This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Evnen til å kombinere genetiske og biokjemiske metoder har gjort Drosophila et spesielt egnet organisme for biokjemi og molekylær biologi studier 1-3. Disse studiene krever ofte store mengder biologisk materiale, ikke bare fra voksne fluer, men også fra larver 4, puppe 5 og embryoer 6-8. For å få store mengder materiale, forskere har dyrket fluer ved hjelp av store beholdere som kalles fly "befolknings bur". Disse burene består av en sylinder laget av plast dekket av et nett på begge sider for å tillate innføring av mat inne i buret uten fluene rømmer. Disse burene kan være hjemmelaget 9-11 eller kjøpt fra et selskap (se tabell over spesifikke materialer / utstyr).
En stor fordel med å bruke dette systemet for å dyrke store antall fluer er at syklusen av bananflue 12 kan styres på en slik måte at alle fluene utvikle seg i en relatively synkronisert måte. Denne synkroniseringen er oppnådd ved såing nye embryo, fôring larver / fluer og ofre de voksne fluene på nøyaktige tider. Ved hjelp av en synkronisert fly befolkningen er spesielt nyttig for utviklingsstudier 13.
Starten på en ny populasjon bur fra noen fluer er en tidkrevende prosess som krever mange amplifikasjonssykluser 9-11. Selv ved bruk av større beholdere slik utlegger kulturflasker eller minicages, kan hele prosessen vare i måneder. For å unngå dette tidkrevende trinn, mange Drosophila laboratorier regelmessig vedlikeholde slike bur. Det er mest praktisk å starte et nytt bur fra et embryo samling fra en allerede etablert befolkning bur. Generelt, de fleste laboratorier opprettholde villtype befolknings bur, for eksempel Oregon R eller Canton S. Dette manuskriptet presenterer en detaljert protokoll for å opprettholde fly befolkningen bur.
Å starte med 1,5 g av materiale man kan oppnå et utbytte av innsamlet embryoer mellom 7 og 13 g per syklus. For å få en slik mengde materiale er det avgjørende å opprettholde de riktige dyrkingsforhold for alle stadier av fly syklus.
De viktigste parameterne er temperatur og fuktighet, som bør være henholdsvis 24 ° C og 35%. Hvis disse to parametrene ikke kan holdes konstant i det normale miljøet i laboratoriet, vil en mulighet være å plassere fly buret inn i en inkubator eller et miljøkammer. Andre protokoller anbefalt 70% fuktighet og også en konstant 24 timers lys-mørke-syklus for å øke utbyttet av de produserte egg 9,10. Imidlertid å holde luftfuktigheten rundt 35% unngår bakteriell forurensning, og siden hensikten med denne protokollen er bare å opprettholde en populasjon bur, blir fluene holdt i det normale lys miljøet i laboratoriet.
Et annet viktig poeng er å holde disturbances til den voksne flyr så lavt som mulig. Det kan være lurt å holde buret på et sted atskilt fra fly plass for å unngå smitte fra andre fluer.
Dyrkingen av store bestander av genmodifiserte og mutante fluer anbefales ikke, siden det er svært vanskelig å opprettholde sin renhet, og de kan vise uttalt unormal parring atferd i store befolknings bur 14.
Et mulig problem mens dyrkning av Drosophila i store mengder er nærværet av andre organismer som midd og / eller mugg, som vil konkurrere for mat og derfor reduserer utbyttet av produserte egg. For å unngå dette, er det svært viktig å holde alt utstyret rent, vaske buret, garn og fly bokser med vann og såpe, og forkaster disponibel materiale (skum plugger) etter hver syklus. For å redusere mold vokser, er propionsyre og fosforsyre lagt inn i den våte gjær når forberede flua mat i trinn1,2 og Tegosept ved utarbeidelsen av melasse skuffen i trinn 3.1. Det kan være nyttig å plassere materialer som plasteske eller sikter på -20 ˚C når tiden er kort og materialer kan ikke rengjøres med en gang.
En hel samling syklus oppstår i 14 – 15 dager, som begynner når embryoene blir sådd inn i flueboksen og slutter med den siste samlingen dagen. I løpet av denne perioden, er det anbefalt å organisere en tidsplan for å huske alle de nødvendige skritt for vedlikehold av en befolkning fly bur (fig. 2), detaljert i protokollen delen. Fra den dagen eggene er seeded, inntil de voksne fluene dukker opp, er det bare nødvendig å inspisere plastboks, og når pupation skjer, å plassere dem inne i buret. Etter at fluene må bli matet hver 2 – 3 dager til embryoer blir sådd ut for en ny syklus. I hele protokollen, er den lengste dag under innsamling og poding av embryoene for å starte en ny syklus. ENs kommenterte i protokollen, er den beste egg utbyttet 3 – 5 dager etter voksen eklosjonshormon, og til slutt synker 2 dager senere. Dette gir oss en viss fleksibilitet for å kunne velge den dagen hvor innhøstingen av eggene vil bli utført.
Hvis en eller annen grunn utbyttet av innsamlede embryoer er mindre enn den ønskede startbeløpet (1,5 g), en alltid kan legge til en ny melasse brett og samle flere egg neste dag. For konstant samlinger, er det anbefalt å opprettholde 2 merder i parallell, og hvis større mengder av embryoer er nødvendig, også er det mulig å anvende større merder. Ved å gjøre korte tids samlinger, en måte å øke utbyttet er å dra nytte av egg-legging burst i morgen.
Det er mange fordeler med å samle inn store mengder ulike utviklingsstadier. For eksempel har samlet embryoer fra befolknings bur blitt brukt med stor suksess i immunoutfellingsstudier analyser 6-8, masse collection av larver vev fra dissosierte larver har vist seg å være en svært god kilde for 3C eksperimenter 4 og RNA forberedelser 15, og hoder fra voksne fluer har blitt utnyttet for CHIP eksperimenter 16. I tillegg er voksne, ofte nødvendig for å gjøre flue ekstrakter for vevskultur 17.
En av de mest lovende anvendelser av buret er å tilveiebringe materiale for high-throughput analyser som tillater analyse og screening av gener, transkripter, proteiner og metabolitter i respons til eksponering for patogener, biologiske molekyler, kjemiske stoffer og ioniserende stråling. I disse store analyser stort antall individer er nødvendig, og flua befolkningen bur beskrevet her kan være svært nyttig for å få store mengder materiale i de ulike faser av Drosophila livssyklusen for deres analyse og screening 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |