This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Evnen til at kombinere genetiske og biokemiske metoder har gjort Drosophila en særlig egnet organisme til biokemi og molekylær biologi undersøgelser 1-3. Disse undersøgelser kræver ofte store mængder af biologisk materiale, ikke kun fra voksne fluer, men også fra larver 4, pupper 5 og embryoner 6-8. For at opnå store mængder af materiale, forskere har dyrket fluer ved hjælp af store containere kendt som flyve "population bure". Disse bure består af en cylinder fremstillet af plast dækket af et net på begge sider til indføring af fødevarer inde i buret uden fluerne slipper ud. Disse bure kan være hjemmelavet 9-11 eller købt fra et selskab (se tabel specifikke materialer / udstyr).
En stor fordel ved at anvende dette system til at vokse stort antal fluer er, at den cyklus af bananfluen 12 kan styres på en måde, alle fluerne udvikle sig i en relatively synkroniseret måde. Denne synkronisering opnås ved at pode nye embryoner, fodring larver / fluer og ofre de voksne fluer på præcise tidspunkter. Ved hjælp af en synkroniseret flue befolkning er særlig anvendelig til udviklingsmæssige undersøgelser 13.
Starten på en ny befolkning bur fra et par fluer er en tidskrævende proces, der kræver mange cyklusser af forstærkning 9-11. Selv bruger større beholdere som flue kultur flasker eller minicages, kan hele processen vare i måneder. For at undgå denne tidskrævende trin, mange Drosophila laboratorier jævnligt opretholde sådanne bure. Det er mest praktisk at starte et nyt bur starter fra et foster samling fra en allerede etableret befolkning bur. Generelt de fleste laboratorier opretholde vildtype population bure, såsom Oregon R eller Canton S. manuskript indeholder en detaljeret protokol til at opretholde flyve population bure.
Startende med 1,5 g materiale man kan få et udbytte af opsamlede embryoner mellem 7 og 13 g per cyklus. For at få en sådan mængde materiale er det afgørende at fastholde de rette dyrkningsbetingelser for alle faser af fluen cyklus.
De vigtigste parametre er temperatur og fugtighed, som bør være 24 ºC og 35%. Hvis disse to parametre ikke kan holdes konstant i den normale miljø i laboratoriet, vil en mulighed være at placere fluen buret i en inkubator eller en miljømæssig kammer. Andre protokoller anbefaler 70% fugtighed og også en konstant 24 timers lys-mørke-cyklus for at forøge udbyttet af de producerede æg 9,10. Men at holde luftfugtigheden omkring 35% undgår bakteriel forurening, og da formålet med denne protokol er kun opretholdelsen af en befolkning bur, er fluerne opbevares i normalt lys miljø i laboratoriet.
Et andet vigtigt punkt er at holde disturbances til voksne fluer så lavt som muligt. Det kan være tilrådeligt at holde buret på et sted adskilt fra flyve plads til at undgå krydskontaminering fra andre fluer.
Dyrkningen af store populationer af transgene og mutant fluer kan ikke anbefales, da det er meget vanskeligt at opretholde deres renhed og de kan udvise markant abnorm parring adfærd i store befolkningsgrupper bure 14.
Et muligt problem, mens dyrkning Drosophila i store mængder, er tilstedeværelsen af andre organismer såsom mider og / eller skimmel, som vil konkurrere om mad og derfor reducere udbyttet af producerede æg. For at undgå dette, er det meget vigtigt at holde alt det udstyr rent, vaske buret, net og flyve kasser med vand og sæbe, og kassere den disponible materiale (skum propper) efter hver cyklus. For at reducere Skimmelsvamp vokser, er propionsyre og fosforsyre tilføjet i den våde gær ved udarbejdelsen fluen mad i trin1.2 og Tegosept ved udarbejdelsen melassen bakke i trin 3.1. Det er nogle gange praktisk at placere materialer såsom plast kasse eller sigter på -20 ˚C når tiden er kort og materialer kan ikke rengøres med det samme.
En hel samling cyklus forekommer i 14 – 15 dage, begyndende når embryonerne podes i fluen boksen og slutter med den sidste samling dage. I løbet af denne periode, anbefales det at organisere en tidsplan for at huske alle de nødvendige skridt til at opretholde en population flue bur (fig. 2), detaljerede i protokollen sektion. Fra den dag, at æggene podes, indtil de voksne fluer dukke, er det blot nødvendigt at inspicere plastkasse, og når pupation tilfælde at placere dem inde i buret. Efter dette, fluerne skal fodret hver 2 – 3 dage, indtil embryoner podes til en ny cyklus. I hele protokollen, den længste dag er under indsamling og såning af embryonerne for at starte en ny cyklus. ENs kommenteret i protokollen, den bedste æg udbyttet er 3 – 5 dage efter voksen eclosion, og endelig falder 2 dage senere. Dette giver os en vis fleksibilitet for at vælge, hvor høsten af æggene vil blive udført.
Hvis udbyttet af opsamlede embryoner eller anden grund, er mindre end den ønskede grundbeløb (1,5 g), man altid kan tilføje en ny melasse bakke og indsamle flere æg den næste dag. For konstante samlinger, anbefales det at opretholde 2 bure i parallel, og hvis der kræves større mængder af embryoner, er det også muligt at anvende større bure. Ved at gøre korte tid samlinger, en måde at forøge udbyttet er at drage fordel af æglægning burst om morgenen.
Der er mange fordele ved at indsamle store mængder af forskellige udviklingsstadier. For eksempel har indsamlet embryoner fra populations bure blevet anvendt med stor succes i immunopræcipitationsanalyser 6-8, masse Collection af larver væv fra dissocierede larver har vist sig at være en meget god kilde til 3C eksperimenter 4 og RNA-præparater 15, og hoveder fra voksne fluer er blevet brugt til CHIP eksperimenter 16. Desuden er voksne ofte behov for at gøre flyve ekstrakter til vævsdyrkning 17.
Et af de mest lovende anvendelser af buret er at tilvejebringe materiale til high-throughput assays, der tillader analyse og screening af gener, transkripter, proteiner og metabolitter som reaktion på eksponering af patogener, biologiske molekyler, kemiske stoffer og ioniserende stråling. I disse store analyser kræves et stort antal individer, og fluen befolkning buret beskrevet her kan være meget nyttigt for at få store mængder af materiale i de forskellige faser af Drosophila livscyklus for deres analyse og screening 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |