This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Genetik ve biyokimyasal yaklaşımlar birleştirme yeteneği Drosophila biyokimya ve moleküler biyoloji çalışmaları 1-3 için özellikle uygun bir organizma yapmıştır. Bu çalışmalar genellikle erişkin sinek, aynı zamanda larva 4, pupa 5 ve embriyolar 6-8 değil sadece biyolojik materyalin büyük miktarlarda gerektirir. büyük miktarlarda ham materyal elde etmek için, araştırmacılar "nüfus kafesleri" sinek olarak bilinen büyük kaplar kullanılarak kültürlü sinekler var. Bu kafesler kaçan sinekler olmayan kafes içinde gıda maddenin arzı için her iki tarafta bir ağ kapsamındaki plastik bir silindirden oluşmaktadır. Bu kafesler 9-11 ev yapımı ya da (özel malzemeler / ekipman tabloya bakınız) bir şirketten satın olabilir.
Sinekler sayıda büyümesi için bu sistemi kullanan bir büyük avantajı, meyve döngüsü 12, tüm sineklerin yeniden geliştirmek şekilde kontrol edilebilir hedefi olduğunulatively şekilde senkronize. Bu senkronizasyon, yeni embriyolar ekim larva / sinekler beslenme ve hassas zamanlarda yetişkin sinekler feda ederek elde edilir. Senkronize bir uçucu popülasyonu kullanılarak gelişim çalışmalarında 13 için özellikle yararlıdır.
Birkaç sinekler yeni bir nüfus kafesinin başlangıç amplifikasyonu 9-11 birçok döngülerini gerektiren zaman alıcı bir süreçtir. Hatta sinek kültür şişeleri veya minicages gibi büyük kaplar kullanılarak, tüm süreç aylarca sürebilir. Adım tüketen bu kez önlemek için, birçok Drosophila laboratuarlar düzenli tür kafesleri korumak. Zaten kurulmuş nüfus kafesinden bir embriyo toplama başlayan yeni kafes başlamak için en uygun olduğunu. Genel olarak, çoğu laboratuarları Bu makale sinek nüfus kafesleri korumak için ayrıntılı bir protokol sunar gibi Oregon R veya Canton S. olarak wild tip nüfus kafesleri, korumak.
Malzeme bir 1.5 g başlayarak döngü başına 7 ile 13 g arasında toplanan embriyolar bir verim elde edebilir. materyal Böyle bir miktarda almak için uçucu döngüsünün tüm aşamaları için doğru kültür koşulları sağlamak için çok önemlidir.
en önemli parametreler sırasıyla 24 ºC ve% 35 olmalıdır sıcaklık ve nem vardır. bu iki parametre laboratuar normal bir ortamda sabit tutulması mümkün değilse, bir olasılık, bir inkübatör veya bir çevre odasına sinek kafesi yerleştirmek olacaktır. Diğer protokoller üretilen yumurta 9,10 verimini artırmak için% 70 nem ve aynı zamanda sabit bir 24 saat aydınlık-karanlık döngüsü önerilir. Ancak% 35 civarında nem tutma bakteri kontaminasyonu önler ve bu protokolün amacı, nüfus kafesin sadece bakım olduğundan, sinekler laboratuar normal ışık ortamında tutulur.
Bir diğer önemli nokta di tutmaktıryetişkin sturbances mümkün olduğunca düşük uçar. Diğer sinekler çapraz bulaşmayı önlemek için sinek odasından ayrı bir yere kafesi tutmak için tavsiye edilebilir.
Onların saflığını korumak ve büyük nüfus kafeslerde 14 belirgin anormal çiftleşme davranışı sergileyebilir çok zor olduğundan transgenik ve mutant sinekler büyük popülasyonlarının kültür, tavsiye edilmez.
