This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
La capacidad de combinar los enfoques genéticos y bioquímicos ha hecho Drosophila un organismo especialmente adecuado para bioquímica y biología molecular estudios 1-3. Estos estudios a menudo requieren grandes cantidades de material biológico, no sólo de las moscas adultas, sino también de las larvas de 4, 5 y pupas embriones 6-8. Para obtener grandes cantidades de material, los investigadores tienen moscas cultivadas utilizando grandes contenedores conocidos como volar "jaulas de población". Estas jaulas consisten en un cilindro de plástico cubierto por una red en ambos lados para permitir la introducción de los alimentos dentro de la jaula sin las moscas escapen. Estas jaulas pueden ser hechos en casa 9-11 o comprado a una empresa (véase la tabla de materiales específicos / equipo).
Una ventaja principal de utilizar este sistema para crecer un gran número de moscas es que el ciclo de la mosca de la fruta 12 se puede controlar de una manera que todas las moscas se desarrollan en un relativamente sincronizado manera. Esta sincronización se logra mediante la siembra de nuevos embriones, la alimentación de larvas / moscas y sacrificando las moscas adultas en los momentos precisos. Utilizando una población de moscas sincronizada es particularmente útil para los estudios de desarrollo 13.
El inicio de una nueva jaula población de unas cuantas moscas es un proceso que consume tiempo que requiere muchos ciclos de amplificación 9-11. Incluso el uso de contenedores más grandes, como botellas de cultivo mosca o minicages, todo el proceso puede durar meses. Para evitar este paso mucho tiempo, muchos laboratorios de Drosophila mantienen regularmente este tipo de jaulas. Es más conveniente para iniciar una nueva jaula a partir de una recogida de embriones a partir de una jaula de población ya establecida. En general, la mayoría de los laboratorios mantienen jaulas de población de tipo salvaje, como Oregon R o S. Cantón Este manuscrito presenta un protocolo detallado para mantener las jaulas de la población de moscas.
A partir de 1,5 g de un material se puede obtener un rendimiento de embriones recogidos entre 7 y 13 g por ciclo. Para obtener una cantidad de material tal que es crucial para mantener las condiciones de cultivo adecuadas para todas las etapas del ciclo de marcha.
Los parámetros más importantes son la temperatura y la humedad, que debe ser 24 ºC y 35%, respectivamente. Si estos dos parámetros no pueden mantenerse constantes en el ambiente normal del laboratorio, una posibilidad sería colocar la jaula mosca en una incubadora o en una cámara ambiental. Otros protocolos recomiendan 70% de humedad y también un ciclo de luz-oscuridad de 24 horas constante para aumentar el rendimiento de los huevos producidos 9,10. Sin embargo manteniendo la humedad alrededor de 35% evita la contaminación bacteriana, y ya que el propósito de este protocolo es sólo el mantenimiento de una jaula de población, las moscas se mantiene en el entorno de luz normal del laboratorio.
Otro punto importante es mantener disturbances al moscas adultas lo más bajo posible. Puede ser aconsejable mantener la jaula en un lugar separado de la sala de marcha para evitar la contaminación cruzada de otras moscas.
No se recomienda el cultivo de grandes poblaciones de transgénicos y moscas mutantes, ya que es muy difícil de mantener su pureza y pueden exhibir comportamiento de apareamiento anormal pronunciado en grandes jaulas de población 14.
Un posible problema mientras que el cultivo de Drosophila en grandes cantidades es la presencia de otros organismos como los ácaros y / o molde, que competirán por la comida y por lo tanto reducen el rendimiento de los huevos producidos. Para evitar esto, es muy importante mantener todo el equipo limpio, lavado de la jaula, redes y volar cajas con agua y jabón, y descartando el material desechable (tapones de espuma) después de cada ciclo. Para reducir el moho que crece, propiónico y ácido fosfórico se añaden a la levadura húmeda en la preparación de la comida en el paso de la mosca1.2 y Tegosept en la preparación de la melaza bandeja en el paso 3.1. A veces es útil para colocar materiales como el plástico o caja de tamices de -20 ° C cuando el tiempo es corto y materiales no se puede limpiar de forma inmediata.
Un ciclo de recogida de todo se produce en 14 – 15 días, comenzando cuando los embriones se sembraron en la caja de la mosca y terminando con el último día de recogida. Durante este periodo de tiempo, se recomienda organizar un horario con el fin de recordar todos los pasos necesarios para el mantenimiento de una jaula mosca población (Fig. 2), detallados en la sección de protocolo. Desde el día que los huevos se siembran, hasta que las moscas adultas emergen, es necesario solamente para inspeccionar la caja de plástico, y cuando se produce la fase de pupa, para colocarlos dentro de la jaula. Después de eso, las moscas tienen que ser alimentados cada 2 – 3 días hasta que los embriones se sembraron para un nuevo ciclo. En todo el protocolo, el día más largo es durante la recolección y la siembra de los embriones para iniciar un nuevo ciclo. UNs comentado en el protocolo, el mejor rendimiento de huevo es de 3 – 5 días después de la eclosión de adultos, y finalmente declina 2 días más tarde. Esto nos da una cierta flexibilidad con el fin de elegir el día en el que se llevará a cabo la cosecha de los huevos.
Si por alguna razón el rendimiento de los embriones es menor que la cantidad inicial deseado (1,5 g), siempre se puede añadir una nueva bandeja de melaza y recoger más huevos al día siguiente. Para las colecciones constantes, se recomienda mantener 2 jaulas en paralelo, y si se requieren mayores cantidades de embriones, también se es posible utilizar jaulas más grandes. En caso de hacer colecciones de tiempo cortos, una manera de aumentar el rendimiento es tomar ventaja de la ráfaga de la puesta de huevos por la mañana.
Hay muchas ventajas de la recogida de grandes cantidades de diversas etapas de desarrollo. Por ejemplo, los embriones obtenidos de las jaulas de población se han utilizado con mucho éxito en los ensayos de inmunoprecipitación 6-8, Collectio de masasn de los tejidos de las larvas de larvas disociada ha demostrado ser una muy buena fuente de 3C experimentos 4 y 15 preparaciones de ARN, y las cabezas de moscas adultas han sido utilizados para experimentos chip 16. Además, los adultos a menudo son necesarios para hacer extractos de moscas para el cultivo de tejidos 17.
Una de las aplicaciones más prometedoras de la jaula es proporcionar material para ensayos de alto rendimiento que permiten el análisis y la detección de genes, transcripciones, proteínas y metabolitos en respuesta a la exposición de los patógenos, moléculas biológicas, sustancias químicas y la radiación ionizante. En estos ensayos a gran escala se requieren grandes cantidades de individuos, y la jaula población de moscas se describe aquí pueden ser muy útiles con el fin de obtener grandes cantidades de material durante las diferentes fases del ciclo de vida de Drosophila para su análisis y detección 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |