This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Умение сочетать генетические и биохимические подходы сделало Drosophila особенно подходящий организм для биохимии и молекулярной биологии исследований 1-3. Эти исследования часто требуют большого количества биологического материала, а не только от взрослых мух, но и от личинок 4, 5 и куколок эмбрионов 6-8. Для получения больших количеств материала, исследователи культивируемых мух, используя большие контейнеры, известные как летают "клетей населения". Эти клетки состоят из цилиндра, изготовленного из пластика, покрытого сеткой с обеих сторон, чтобы обеспечить введение пищи внутри клетки без мух, вылетающих. Эти клетки могут быть домашние 9-11 или приобрести у компании (см таблицу конкретных материалов / оборудования).
Одним из основных преимуществ использования этой системы , чтобы вырастить большие количества мух является то , что цикл дрозофилы 12 может управляться таким образом , что все мухи развиваются в реlatively синхронизированным образом. Эта синхронизация достигается за счет засева новых эмбрионов, кормление личинок мух / и принесения в жертву взрослых мух в точные моменты времени. Использование синхронизированный муха населения особенно полезна для исследований в области развития 13.
Начало новой клетке населения от нескольких мух является трудоемкий процесс требует много циклов амплификации 9-11. Даже при использовании больших контейнеров, таких как бутылки муха культуры или minicages, весь процесс может длиться в течение нескольких месяцев. Чтобы избежать этого времени шаг потребляющего, многие лаборатории Drosophila регулярно поддерживать такие клетки. Наиболее удобно, чтобы начать новую клетку, начиная от сбора эмбрионов из уже установленной клетке населения. В целом, большинство лабораторий поддерживать клетки дикого типа населения, таких как Oregon R или Canton S. Эта рукопись представляет собой подробный протокол для поддержания мух клетей населения.
Начиная с 1,5 г материала, можно получить выход, собранных эмбрионов в период между 7 и 13 г за один цикл. Чтобы получить такое количество материала, что имеет решающее значение для поддержания правильных условий культивирования на всех этапах цикла лету.
Наиболее важными параметрами являются температура и влажность воздуха, которая должна быть 24 ° С и 35% соответственно. Если эти два параметра не может поддерживаться постоянной в нормальных условиях лаборатории, одним из возможных вариантов было бы поместить клетку мухи в инкубатор или климатическую камеру. Другие протоколы рекомендуют 70% влажности , а также постоянный 24 ч свет-темнота цикла , чтобы увеличить выход производимых яиц 9,10. Тем не менее сохраняя влажность около 35% предотвращает бактериальное загрязнение, и поскольку цель этого протокола является только содержание клетки населения, мухи находятся в нормальной освещенности лаборатории.
Другим важным моментом является то, чтобы держать диsturbances к взрослому летит как можно более низкой. Это может быть целесообразным, чтобы держать клетку в месте отдельно от зольной помещении, чтобы избежать перекрестного загрязнения от других мух.
Культивирование больших популяций трансгенных и мутантных мух не рекомендуется, так как очень трудно поддерживать чистоту и они могут проявлять выраженный ненормальное поведение сопрягаемую в крупных населенных клетках 14.
Одна из возможных проблем во время культивирования дрозофилы в больших количествах является наличие других организмов , таких как клещи и / или плесени, которые будут конкурировать за пищу и , следовательно , уменьшить выход производства яиц. Чтобы избежать этого, очень важно, чтобы все оборудование в чистоте, промывая клетки, сетки и летать коробки с водой и мылом, и отбрасывая одноразового использования материала (пены) пробки после каждого цикла. Для того, чтобы уменьшить плесени, пропионовую и фосфорную кислоту добавляют в мокрую дрожжей при приготовлении пищи летучую на этапе1.2 и Tegosept при подготовке патоку лотка на шаге 3.1. Иногда полезно размещать материалы, такие как пластиковой коробке или ситах в -20 ° С, когда мало времени и материалы не могут быть очищены сразу же.
Целый цикл коллекции происходит в течение 14 – 15 дней, начиная, когда эмбрионы высевают в коробку летучей и заканчивая последний день сбора. В течение этого периода времени, рекомендуется организовать расписание, чтобы запомнить все необходимые шаги для поддержания популяции мух клетки (рис. 2), подробно описаны в разделе протокола. Со дня, что яйца высевают, пока взрослые мухи не появляются, необходимо только, чтобы осмотреть пластмассовую коробку, а когда происходит окукливание, чтобы поместить их в клетке. После этого мух должны быть поданы через каждые 2 – 3 дней до тех пор, пока зародыши высевают для нового цикла. В целом по протоколу, самый длинный день во время сбора и обсеменения эмбрионов для начала нового цикла.ы прокомментировал в протоколе, лучший выход яиц на 3 – 5 дней после вылупления взрослой особи, и, наконец, снижается через 2 дня. Это дает нам некоторую гибкость, чтобы выбрать день, в котором будет выполняться урожай яиц.
Если по какой-либо причине выход собранных эмбрионов меньше желаемого исходного количества (1,5 г), всегда можно добавить новый патоки лоток и собирать больше яиц на следующий день. Для постоянных коллекций, рекомендуется поддерживать 2 клетей параллельно, а если более высокие количества эмбрионов необходимы, также можно использовать более крупные клетки. В случае делать короткие коллекции времени, один из способов повышения урожайности является воспользоваться яйцекладки взрыв утром.
Есть много преимуществ сбора большого количества различных стадий развития. Например, собранные эмбрионы из клеток населения были очень успешно используются в иммунопреципитации 6-8, масса Collectioп личиночных тканей из диссоциированного личинок показал, что является очень хорошим источником для 3C экспериментов 4 и препаратов РНК 15, и головы от взрослых мух были использованы для ChIP экспериментов 16. Кроме того, взрослые часто необходимы , чтобы сделать муху экстракты для тканевой культуры 17.
Одним из наиболее перспективных применений клетки является создание материала для высокой пропускной анализов, которые позволяют анализировать и скрининг генов, транскриптов, белков и метаболитов в ответ на воздействия патогенов, биологических молекул, химических веществ и ионизирующего излучения. В этих крупномасштабных анализах большое число людей требуется, и клетка муха населения описанная здесь может быть очень полезным для того , чтобы получить большие количества материала на различных этапах жизненного цикла дрозофилы для их анализа и скрининга 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |