Introduction
היכולת לשלב גישות גנטיות ביוכימיים הפכה תסיסנית אורגניזם מתאים במיוחד ללימודי ביולוגיה ביוכימיה מולקולרית 1-3. מחקרים אלו לעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של חומר ביולוגי, לא רק זבובים בוגרים, אלא גם מן הזחלים 4, גלמים 5 ועובר 6-8. כדי להשיג כמויות גדולות של חומר, יש חוקרים זבובים בתרבית באמצעות מיכלים גדולים המכונים לעוף "כלובי אוכלוסייה". כלובים אלה כוללים גליל עשוי פלסטיק מכוסה ברשת משני הצדדים כדי לאפשר כניסתה של המזון בתוך הכלוב ללא זבובים לברוח. כלובים אלה יכולים להיות תוצרת בית 9-11 או נרכש מחברה (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי).
היתרון העיקרי של השימוש במערכת זו לגדול במספרים גדולים של זבובים הוא כי מחזור של זבוב הפירות 12 ניתן לשלוט בצורה כל הזבובים להתפתח מחדשlatively מסונכרן באופן. סנכרון זו מושג על ידי זריעת עוברים חדשים, האכלת זחלים / זבובים להקריב את הזבובים הבוגרים בזמנים מדויקים. באמצעות אוכלוסיית זבובים מסונכרנת שימושי במיוחד עבור מחקרים התפתחותיים 13.
תחילת כלוב אוכלוסייה חדש בין כמה זבובים היא תהליך גוזל זמן מחייב מחזורים רבים של הגברת 9-11. אפילו באמצעות מכולות גדולות כמו בקבוקי תרבות זבוב או minicages, התהליך כולו יכול להימשך חודשים. כדי להימנע הפעם רב צעד, מעבדות תסיסנית רבות באופן קבוע לשמור כלובים כאלה. זה הכי נוח להתחיל כלוב חדש החל אוסף העובר מן כלוב אוכלוסייה כבר הוקם. באופן כללי, רוב מעבד לשמור כלובי אוכלוסיית wildtype, כגון אורגון R או קנטון ס כתב יד זה מציגה פרוטוקול מפורט לשמור כלובי אוכלוסיית זבובים.
Protocol
1. הפעלת המחזור: עובר מתזמן
הערה: המחזור מתחילה עם 1.5 גרם של חומר שנאסף (תערובת המורכבת של עוברים ו / או כמה זחלי instar ראשונים) מן המחזור הקודם. חומר זה יוצב במכל פלסטיק (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי) עם תערובת שמרים פעילה עד לשלב גלמים. המכל ייסגר לאחר כניסתה של התערובת הביולוגית של עוברים וזחלים עם המכסה כדי למנוע מאפשר הזחלים לברוח. זה הכרחי כדי לעשות חורים לתוך המכסה על מנת לאפשר זרימת אוויר. כדי להימנע מהצורך הזחלים בריחה דרך החורים, אטמי קצף משמשים. לבסוף, מומלץ ללבוש כפפות וחלוק מעבדה, לא רק בסעיף זה אלא גם בפרוטוקול כולו, כדי להימנע מקבלת בגדים מלוכלכים או מכתים עם אקונומיקה.
- הגדרה מיכל הפלסטיק.
- הפוך שלושה חורים רבועים עם סכין גילוח במכסה מיכל הפלסטיק שלpproximately 2.2 ס"מ. להוסיף קלטת (סרט תיוג 3/4 אינץ ') על ארבע כנפות כל חור כדי להבטיח התאמה הדוקה עבור אטמי קצף (50 x 55 מ"מ, DXL), ולאחר מכן למקם תקע קצף אחד בכל חור.
- מכסים את החלק הפנימי של מיכל פלסטיק בניילון נצמד. במהלך הסרט הזה, להוסיף שכבה של צמר גפן כדי לכסות את החלק התחתון של מיכל פלסטיק. לקרוע את הכותנה עם האצבעות.
- מכינים את האוכל זבוב.
- להוסיף 333 מ"ל מים ללא יונים בכוס 500 מ"ל. תוך ערבוב כוס עם פס מגנטי, להוסיף 167 μl של חומצה propionic ו 1.08 מ"ל של חומצה זרחתית, מן פתרונות מניות (99.96% ו -85%, בהתאמה).
- לאט לאט מוסיפים 77.5 גרם של שמרים יבשים פעילים, הימנעות גושים גדולים. לאחר המסת השמרים היבשים, להוסיף 38.8 גרם של סוכרוז.
הערה: סוכרוז צריך להיות המרכיב האחרון להתווסף כי מייד לאחר הוספת רכיב זה, תסיסה תתחיל.
- מיד לאחר המסת סוכרוז, יוצקים אתמזון על הכותנה, ולוודא כדי לכסות את הכותנה באופן שווה. סגור את מיכל פלסטיק עם מכסה כדי למנוע זבובים נמלט בתוך המעבדה לזהם את המזון.
- Resuspend 1.5 גרם של העוברים שנקטפו (לא dechorionated) מן המחזור הקודם עם 5 מ"ל של אתנול 70%. לחתוך לשניים שני ניירות לסנן ולהפיץ את התערובת הביולוגי באופן שווה על פני 4 חתיכות בעזרת מרית או העברה pipet עם קצה רחב (לחתוך במידת הצורך). הנח את ניירות לסנן על גבי צמר גפן טבול ולסגור את המכסה. לבסוף, דגירה מיכל הפלסטיק ב RT (24ºC) ולחות (35%) עד לשלב הגולם.
הערה: מיכל פלסטיק לא צריך להיות ממוקם בתא לח, אחרת זה יעודד את הצמיחה של חיידקים.
המשך 2. של המחזור: מעובר כדי זבובים.
הערה: חלק זה של המחזור נמשכת מן העוברים להציב מיכל הפלסטיק ביום 1 עד 9 ימים לאחר מכן כאשר הזבובים הבוגרים יצאומן הגלמים. במהלך 8 ימים אלה שום דבר לא צריך להיעשות אך ניטור כי עוברי להתקדם כראוי לשלבים הבאים של מחזור החיים תסיסנית עד eclosion. אם הזחלים מתחילים למות ולהפוך שחור במהלך פרק זמן זה, כי אטמי קצף אינם צמודים מדי וכי אוורור נאות מסופק. תקופה זו היא זמן טוב לנקות את הכלוב אוכלוסיית הזבובים מן המחזור הקודם.
- שימו את העוברים להפוך -1 instar זחלים סביב 24 שעות לאחר הנקבה הבוגרת הפקידה אותן לתוך אוכל זבוב (ראה שלב 3). הזחלים שיבקעו יאכילו ממזון הזבוב המוכן בשלב 1 במהלך 4 ימים, גדל שרת פעמים ל -2 nd ו -3 rd instar זחלים.
- נקה את הכלוב אוכלוסיית הזבובים.
- מניחים את הכלוב ב 4 ºC למשך 30 דקות לפחות להאט את הפעילות של זבובים. הסר את הרשת כי היא מכסה את צידו האחד של הכלוב, ובתנועה מהירה, מכסה את הצד הפתוח עם פלסטיק Biohazard גדולתיק. שופך את תכולת הכלוב לתוך השקית.
- עם שקית Biohazard עדיין מכסה את צידו האחד של הכלוב, מקם את הכלוב אנכי מעל כיור עם צד שקית Biohazard למטה. מוציאים בזהירות את שקית ניילון כדי למנוע זבובים לברוח וזורקים אותו במיכל פסולת Biohazard.
- בזהירות לפתוח את הרשת העליונה מספיק כדי ליצור חור קטן, יש לשטוף את פנים הכלוב עם מים, אשר יהיה לשטוף את הזבובים לתוך הכיור. לאט להגדיל את גודל החור ולחסל את כל הזבובים בתוך הכלוב.
- נקה את הכלוב הוא רשתות עם מים וסבון. בעוד הרשתות עדיין רטובות לאבטח אותם משני צידי הכלוב הנקי והיבש, ולבסוף מכניס נייר שתיין מעבדה, אשר ימנע את סרט הפלסטיק מוכן בשלב 1.1.2 יידבקו לכלוב. עכשיו הכלוב מוכן למחזור הבא.
- ארבעה ימים לאחר ההתקנה הראשונית, להתבונן pupate הזחלים. הזחלים יישארו בשלב זה עבור 4 ימים נוספים.
ציינתיuring בשלב זה הגלמים יכסו את שטח הכותנה כולו בתוך מיכל הפלסטיק. - בשלב הגלמים ולפני הזבובים הראשונים להגיח, לפתוח את מכל הפלסטיק והניח סרט הפלסטיק המכיל כותנה עם כל הגלמים על נייר שתיין מעבדה בתוך כלוב האוכלוסייה הנקי. סגור את נטו בקשר כפול ולנקות את מיכל פלסטיק המכסה למחזור הבא.
הערה: הגלמים מודבקים המכסה אמורים להיות מושלכים ונהרסו על ידי מעוקר או הקפאה לפני eclosion.
למבוגרים 3. זבובים.
ההערה: לאחר 4 הימים של הגולם לביים הזבובים הראשונים יצאו מן הגלמים. בתוך 24 - 48 שעות כל הזבובים צריכים eclosed. בחלק זה של המחזור, חשוב לספק להם מזון במטרה ליצור את הסביבה המתאימה עבור רבייה.
- הכן את המגשים מולסה.
- מערבבים בבקבוק L 1 556.25 מ"ל של deionized H 2 O, 90 מ"ל של מולסה, ו -22 גרם של אגר. החיטוי עם בר ומערבבים במשך 30 דקות, מגניב ולהוסיף 9.25 מ"ל של 10% Tegosept ב 95% EtOH.
- יוצקים את התערובת לתוך מגש הבשר של 21 x 14.5 ס"מ. ודא שעוצמת הקול הוא מספיק כדי לכסות 15 - 17 מגשים. מתן 10 - 20 דקות כדי לחזק ולכסות כל מגש עם סרט פלסטיק כדי למנוע התייבשות. צלוחיות כמה 1 L ניתן להכין בו זמנית. אחסן את מגשי מולסה ב 4 ºC עטוף בניילון עד לרגע השימוש.
- הוסף מגש מולסה מכוסה שמרים רטובים בתוך כלוב עם זבובים בוגרים.
- לפני הוספת הצלחת, מניח את הכלוב ב 4 ºC בחדר הקר למשך 30 דקות.
- הוסף 200 מ"ל של deionized H 2 O לתוך מבחנה ולאט לאט לשפוך שמרים יבשים תוך ערבוב בכף. פסק הוספה שמרים יבש כאשר התערובת הופכת כ העקביות של חמאת בוטנים כדי למנוע זבובים להיתקע לתוך האוכל.
הערה: חשובה לא לאפשר פתרון המזון כדי לחזק אחר זה יהיה קשה מאוד כדי לכסותהמולסה המגש ולחלץ את הביצים תוך כדי תהליך הקצירה (ראה סעיף 4.3). - הסר את הסרט הפלסטי ממגש אחד מהוולס ולכסות אותו עם שכבה של השמרים הרטובים המוכנים הטריים בעזרת כף או מרית. הקפד כי השטח כולו מכוסה.
- בעוד הכלוב הוא עדיין בחדר הקר, לפתוח את הרשת ובזהירות להוסיף במגש מולסה עם שמרים רטובים לתוך הכלוב. סגור את הרשת ואת מקום הכלוב ב RT.
הערה: זה עשוי להיות שימושי כדי לכסות את הצלחת עם מגש בשר ריק במהלך החדרה, אבל להיות בטוח שלא לחסום את הגישה של הזבובים למגש מולסה.
- שנה את צלחת האוכל כל 24 - 48 שעות כדי למנוע את השמרים כדי לקבל יבש מדי. זבובים בוגרים רגישים מאוד התייבשות.
4. סיום המחזור: קציר עובר
הערה: פוריות לטוס הטובה ביותר היא 3 - 5 ימים לאחר eclosion. לכן, קציר בתקופה זו יקבל את התשואה העוברת הטובה ביותר. אחרי אוספים רצויים הם משלימיםטד, המחזור נגמר. הזבובים צריכים להיות מוקרבים ואת הכלוב לנקות כפי שצוין בשלב 2.2.
- בדרך כלל, 2 ימים לאחר eclosion זבוב ולהנהגה מולסה חדש מגש עם אוכל רטוב טרי לתוך הכלוב, כמוסבר בסעיף 3.2.5. כדי להגדיל את התשואה של בתצהיר ביצים, בעזרת האצבעות, להפוך את פני השטח של השמרים הרטובים כבלתי רגילים ככל האפשר. אם מגש אוכל ישן נמצא בכלוב, לפני הוספת הצלחת החדשה, בזהירות להסיר אותו וזורק אותו לתוך שקית Biohazard. עצה נוספת להגדלת הכמות היא להסיר את שכבת הכותנה כך כל הביצים תונחנה במזון. לשמור על הכלוב ב RT.
- שימו את העוברים כנקודות לבנות קטנות.
הערה: הביצים מוכנות להיאסף. עבור תחזוקה שוטפת של כלוב הזבוב, אוסף יום 2 הוא הזמן המומלץ. אוסף זה יכיל בעיקר עובר כמה זחלי instar st 1. ראה תוצאות נציגי תשואות טיפוסיות של עוברים שנקטפו עבור Colle השונהמועדים לפי שעון ction. - קציר את העוברים
- מניח את הכלוב בחדר הקר במשך כ -30 דקות. בינתיים מכינים את מיכל הפלסטיק למזון זבוב למחזור הבא כמוסבר בסעיף 1.
- בשנת מגש החיטוי 8 L להוסיף מים ¼ של הקיבולת הכוללת ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 10% Triton X-100. בעוד הכלוב בחדר הקר להסיר את הצלחת מולסה בזהירות ומניח אותו בתוך שקית Biohazard.
- הסר את המגש מהשקית ותציף אותה במהירות (כדי למנוע זבובים לברוח) בפתרון דטרגנט במגש החיטוי. סגור את שקית Biohazard ולשים במיכל Biohazard. זבובים לא לטבוע במים שאינו מכיל חומר ניקוי.
- שימוש במכחול גדול אקדח מים מזוקקים לשטוף עוברים ושמרים הנחה של מולסה. בטל צלחות מולסה לתוך תיבת Biohazard.
- יוצקי פתרון בקפידה באמצעות מערכת שלוש מסננת (גס 30 מסנן על גבי, 40 באמצע ו -100 על התחתונה). גושים לשטוף on ברמה העליונה עם אקדח מים מזוקקים עד גושים לא להישאר.
הערה: מבוגר זבובים 3 rd instar הזחלים יישמרו ב -30 מסננת.- יש לשטוף את המגש החיטוי במים מזוקקים ושופכים את מי השטיפה דרך מסננות. סור תהליך מסנן וחזרו עליון אם גושים שמר להישאר. רוב -1 וכל הזחלים 2 nd instar יישארו המסננת 40.
- הסר את המסננת השנייה. החומר צהבהב המסננת השלישית (התחתונה) הוא תערובת של עוברים הזחלים instar -1 קטן. השתמש באקדח מים מזוקקים כדי להעביר את כל הביצים בצד אחד של המסננת. אסוף אותם עם מרית ולשקול אותם.
- במהלך המחזורים הללו התשואה האוספת של עוברים / זחלים נעים בין 7 ל -13 גרם. השתמש רק 1.5 גרם של חומר זה כדי להתחיל מחזור חדש (סעיף 1). השתמש שאר עוברי לעיבוד נוסף או יכול להיות מושלך.
.5 בהמשךמעבד
הערה: עוברים לא מנוצל להמשך האוכלוסייה ניתן להשתמש מיד לניסויים או לחילופין אפשר להקפיא ב -80 ºC. בשתי האפשרויות, את העוברים ייתכן שיהיה צורך dechorionated הראשון.
- לקבלת dechorionation, לשטוף את העוברים למשך 2 דקות בתמיסה אקונומיקה 50% ולשטוף היטב במים מזוקקים.
- כדי להקפיא את העוברים, ראשון יבש על ידי לחיצה בתוקף עם מגבת נייר, ולאחר מכן לשקול ומניח אותם, בעזרת מרית, לתוך צינור חרוטי 15 או 50 מיליליטר. לבסוף להטביע את צינור החרוטים ב N הנוזל 2 למשך מספר שניות.
Representative Results
החזקת אוכלוסיית כלוב זבוב מבוססת על מחזור חי זבוב. לכן, לאחר הצבת התערובת ביולוגית הראשונית של עוברים וזחלים במכל הפלסטיק (איור 1 א) הביצים המופרות תהפוכנה זחלים לא יותר מ -2 ימי הזחלים יגדלו במשך 4 ימים, יחסית מסונכרנים דרך שלבי זחלי instar השונים ( ראה איור 1B).
לאחר הזחלים סיימו את שלב instar 3 rd הזחל הם pupate ולכסות את פני השטח של כותנה בתוך מיכל פלסטיק עם כמה על פני השטח הפנימי של המכסה (איור 1 ג). תקופת התגלמות זה ילך 4 הימים הבאים, עד שהזבובים לסיים את תהליך המטמורפוזה. בתקופה זו מומלץ מאוד להעביר את הזבובים לתוך הכלוב. הזבובים הבוגרים הראשונים יתחילו eclose ביום 9 - 10 לאחרייזום של המחזור (האיור 1D) ולפי יום 11 כולם יהיה צמח מתוך הגלמים.
התשואה הטובה ביותר של האוסף עובר מתקבלת 3 - 5 ימים לאחר eclosion (יום 13 עד 15) ולבסוף ירידות יום 17 (7 ימים לאחר eclosion). לכן, מומלץ להוסיף במגש האחרון של מזון טרי ביום 13 ולאסוף את הביצים על יום 15 (איור 1E ו- F). זה יאפשר אוסף של המספר המרבי של עוברים. הוספה יום נוסף שלישי לפני האיסוף עלול לגרום האוכל להיות יבש מדי וכתוצאה מכך תקטן התשואה של עוברים שנאספו. לוח 1 מציג את התשואה של 6 קולקציות מחזור ברציפות, עם חומר מוצא של 1.5 גרם בכל מחזור, ואיור 2 הוא פי לוח הזמנים המומלץ עבור אוסף המחזור כולו.
החומר שנקטף 2 יום60; תקופות מורכבות בעיקר של עוברים. עם זאת מספר קטן של זחלים הם גם בהווה. למטרות תחזוקה כלוב הזחלים הללו אינם מהווים בעיה, שכן חלק מידת asynchronicity צפוי. אף על פי כן במשך כמה ניסויים ביוכימיה, הטוהר עובר אלה חשוב מאוד, אבל באותו הזמן היא גם צורך לאסוף כמויות גדולות של ביצים כדי לבצע את הניסויים האלה. מסיבה זו כמה אוספים רצופים קצרים בוצעו 1 שעה ו 3 שעות, לאחר ההוספה במהירות ב RT צלחת חדשה עם אוכל, כדי לספק הערכה של התשואה והטוהרת שניתן להשיג בשיטה זו (לוח 2 ואיור 3) . 1 אוספי hr הרצופים התחילו עם תשואה נמוכה מאוד (14.5 מ"ג) אבל אז הכמויות של העוברי מוגבר בכל פעם שנאספה אבל בפעם האחרונה. התשואה הנמוכה בהתחלה יכולה להיות בגלל הזבובים להיות לחוצים במהלך התהליך של שינוי המזון אך מאוחר יותר להתאקלם. מצד שני, לא Larvae נצפה חמשת האוספים הרציפים (איור 3 א), מראה כי אוספים קצרים להניב טוהר גבוה. אם הכותנה לא יוסרה מהכלוב, הסבירות כי זחלי מנקודות קודם לכן זמן תישאר ולהיכנס אל הלוח הטרי הוא גדל. גם כאשר הכותנה מוסרת, בזמני זחלים ינדדו בצד הכלוב ולהיכנס המזון במהלך אוסף.
עבור האוספים ברציפות 3 שעות, התשואה נעה בין 840 כדי 1250 מ"ג, הנמצא כ 10 פעמים יותר מאשר התשואות שהושגו אוספי hr 1. הטוהר עובר אלה היה קרוב ל- 100% (איור 3 ב). זחלים מזדמנים נצפו. כמה מחקרים התפתחותיים דורשים סינכרון מאוד קפדן כלפי העובר שנאסף. כדי להגדיל את טוהר הסנכרון, מומלץ להשליך את צלחת האוסף הראשונה כי אם תנאים אינם אידיאליים, נקבות יכולות לשמור ביציות בשלות יותר להפקיד אתמ כאשר שישתפרו תנאים, כגון עם כניסתה של צלחת טריה. כמו כן חשוב לדעת כי זבובים מבוגרים (> 6 ימים) מייצרים פחות עוברים מסונכרן. כדי לאמת את מידת סנכרון עם דיוק גבוה, מכתים DAPI של העוברים שנאספו מומלץ.
איור 1. מעגל החיים תסיסנית בכלוב אוכלוסיית הזבובים. (א) ייזום של מחזור זריעה 1.5 גרם של עוברי לתוך המיכל קופסת פלסטיק. כהפניה, בלוח התחתון, אורכו של נייר הסינון הוא 8.5 ס"מ. (ב) זחלים הם מתרבים מסונכרנים יחסית 5 ימים לאחר תחילת המחזור. (ג) באותו יום 8, רוב הזבובים נמצאים בשלב הגולם. הפנלים התחתונים בסי (ב ') ו- C (ג ') הוא בהגדלה של אזורים המצוין לוחות העליונים. (ד) זבובים בוגרים הגיחו הגלמים 10 ימים לאחר תחילת מחזור. (E) מבוגר זבובים בתוך כלוב האוכלוסייה לפני התחלת התהליך של איסוף עובר, ביום 15. החומר הצהבהב על האוכל לטוס הם ביצים מופרות. (F) עובר (וכמה זחלים) שנאספו בתחתית המסננת 100 גס, לאחר מחזור כלוב כולו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. לוח זמני אוסף מחזור שלם. איור 2 מציג את לוח הזמנים המומלצים עבור אוסף מחזור שלם. t = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. טוהר 1 שעה ו 3 שעות אוספים רצופים. תמונת נציג העוברת שנאסף 1 שע '(א) ו -3 שעות (ב') לאחר הוספת מגש חדש של מזון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מספר מחזור | תשואה (ז) |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 9.5 |
| 3 | 10.3 |
| 4 | 12.7 |
| 5 | 10 |
| 6 | 7.1 |
| אוסף # | אורך של אוסף (HR) | תשואה (מ"ג) |
| 1 | 1 | 14.5 |
| 2 | 1 | 21.6 |
| 3 | 1 | 56.1 |
| 4 | 1 | 160.1 |
| 5 | 1 | 106.1 |
| 1 | 3 | 960 |
| 2 | 3 | 840 |
| 3 | 3 | 1250 |
טבלה 2. תשואה של 1 שעה ו 3 שעות אוספת ברציפות. לוח 2 מציג את התשואה של 5 אוספים ברציפות 1 שעות לאחר הוספת מזון חדש 3 קולקציות ברציפות 3 שעות לאחר הצבת צלחת מולסה חדשה.
Discussion
החל עם 1.5 גרם של אחד חומר יכול להשיג תשואה של עוברים שנאספו בין 7 ו -13 גרם לכל מחזור. כדי להשיג סכום כזה של חומר זה הוא חיוני כדי לשמור על תנאי culturing התקינים לכל שלבי מחזור הזבוב.
הפרמטרים החשובים ביותר הם טמפרטורה ולחות, אשר אמור להיות 24 ºC ו -35% בהתאמה. אם שני פרמטרים אלה לא ניתן לקיים קבועים בסביבה הרגילה של המעבדה, אפשרות אחת תהיה להציב את הכלוב לטוס לתוך חממה או בתא סביבתי. פרוטוקולים אחרים ממליצים לחים 70% וגם מחזור אור חושך קבוע 24 שעות כדי להגדיל את התשואה של הביצים המיוצרות 9,10. עם זאת לשמור על הלחות סביב 35% ימנע זיהום חיידקים, ומאז מטרת פרוטוקול זה היא רק החזיק כלוב אוכלוסייה, הזבובים נשמרים בסביבה באור הרגילה של המעבדה.
נקודה חשובה נוספת היא לשמור disturbances למבוגר טס נמוך ככל האפשר. זה עשוי להיות כדאי לשמור על הכלוב במיקום נפרד מהחדר לטוס כדי למנוע זיהום צולב מפני זבובים אחרים.
Culturing של אוכלוסיות גדולות של מהונדס וזבובי מוטציה אינו מומלץ, שכן הוא מאוד קשה לשמור הטוהר שלהם והם יכולים להפגין התנהגות חיזור חריגה בולטת בכלובי אוכלוסייה גדולים 14.
אחת בעיות האפשר תוך culturing תסיסנית בכמויות גדולות הוא הנוכחות של אורגניזמים אחרים כמו קרדית ו / או עובש, אשר יתחרו על האוכל ועל כן להפחית את התשואה של ביצים מיוצרות. כדי למנוע זאת, חשוב מאוד לשמור את כל הציוד נקי, שטיפת הכלוב, רשתות ולעוף תיבות עם מים וסבון, ולהשאיר את החומר הפנוי (אטמי קצף) לאחר כל מחזור. כדי להקטין עובש גדל, propionic וחומצה זרחתית מתווספים לתוך שמרים רטובים בעת הכנת אוכל לטוס בשלב1.2 ו Tegosept בעת עריכת מולסה מגש בשלב 3.1. לפעמים זה מועיל חומרי מקום כמו קופסת פלסטיק או הנפות ב -20 C כאשר הזמן קצר וחומרים לא ניתן לנקות מיד.
מחזור אוסף שלם מתרחש ב -14 - 15 ימים, החל כאשר עובר הם זורעים לתוך התיבה לטוס וכלה היום האוסף האחרון. במהלך פרק זמן זה, מומלץ לארגן לוח זמנים על מנת לזכור את כל הצעדים הדרושים לשמירה על כלוב אוכלוסיית הזבובים (איור. 2), מפורטים בפרק פרוטוקול. מהיום שהביצים הם זורעים, עד זבובים בוגרים לצאת, יש צורך רק כדי לבדוק את קופסת פלסטיק, וכאשר התגלמות מתרחשת, כדי למקם אותם בתוך הכלוב. לאחר מכן, הזבובים צריכים להיות מוזנים כל 2 - 3 ימים עד עובר הם זורעים עבור מחזור חדש. בפרוטוקול כולו, היום הארוך ביותר הוא במהלך איסוף זריעה של עוברים החל מחזור חדש. אs הגיב בפרוטוקול, תשואת הביצה הטובה ביותר היא 3 - 5 ימים לאחר eclosion המבוגר, ולבסוף יורדת 2 ימים לאחר מכן. זה נותן לנו גמישות מסוימת כדי לבחור את היום שבו הקציר של הביצים יבוצע.
אם מסיבה כלשהי את התשואה של עוברים שנאספו היא פחות מהסכום החל הרצוי (1.5 גרם), תמיד אפשר להוסיף מגש מולסה חדש ולאסוף יותר ביצים למחרת. אוספים מתמיד, מומלץ לשמור על 2 כלובים במקביל, ואם כמויות גבוהות של עוברים נדרשים, הוא גם אפשרי להשתמש בכלובים גדולים. במקרה של עשיית אוספים זמן קצר, אחת הדרכים להגדיל את התשואה היא לנצל את פרץ ההטלה בבוקר.
ישנם יתרונות רבים של איסוף כמויות גדולות של שלבי התפתחות שונים. לדוגמה, עוברים שנאספו מהכלובים האוכלוסייה שימשו בהצלחה מאוד מבחני immunoprecipitation 6-8, collectio המוניתn של רקמות זחל זחלים ניתקים הוכיח להיות מקור טוב מאוד עבור 3C ניסויים 4 והכנות RNA 15, וראשים מ זבובים בוגרים כבר נוצל לניסויי שבב 16. בנוסף, מבוגרים בדרך כלל יש צורך להפוך תמציות לטוס עבור בתרבית רקמה 17.
אחד היישומים המבטיחים ביותר של הכלוב הוא לספק חומר עבור מבחני תפוקה גבוהה המאפשרים ניתוח והצגה של גנים, תעתיקים, חלבונים מטבוליטים בתגובה לחשיפת פתוגנים, מולקולות ביולוגיות, חומרים כימיים וקרינה מייננת. מבחני בקנה מידה גדול אלה מספר גדול של אנשים נדרשים, ואת הכלוב אוכלוסיית הזבובים המתואר כאן יכול להיות מועיל מאוד כדי להשיג כמויות גדולות של חומר במהלך השלבים השונים של מחזור החיים תסיסנית לניתוח שלהם ההקרנה 18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila. Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).
- Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 26, 148-159 (2013).
- Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen. Mol Cell. 8, 485-499 (2014).
- Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex. Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).
- Maksimenko, O. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99 (2015).
- Lei, E. P., Corces, V. G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 38, 936-941 (2006).
- Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P. Tissue-specific regulation of chromatin insulator function. PLoS Genet. 8, e1003069 (2012).
- King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner. J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Roberts, D. B., Standen, G. N. The elements of Drosophila biology and genetics. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. , Oxford University Press. Oxford. 1-53 (1998).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: The laboratory setup. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development. PLOS Genet. 13, e1004971 (2015).
- Zhang, S. D., Odenwald, W. F. Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).
- Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA. 21, 375-384 (2015).
- Moshkovich, N., Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLOS Genet. 12, e1000880 (2010).
- Drosophila RNAi Screening Center [Internet]. , Available from: http://www.flyrnai.org/DRSC-PRC.html (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).
