Exon skipping er i øjeblikket en mest lovende behandlingsmulighed for Duchennes muskeldystrofi (DMD). For at udvide anvendeligheden for DMD patienter og optimere stabiliteten / funktion af de resulterende trunkerede dystrofin proteiner, blev en multi-exon springe tilgang med cocktail antisense oligonukleotider udviklet og vi viste systemisk dystrofin redning i en hund model.
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en af de mest almindelige dødelige genetiske sygdomme verden over, som skyldes mutationer i dystrofin (DMD) genet. Exon skipping beskæftiger kort DNA / RNA-lignende molekyler kaldet antisense oligonukleotider (AONs), der genopretter læsning ramme og producerer kortere, men funktionelle proteiner. Imidlertid exon skipping terapi står over for to store forhindringer: begrænset anvendelighed (op til kun 13% af patienterne kan behandles med en enkelt AON lægemiddel) og usikker funktion af trunkerede proteiner. Disse spørgsmål blev behandlet med en cocktail AON tilgang. Mens ca. 70% af DMD patienter kan behandles ved en enkelt exon skipping (alle exoner kombineret), kunne man potentiel behandling mere end 90% af DMD patienter, hvis multiple exon skipping hjælp cocktail antisenselægemidler kan realiseres. Hunde X-bundet muskeldystrofi (CXMD) hundemodel, hvis fænotype er mere ligner humane DMD patienter, blev anvendt til at teste den systemiske effekACY og sikkerheden af multi-exon skipping af exon 6 og 8. CXMD hundemodel huser et splejsningssted mutation i intron 6, som fører til en mangel på exon 7 i dystrofin mRNA. For at gendanne læseramme CXMD kræver multi-exon skipping af exon 6 og 8; Derfor CXMD er en god mellemstor dyremodel til test af effekten og sikkerheden af multi-exon skipping. I den aktuelle undersøgelse blev en cocktail af antisense morpholinos målrettet exon 6 og exon 8 konstrueret og det gendannede dystrofinekspression i kroppen hele skeletmuskulatur. Metoder til transfektion / injektion af cocktail oligoer og evaluering af effekten og sikkerheden af multi-exon skipping i CXMD hund model præsenteres.
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en X-linked recessive muskel lidelse karakteriseret ved fremadskridende muskelsvaghed, først beskrevet af Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD er en almindelig genetisk sygdom, der påvirker omkring 1 i 3500 drenge i hele verden, med cirka 20.000 berørte børn født hvert år 2,3. Motoriske udvikling er forsinket, og gangforstyrrelser ses i den tidlige barndom 4, efterfulgt af afhængighed kørestol ved om de tidlige teenageår. Døden opstår typisk i alderen mellem 20 og 30 på grund af respiratorisk eller hjertesvigt 5-8. Der er i øjeblikket ingen helbredelse for DMD. Behandling med glukokortikoider kan bremse udviklingen af muskeldegeneration til en vis grad, men er forbundet med betydelige bivirkninger, herunder fedme og diabetes mellitus 2,7,8. DMD skyldes mutationer i dystrofin (DMD) genet, hvilket fører til et tab af funktionel dystrofin Protein. DMD er en meget stor gen med over 2 millioner basepar og 79 exons 9,10. Sletning, nonsense, og dobbeltarbejde mutationer, der fører til out-of-frame mutationer er den mest almindelige årsag til DMD fænotype. Regionerne exonerne 3 – 9 og exon 45 – 55 betegnes "mutation hotspots" som de fleste patienter har deletionsmutationer inden for disse dele af genet, hvilket fører til ikke-funktionelle dystrofin i DMD patienter 3,9,11-16. Dystrofin funktioner i dystrofin-glycoprotein-kompleks (DGC), som har en afgørende rolle i stabilisering muskel membran. Den N- og C-termini er de vigtigste områder for funktion, mens den centrale stang domænet spiller en mindre vigtig rolle 3,9,17. Overholdelsen af en mild fænotype forbundet med Becker muskeldystrofi (BMD), som for det meste skyldes i-frame mutationer i DMD-genet, inspireret anvendelse af exon springe til behandling af DMD. BMD patienter har en forkortet, men functional, dystrophinprotein, der fastholder begge termini 3,6,18. Exon skipping, i teorien, kan gendanne læserammen, hvilket resulterer i forkortede-men-funktionelle dystrofin proteiner ligner dem, der ses i BMD 3,19.