Olası bir sorun büyük miktarlarda Drosophila kültür gıda için rekabet edebilir ve dolayısıyla üretilen yumurta verimi azaltacak akarları ve / veya küf gibi diğer organizmalar, varlığıdır. Bunu önlemek için, o temiz, tüm ekipman tutmak kafesi, ağlar yıkama su ve sabunla ve her döngüden sonra atılabilir malzeme (köpük fişler) atarak kutuları uçmak için çok önemlidir. adımda sinek yiyecek hazırlarken büyüyen kalıp azaltmak için, propiyonik ve fosforik asit ıslak maya ilave edilirpekmez hazırlanması 1.2 ve Tegosept adım 3.1 tepsi. zaman kısa ve malzemeler hemen temizlenmelidir olamaz zaman böyle -20 ˚C plastik kutu veya elek gibi bir yerde malzemelere bazen yararlı olabilir.
Embriyolar sinek kutunun içine ekilmiş ve son toplama gününde biten zaman başlayan, 15 gün – Bütün bir koleksiyon döngüsü 14 oluşur. Bu süre boyunca, protokol bölümünde ayrıntılı bir nüfus sinek kafes bakımı (Şek. 2) için gerekli tüm adımları, hatırlamak için bir program düzenlemek için tavsiye edilir. yetişkin sinekler ortaya kadar yumurta, numaralı seribaşı olduğu günden itibaren, sadece plastik kutu incelemek için gerekli olan ve pupa devresi oluştuğunda, kafesin içine yerleştirmek için. Embriyolar, yeni bir çevrim için tohumlanmıştır kadar 3 gün – Daha sonra sinekler her 2 beslenmeleri gerekmektedir. Bütün protokolde, en uzun gün yeni bir döngü başlatmak için embriyoların toplama ve tohumlama sırasında. bir5 gün yetişkin eclosion sonra ve nihayet 2 gün sonra azalır – protokolde yorumladı s, en iyi yumurta verimi 3'tür. Bu yumurtaların hasat yapılacak olan güne seçmek için bize bazı esneklik verir.
Herhangi bir nedenle toplanan embriyoların verimi arzu edilen çıkış miktarı (1.5 g) daha az olması durumunda, tek bir zaman yeni bir pekmez tepsi ekleme ve daha fazla yumurta ertesi gün toplayabilir. Sabit koleksiyonları için, paralel 2 kafesleri korumak için tavsiye edilir, ve embriyoların yüksek miktarlarda gerekiyorsa, aynı zamanda büyük kafesleri kullanmak mümkündür edilir. Kısa süre koleksiyonları yapmanın durumunda, verimi artırmak için tek yönlü sabah yumurtlama patlama yararlanmak etmektir.
Çeşitli gelişim evreleri büyük miktarlarda toplanması pek çok avantajı vardır. Örneğin, nüfusun kafesleri toplanan embriyolar immüno-çökeltme tahlilleri 6-8 kütle collectio çok başarılı bir şekilde kullanılmıştırayrışmış larvaları larva dokuların N 3C deney 4 ve RNA preparatları 15 için çok iyi bir kaynağı olduğu göstermiştir, ve yetişkin sinek kafaları ChIP deneyler 16 kullanılmıştır. Buna ek olarak, yetişkinler genellikle doku kültürü 17 için sinek özleri yapmak için ihtiyaç vardır.
kafesin en umut verici uygulamalardan biri patojenlerin biyolojik moleküller, kimyasal maddeler ve iyonizan radyasyon maruz kalmaya yanıt olarak genler, transkript, proteinler ve Metabolitlerin analiz ve tarama izin yüksek verimli deneyleri için bir materyal sunmaktır. Bu büyük ölçekli deneylerde bireylerin çok sayıda gereklidir, ve burada açıklanan sinek nüfus kafes onların analiz ve 18 taranması için Drosophila yaşam döngüsünün farklı aşamalarında malzemenin büyük miktarlarda elde etmek için çok yararlı olabilir.
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |