للدورة المقبلة.
ملاحظة: شرانق الملصقة على غطاء ينبغي التخلص منها وتدميرها من قبل التعقيم أو تجميد قبل eclosion.
الذباب 3. الكبار.
ملاحظة: بعد 4 أيام من الشرنقة المرحلة الأولى الذباب ستخرج من الشرانق. ضمن 24-48 ساعة يجب أن eclosed كل الذباب. في هذا الجزء من دورة، من المهم أن توفر لهم الغذاء بهدف خلق البيئة المناسبة للتكاثر.
- تحضير دبس الصواني.
- الجمع في 1 لتر قارورة 556.25 مل من H 2 O منزوع الأيونات، 90 مل من دبس السكر، و 22 غراما من أجار. الأوتوكلاف مع بقضيب لمدة 30 دقيقة، باردة وإضافة 9.25 مل من 10٪ Tegosept في 95٪ ETOH.
- يسكب المزيج في صينية اللحم من 21 × 14.5 سم. تأكد من أن حجم ما يكفي لتغطية 15-17 الصواني. الانتظار 10-20 دقيقة لترسيخ وتغطية كل علبة مع فيلم من البلاستيك لتجنب جفاف. عدة قوارير من 1 L يمكن أن تكون مستعدة في نفس الوقت. تخزين الدبس صواني في 4 درجة مئوية ملفوفة في البلاستيك حتى المطلوبة.
- إضافة علبة الدبس مغطاة الخميرة الرطب داخل القفص مع الذباب الكبار.
- قبل أن يضيف لوحة، ووضع القفص في 4 درجة مئوية في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 200 مل من H 2 O منزوع الأيونات في كوب ويصب ببطء الخميرة الجافة مع التحريك بملعقة. إيقاف إضافة الخميرة الجافة عندما يصبح الخليط حوالي اتساق زبدة الفول السوداني لمنع الذباب يعلقوا في الغذاء.
ملاحظة: من المهم عدم السماح الحل الغذائية ليصلب وإلا فإنه سيكون من الصعب جدا لتغطيةالدبس صينية واستخراج البيض أثناء عملية الحصاد (انظر القسم 4.3). - إزالة فيلم من البلاستيك من علبة واحدة الدبس، وتغطي بطبقة من الخميرة الرطب مستعدة جديدة باستخدام ملعقة أو ملعقة. تأكد من أن يتم تغطية كامل سطح.
- في حين القفص لا يزال في غرفة باردة، فتح الشباك وبعناية إضافة علبة دبس السكر مع الخميرة الرطب في قفص. إغلاق شبكة الإنترنت، ووضع القفص في RT.
ملاحظة: قد يكون من المفيد لتغطية لوحة مع صينية اللحم فارغة أثناء الإدراج، ولكن تأكد من عدم منع وصول الذباب إلى علبة الدبس.
- تغيير لوحة الطعام كل 24-48 ساعة لتجنب الخميرة للحصول على جافة جدا. الذباب الكبار حساسة جدا للجفاف.
4. نهاية دورة: حصاد الأجنة
ملاحظة: خصوبة أفضل ذبابة هي 3-5 أيام بعد eclosion. ولذلك، فإن الحصاد خلال هذه الفترة الحصول على أفضل عائد الجنين. مجموعات بعد المرجوة هي COMPLEتيد، ودورة قد انتهت. ينبغي التضحية الذباب والقفص تنظيفها كما هو محدد في الخطوة 2.2.
- عادة، بعد 2 أيام eclosion الطيران، وإدخال الدبس جديدة صينية مع الغذاء الرطب الطازج في قفص، كما هو موضح في القسم 3.2.5. لزيادة الغلة من البيض الترسيب، مع مساعدة من الأصابع، وجعل السطح من الخميرة الرطب غير منتظمة قدر الإمكان. إذا صينية الطعام القديمة موجودة في القفص، قبل أن يضيف لوحة جديدة، وإزالة بعناية وتخلص منه في حقيبة واقية. آخر نصيحة لزيادة العائد لإزالة طبقة من القطن لذلك سيتم وضع كل البيض في الطعام. الحفاظ على القفص في RT.
- مراقبة الأجنة كنقاط صغيرة بيضاء.
ملاحظة: البيض جاهزة للجمع. للصيانة الروتينية من القفص الطاير، 2 جمع اليوم هو الوقت الموصى به. ستحتوي هذه المجموعة في معظمها الأجنة وعدد قليل من 1 شارع الطور اليرقات. رؤية النتائج ممثل عن عوائد نموذجية من الأجنة حصادها لمختلف كولينقاط الوقت ction. - حصاد الأجنة
- وضع القفص في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة. في الوقت نفسه إعداد وعاء من البلاستيك والمواد الغذائية الطيران للدورة المقبلة كما هو موضح في القسم 1.
- في صينية الأوتوكلاف 8 L إضافة الماء إلى ربع إجمالي الطاقة الإنتاجية ومن ثم إضافة 1 مل من 10٪ تريتون X-100. في حين القفص هو في غرفة باردة إزالة بعناية لوحة الدبس ووضعه داخل كيس واقية.
- إزالة علبة من الكيس ويغرق بسرعة (لمنع الذباب من الهروب) في حل المنظفات في علبة التعقيم. إغلاق حقيبة واقية وضعت في حاوية واقية. والذباب لا يغرق في الماء الذي لا يحتوي على مواد التنظيف.
- استخدام الفرشاة الكبيرة والمقطر مدفع المياه لغسل الأجنة والخميرة الخروج من دبس السكر. تجاهل لوحات ودبس السكر في مربع واقية.
- صب حل بعناية من خلال مجموعة غربال ثلاثة (خشن غربال 30 على القمة، 40 في الوسط و 100 في الأسفل). غسل كتل سن المستوى مع بندقية الماء المقطر حتى لا تظل كتل.
ملاحظة: الكبار الذباب وسيتم الاحتفاظ 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات في غربال 30.- شطف الدرج الأوتوكلاف مع الماء المقطر وصب ماء الشطف من خلال مناخل. إزالة أعلى غربال وتكرار العملية إذا بقيت كتل الخميرة. ومعظم الحادي و1 و كل من اليرقات طور مرحلي 2 الثانية البقاء في غربال 40.
- إزالة غربال الثاني. مادة صفراء في (القاع) غربال الثالث هو خليط من الأجنة والصغيرة 1 شارع الطور اليرقات. استخدام مدفع الماء المقطر لنقل كل البيض إلى جانب واحد من غربال. جمعها مع ملعقة ووزن لهم.
- خلال هذه الدورات العائد جمع الأجنة / اليرقات يتراوح بين 7 و 13 غرام. استخدام سوى 1.5 غرام من هذه المواد لبدء دورة جديدة (المادة 1). استخدام ما تبقى من الأجنة لمزيد من المعالجة أو يمكن التخلص منها.
5. وعلاوة على ذلكمعالجة
ملاحظة: الأجنة لا تستخدم للاستمرار من السكان يمكن استخدامها على الفور لإجراء التجارب أو بدلا من ذلك يمكن تجميدها في -80 درجة مئوية. لكلا الخيارين، قد تحتاج إلى أولا dechorionated الأجنة.
- لdechorionation، وغسل الأجنة لمدة 2 دقيقة في 50٪ من محلول التبييض وشطف جيدا بالماء المقطر.
- تجميد الأجنة، أول الجافة عن طريق الضغط بقوة مع منشفة ورقية، ثم وزن وضعها، مع مساعدة من ملعقة، إلى 15 أو 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. أخيرا غمر أنبوب مخروطي في السائل N 2 لبضع ثوان.
Representative Results
ويستند في الحفاظ على السكان قفص ذبابة على دورة حياة الذبابة. لذلك، بعد وضع خليط البيولوجي الأولي للأجنة ويرقات في وعاء من البلاستيك (الشكل 1A) البويضة الملقحة سوف تصبح اليرقات في ما لا يزيد عن 2 يوما، وسوف اليرقات تنمو لمدة 4 أيام، وتزامن نسبيا خلال مختلف مراحل اليرقات طور مرحلي ( انظر الشكل 1B).
بعد اليرقات قد أكملت 3 طور مرحلي الثالثة مرحلة اليرقات فإنها تخدر تصبح خادرة وتغطية سطح القطن داخل الحاوية البلاستيكية مع بعض على السطح الداخلي للغطاء (الشكل 1C). وهذه الفترة التشرنق يذهب لمدة 4 أيام المقبلة حتى الانتهاء من الذباب عملية التحول. خلال هذه الفترة فمن المستحسن لنقل الذباب في قفص. وسوف يبدأ الذباب الكبار الأولى لeclose في يوم 9-10 بعدسوف بدء دورة (1D الشكل) ويوم 11 فقط منهم ظهرت من الشرانق.
يتم الحصول على أفضل عائد من جمع الأجنة 3 - 5 أيام بعد eclosion (يوم 13 إلى 15) وينخفض في نهاية المطاف في يوم 17 (7 أيام بعد eclosion). ولذلك، فمن المستحسن أن إضافة علبة الأخيرة من الأغذية الطازجة في يوم 13، وجمع البيض في يوم 15 (الشكل 1E وواو). وهذا سوف يسمح جمع أكبر عدد ممكن من الأجنة. إضافة يوم إضافي ثالث قبل أن يقلل من العائد من الأجنة التي تم جمعها جمع قد يؤدي إلى الغذاء يجري جافة جدا وبالتالي. ويبين الجدول 1 العائد من 6 مجموعات دورة متتالية، مع وجود مادة بدءا من 1.5 غرام في كل دورة، والشكل 2 هو الجدول الزمني الموصى بها لجمع دورة كاملة.
المادة تحصد في يوم 260؛ فترات تتكون في معظمها من الأجنة. ولكن عدد قليل من اليرقات موجودة أيضا. لأغراض الصيانة القفص هذه اليرقات ليست مشكلة، حيث من المتوقع قدرا من asynchronicity. على الرغم من ذلك لبعض التجارب والكيمياء الحيوية، ونقاء من هذه الأجنة مهم جدا، ولكن في نفس الوقت من الضروري أيضا لجمع كميات كبيرة من البيض لتنفيذ هذه التجارب. لهذا السبب تم تنفيذ عدة مجموعات قصيرة متتالية في 1 ساعة و 3 ساعات، بعد إضافة بسرعة في RT لوحة جديدة مع الغذاء، لتوفير تقدير المحصول والنقاء التي يمكن الحصول عليها مع هذا الأسلوب (الجدول 2 والشكل 3) . بدأت مجموعات 1 ساعة على التوالي مع العائد المنخفض جدا (14.5 ملغ) ولكن بعد ذلك كميات من الأجنة زيادة في كل مرة يتم جمعها لكن في المرة الأخيرة. العائد المنخفض في البداية قد يكون راجعا إلى الذباب الذي أكد خلال عملية تغيير الطعام ولكن في وقت لاحق التأقلم. من ناحية أخرى، لا لاروقد لوحظت الدرهم في مجموعات متتابعة خمسة (الشكل 3A)، وتبين أن مجموعات أقصر العائد العالي النقاء. إذا لم تتم إزالة القطن من القفص، فإن احتمال أن اليرقات من نقاط وقت سابق تبقى وأدخل يتم زيادة وحة جديدة. حتى عندما تتم إزالة القطن، في بعض الأحيان اليرقات ويهيمون على وجوههم على جانب القفص ودخول المواد الغذائية خلال مجموعة.
بالنسبة للمجموعات 3 ساعة على التوالي، تراوح العائد 840-1250 ملغ، أي حوالي 10 مرات أكثر من الغلات المنتجة في مجموعات ساعة 1. كان على نقاء هذه الأجنة قرب 100٪ (الشكل 3B). وقد لوحظت اليرقات في بعض الأحيان. تتطلب بعض الدراسات التنموية تزامن صارم جدا للأجنة التي تم جمعها. لزيادة نقاء التزامن، فمن المستحسن أن يتخلص من لوحة مجموعة الأولى لأنه إذا الظروف ليست مثالية، يمكن الإناث تحتفظ البيض أكثر نضجا وإيداعم عندما تتحسن الظروف، كما هو الحال مع إدخال لوحة جديدة. كما أنه من المهم أن نعرف أن أقدم الذباب الكبار (> 6 أيام) تنتج أجنة أقل متزامنة. للتحقق من درجة من التزامن مع دقة عالية، ينصح تلطيخ دابي من الأجنة التي تم جمعها.