Flere typer af antisense oligonukleotider (AONs) er blevet afprøvet i kliniske forsøg, herunder 2'O-methylerede phosphorthioater (2'OMePS) og phosphordiamidat morpholino oligomerer (PMOS). Skipping exon 51 og 53 ved hjælp af disse AONs er blevet undersøgt, og mens resultaterne er lovende, er single-exon skipping begrænset anvendelighed, da det er mutationsspecifikke 3, 19, 20,21, 22-26. Spørgsmål også fortsat om stabiliteten af de resulterende forkortede dystrofin proteiner fremstillet af single-exon springe 22,23. Derudover nogle patienter kræver mere end en enkelt exon, der skal springes over for at genoprette læserammen 3. Mens teknisk vanskeligere, multi-exon skipping er en metode, derkunne løse disse problemer 3,19. Multi-exon skipping er tidligere blevet påvist i dystrofisk hund og humane cellelinier in vitro. Derudover har mdx52 mus og hunde X-bundet muskeldystrofi (CXMD) Hund modeller blevet anvendt til undersøgelser in vivo 22, 24-27. Canine X-bundet muskeldystrofi Japan (CXMD J) beagler blev anvendt her, som læserammen for CXMD J kan genoprettes ved multi-exon skipping af exon 6 og 8, eller yderligere exoner (f.eks exonerne 3 – 9) (fig 1). Beagle-baserede CXMD deler den samme mutation mønster som Golden Retriever muskelsvind (GRMD) model, men beagles er mindre og billigere at vedligeholde på grund af deres krop størrelse, hvilket giver en nyttig model for DMD 28,29. CXMD hunde mere nøje efterligner den menneskelige DMD fænotype end mindre dyremodeller, ligesom gnaver, og er mere pålidelige for toksikologiske vurderinger 3,22,30,31 </sop> (Figur 2). CXMD hunde vise progressiv muskel forfald, gangforstyrrelser, og hjerte- og åndedrætsproblemer ligner dem, der ses i DMD. Sammenlignet med single-exon skipping, multi-exon skipping er gældende for en meget større andel af patienterne. Blandt de tre mest almindelige mutation typer (deletioner, nonsens, og dobbeltarbejde), 80 – kunne 98% af patienterne behandles gennem multi-exon skipping 14,32,33, mens 45% af alle DMD patienter kunne drage fordel af specifikt springer exons 45 – 55 3,19,22,34.
Med udviklingen af modificerede morpholinos, har effektiviteten af AON cocktails på at lette exon springe forbedret. Arginin-rige celle-gennemtrængende peptid-konjugeret projektstyringskontorer (PPMOs), og vivo-morpholinoer (vPMOs) er AON kemier, der har væsentligt forbedrede celle-gennemtrængende evne og stabilitet 3,35-38. Bekymringer forblive om langsigtet AON toksicitet; dog betydelige fremskridtDer er gjort. Kemiske foretaget morpholinoer ændringer i høj grad falde off-target effekter og prækliniske studier har rapporteret om signifikante toksiske virkninger 3,22,39,40. En tilbageværende udfordring for multi-exon skipping er det nuværende krav for hver enkelt AON skal testes for toksicitet alene, som et enkelt lægemiddel, i stedet for sammen som en cocktail 3,19,22,41,42. I DMD undersøgelser med både single og multi-exon Skipping målrettet til hjertet, har der været lidt forbedring i dystrofisk hjerte væv. Effekten af morpholinos i hjertet menes at være lav på grund af dårlig celle-gennemtrængende evne. Peptid-konjugerede PPMOs har forbedret evne AONs at trænge ind hjerteceller, forøgelse af mængden af funktionelle dystrophinprotein reddet i hjertet 3,19,38.
Her er vores AON cocktail tilgang drøftet indgående, herunder design af AON sekvenser ved hjælp ESEfinder software 43. Protocoler til hund eksperimenter med multi-exon skipping er også beskrevet. CXMD J beagler blev anvendt til exon 6 og 8 springer eksperimenter. Multi-exon springe i CXMD hund model viser lovende resultater, men udfordringer, der skal overvindes, før de er klinisk relevant.
Exon skipping er en lovende terapeutisk teknik til behandling af DMD. Både in vitro og in vivo forsøg har vist, at multi-exon skipping er mulig. Her er anvendelsen af CXMD hundemodel diskuteret. Først blev AONs designet Brug af Rescue-ESE og ESEfinder programmer til at målrette dystrofin exon 6 – 8. 2'OMePS AON kemi blev brugt til CXMD myoblast transfektion og morpholino AON backbone kemi blev valgt til in vivo eksperimenter. vPMOs er mere effektive end umodificerede projektstyringskontorer men på grund af deres højere toksicitet, de er ikke egnede til systemiske injektioner. RNA-ekstraktion, RT-PCR, og cDNA-sekventering blev udført på de CXMD myoblaster. Hunde injiceret med PMO cocktail var klinisk gradueret til at vurdere enhver forbedring i kliniske symptomer. Efter hundene blev humant aflivet, blev muskel udtaget og forberedt til cryo-sektionering. Halveringstiden af dystrophinprotein induceret af AONS menes at være ca. 1 – 2 ud måneder. Unge voksne hunde blev anvendt i denne undersøgelse, selvom der kan gøres disse forsøg med neonatale hunde og ældre hunde (> 5 år). Tilberedte muskel snit blev anvendt til at evaluere histopatologi og vurdere dystrophinprotein redning gennem Western blotting og immunhistokemi 48.
Det er vigtigt at sikre, at volumenet af PMO opløsningen er korrekt, før injektioner; ikke at gøre dette, vil få væsentlig indvirkning på resultaterne. Under intramuskulære injektioner, er tilstrækkeligt tryk, der kræves for at komme ind muskelfibrene. Overvågning af hundens sundhed og inspektion af operationsstedet er vigtige for fejlfinding. For at overvåge dyrs sundhed, bør der udføres ugentlige blodprøver og vejning. Efter euthanization af dyret og forberedelse af muskel prøver, et afgørende skridt for at sikre følsomhed i detektering dystrophinprotein er at bruge både Tris-acetat gel og halvtør blotting metodeunder Western blotting-procedure.
Som vist i de repræsentative resultater, myoblaster behandlet med Ex6A, Ex6B, Ex8A, og cocktail (indeholdende Ex6A, Ex6B, Ex8A, og Ex8B) fremstillet i ramme DMD produkter. Da Ex8B produceret ingen exon-sprunget over produkter, blev det ikke brugt i efterfølgende in vivo forsøg. cDNA-sekventering viste, at exonerne 6-9 skipping opstod og immuncytokemi med DYS-2-farvning viste restaureret dystrofinekspression i behandlede prøver. AON-behandlede hunde udviste en signifikant stigning i dystrofin-positive fibre. Dette indikerer, at exonerne 6 – 8 blev blive sprunget over og et afkortet protein blev produceret. Mængden af dystrofin-positive fibre øges, når anvendtes en cocktail af AONs og var proportional med AON dosering. Immunoblots viste øget dystrofinekspression i systemiske morpholino-behandlede hunde. Skeletal muscle havde variable niveauer af dystrofin fibre; imidlertid viste lidt morpholino-behandlede hjertevævforbedring i dystrofinekspression. Da dystrofin har en høj molekylvægt (427 kDa), kan påvisning af små mængder dystrofin være vanskelig. For de bedste resultater, blev Tris-acetat-gel og halvtørre overførselsmetode anvendes. HE farvning viste forbedret histopatologi i morpholino-behandlede hunde. Centralt-kerneholdige fibre (CNFs) er et tegn på usund muskler og repræsenterer cykler af muskel degeneration og regeneration. Morpholino-behandlede CXMD hunde viste et fald i procentdelen af CNFs i sammenligning med ikke-behandlede CXMD hunde. Klinisk grading afslørede en forbedring af symptomer, såsom øget gang og løb evne, i morpholino-behandlede dyr. Hårdheden af muskler menes at afspejle muskelatrofi, blev således indgår i vurderingen skema 59. Hårdheden af låret (hind-lemmer) muskler blev evalueret; Men vi udelukkede craniale Sartorius muskler fordi de har tendens til at udvise hypertrofi stedet atrofi i CXMD. Behandlede hunde visered lavere klassificering scoringer og havde hurtigere tider på 15 m kører test. Forbedrede gange på 15 m testen indikerer forbedret muskelfunktion 40. Højere samlet klassificering score indikerer dårligt helbred og øget muskel atrofi.