الشكل 1. دورة ذبابة الفاكهة الحياة في قفص السكان ذبابة. (A) بدء دورة البذر 1.5 غرام من الأجنة في وعاء صندوق من البلاستيك. كمرجع، في اللوحة السفلى، وطول ورقة الترشيح هو 8.5 سم. (ب) يرقات أن زراعة متزامنة نسبيا بعد 5 أيام من بدء الدورة. (C) في يوم 8، أكثر من الذباب هم في مرحلة الخادرة. انخفاض وحات في B (B ') وC (C ') هي تكبير من المجالات المشار إليها في لوحات العليا. الذباب (D) الكبار ظهرت من الشرانق بعد 10 يوما بدء دورة. (E) الكبار الذباب داخل القفص السكان قبل البدء في عملية جمع الأجنة، في يوم 15. المادة صفراء على الطعام ذبابة على البيض المخصب. (F) الأجنة (وعدد قليل من اليرقات) التي تم جمعها في الجزء السفلي من منخل 100 خشن، بعد دورة قفص بأكملها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. كامل الجدول مجموعة دورة. ويبين الشكل 2 الجدول الزمني الموصى بها لجمع دورة كاملة. ر = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الطهارة من 1 ساعة و 3 ساعة مجموعات متتالية. صورة الممثل من الأجنة التي تم جمعها في 1 ساعة (A) والموارد البشرية 3 (ب) بعد إضافة علبة جديدة من المواد الغذائية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عدد دورة | العائد (ز) |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 9.5 |
| 3 | 10.3 |
| 4 | 12.7 |
| 5 | 10 |
| 6 | 7.1 |
| مجموعة # | طول جمع (ساعة) | العائد (ملغ) |
| 1 | 1 | 14.5 |
| 2 | 1 | 21.6 |
| 3 | 1 | 56.1 |
| 4 | 1 | 160.1 |
| 5 | 1 | 106.1 |
| 1 | 3 | 960 |
| 2 | 3 | 840 |
| 3 | 3 | 1250 |
الجدول 2. العائد من 1 ساعة و 3 ساعة مجموعات متتالية. ويبين الجدول 2 العائد من 5 مجموعات متتالية 1 ساعة بعد إضافة طعام جديد و3 مجموعات متتالية 3 ساعة بعد وضع لوحة الدبس جديدة.
Discussion
يمكن أن تبدأ مع 1.5 غرام من مادة واحدة الحصول على العائد من الأجنة التي تم جمعها ما بين 7 و 13 غ لكل دورة. للحصول على هذا المبلغ من المواد التي لا بد من المحافظة على ظروف زراعة المناسبة لجميع مراحل دورة الطيران.
أهم المعايير هي درجة الحرارة والرطوبة، والتي ينبغي أن تكون 24 درجة مئوية و 35٪ على التوالي. إذا كانت هذه المعلمتين لا يمكن ثابتة في البيئة الطبيعية للمختبر، ان احد الاحتمالات لوضع القفص يطير إلى حاضنة أو الغرفة البيئية. البروتوكولات الأخرى يوصى به 70٪ الرطوبة وأيضا 24 ساعة دورة ضوء الظلام مستمرة لزيادة الغلة من البيض المنتج 9،10. ولكن الحفاظ على الرطوبة حوالي 35٪ يتجنب التلوث الجرثومي، وبما أن الهدف من هذا البروتوكول هو فقط الحفاظ على قفص السكان، يتم الاحتفاظ الذباب في ضوء البيئة الطبيعية للمختبر.
نقطة أخرى مهمة هي أن تبقي ديsturbances إلى الكبار الذباب عند أدنى مستوى ممكن. قد يكون من المستحسن أن تبقي القفص في مكان منفصل عن غرفة ذبابة لتجنب التلوث من غيرها من الذباب.
لا ينصح زراعة من أعداد كبيرة من المعدلة وراثيا والذباب متحولة، لأنه من الصعب جدا للحفاظ على نقاء، وأنها يمكن أن تظهر وضوحا سلوك التزاوج الشاذ في أقفاص كبيرة من السكان 14.
مشكلة واحدة محتملة في حين زرع ذبابة الفاكهة بكميات كبيرة هو وجود كائنات حية أخرى مثل العث و / أو العفن، والتي سوف تنافس على الغذاء، وبالتالي تقليل العائد من البيض المنتج. لتجنب هذا، من المهم جدا للحفاظ على جميع المعدات نظيفة، وغسل القفص والشباك ويطير صناديق بالماء والصابون، والتخلص من المواد المتاح (شمعات الرغوة) بعد كل دورة. للحد من العفن تنمو، تضاف البروبيونيك وحمض الفوسفوريك في الخميرة الرطب عند إعداد الطعام ذبابة في الخطوة1.2 وTegosept عند إعداد العسل الأسود صينية في الخطوة 3.1. ومن المفيد في بعض الأحيان إلى المواد مكان مثل مربع من البلاستيك أو غرابيل في -20 C عندما يكون الوقت قصير والمواد لا يمكن تنظيفها على الفور.
تحدث دورة جمع كلها في 14-15 يوما تبدأ عندما يتم المصنف الأجنة في مربع الطاير وتنتهي مع اليوم جمع الماضي. خلال هذه الفترة من الزمن، فمن المستحسن لتنظيم جدول زمني من أجل أن نتذكر جميع الخطوات اللازمة لصيانة قفص الطيران السكان (الشكل 2)، مفصلة في قسم البروتوكول. من اليوم أن البيض المصنفة، حتى تظهر الذباب الكبار، فمن الضروري فقط لتفقد مربع من البلاستيك، وعندما يحدث التشرنق، لوضعها داخل القفص. بعد ذلك، والذباب يجب أن يكون الطعام كل 2-3 أيام حتى يتم المصنف الأجنة لدورة جديدة. في البروتوكول كله، وأطول يوم هو خلال جمع وزرع الأجنة لبدء دورة جديدة. اق علق في البروتوكول، وأفضل عائد البيض هو 3 - 5 أيام بعد eclosion الكبار، وأخيرا يتراجع في وقت لاحق 2 أيام. هذا يعطينا بعض المرونة لاختيار اليوم الذي سيتم تنفيذ حصاد البيض.
إذا لأي سبب من الأسباب العائد من الأجنة التي تم جمعها أقل من المبلغ المطلوب بدءا (1.5 غرام)، واحد دائما يمكن إضافة العسل الأسود صينية جديدة وجمع المزيد من البيض في اليوم التالي. لمجموعات ثابتة، فمن المستحسن للحفاظ 2 أقفاص في موازاة ذلك، وإذا كانت هناك حاجة كميات أكبر من الأجنة، فمن غير الممكن أيضا استخدام أقفاص أكبر. في حالة القيام مجموعات زمنية قصيرة، طريقة واحدة لزيادة الغلة للاستفادة من انفجار وضع البيض في الصباح.
هناك العديد من المزايا من جمع كميات كبيرة من مراحل النمو المختلفة. على سبيل المثال، تم استخدام الأجنة التي تم جمعها من أقفاص السكان بنجاح كبير في فحوصات مناعي 6-8، collectio الشاملوقد أثبتت ن من أنسجة اليرقات من اليرقات فصلها لتكون مصدرا جيدا للغاية بالنسبة 3C التجارب 4 والاستعدادات RNA 15، ولقد تم استخدام رؤوس من الذباب الكبار للتجارب رقاقة 16. وبالإضافة إلى ذلك، غالبا ما يحتاج الكبار إلى جعل مقتطفات الطيران لزراعة الأنسجة 17.
واحدة من أكثر التطبيقات الواعدة من القفص هو توفير المواد لفحوصات عالية الإنتاجية التي تسمح للتحليل وفحص الجينات، النصوص والبروتينات والأيض ردا على التعرض لمسببات الأمراض، والجزيئات البيولوجية، والمواد الكيميائية والإشعاع المؤين. في هذه المقايسات على نطاق واسع مطلوب أعداد كبيرة من الأفراد، والقفص السكان ذبابة الموصوفة هنا يمكن أن تكون مفيدة جدا من أجل الحصول على كميات كبيرة من المواد خلال مراحل مختلفة من دورة حياة ذبابة الفاكهة لتحليل وفحص 18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila. Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).
- Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 26, 148-159 (2013).
- Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen. Mol Cell. 8, 485-499 (2014).
- Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex. Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).
- Maksimenko, O. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99 (2015).
- Lei, E. P., Corces, V. G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 38, 936-941 (2006).
- Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P. Tissue-specific regulation of chromatin insulator function. PLoS Genet. 8, e1003069 (2012).
- King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner. J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Roberts, D. B., Standen, G. N. The elements of Drosophila biology and genetics. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. , Oxford University Press. Oxford. 1-53 (1998).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: The laboratory setup. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development. PLOS Genet. 13, e1004971 (2015).
- Zhang, S. D., Odenwald, W. F. Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).
- Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA. 21, 375-384 (2015).
- Moshkovich, N., Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLOS Genet. 12, e1000880 (2010).
- Drosophila RNAi Screening Center [Internet]. , Available from: http://www.flyrnai.org/DRSC-PRC.html (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).