Mens disse resultater er lovende, multi-exon skipping præsenterer stadig mange udfordringer, der skal overvindes, før teknikken har klinisk anvendelighed. Cardiac væv viser stadig reduceret optagelse af AONs, sandsynligvis på grund af forskellen i cellulær handel mellem hjerte- og knoglevæv. Ingen toksiske virkninger er blevet observeret hos dyr under de nuværende doseringsregimer; dog brug for mere arbejde, der skal gøres for at vurdere langtidstoksicitet før brugen af AON cocktails kan flytte til kliniske forsøg. Det er svært at få godkendelse til AON cocktail narkotika, fordi reguleringsorganer definere hver AON sekvens som et unikt lægemiddel. Dette betyder, at hver sekvens i en cocktail skulle være individuelt testet for safety, hvilket kræver mere tid og flere penge. En anden hindring for anvendelsen af multi-exon skipping i et klinisk miljø er en stor mængde mellemprodukter proteinprodukter fremstillet med ukendte funktioner. Disse proteiner kan potentielt føre til uforudsigelige bivirkninger, afhængigt af den enkelte mutation 22. Derudover mutation mønstre tilgængelige inden for de nuværende dystrofiske hund modeller er begrænset. Der er få naturligt forekommende mutationer, og ikke alle mutationer er nyttige til at studere multi-exon skipping. Den dystrofisk grisemodel lover at være et godt alternativ for fremtiden DMD exon skipping studier 33, 34.
DMD hund modeller har nogle fordele frem for andre DMD modeller. At være en større dyremodel, klinisk sortering og MR er mulige, giver mulighed for en mere detaljeret analyse. Da hunde er store dyr er de også mere egnet til toksikologiske undersøgelser og tættere repræsenterer den humane sygdom i forhold til musemodel. Hund models har også DMD gensekvenser, der er mere ligner mennesker 23, 34, 45.
Selvom teknisk udfordrende, kunne multi-exon skipping tilgang i sidste ende gavne> 90% af DMD patienter 24. Dette gør det en langt bedre alternativ til single-exon skipping, som single-exon skipping gælder kun en lille delmængde af patienterne. Desuden vil flere exon springe muligt for os at vælge de sletning mønstre, der optimerer funktionaliteten af de forkortede dystrofin proteiner. For eksempel, sletning af DMD exon 45-55 er forbundet med usædvanligt milde symptomer eller asymptomatisk individer 14,19,60-63. Den multi-exon skipping af exon 45 – 55 er allerede blevet påvist i en musemodel for DMD med en exon 52 deletion (mdx52) under anvendelse af systemiske injektioner af vPMOs 22,26. Anvendelsen af cocktail vPMOs er også blevet påvist i andre former for muskeldystrofi, såsomsom Fukuyama medfødt muskelsvind (FCMD). FCMD skyldes exonindfangning, hvori aberrerende mRNA splejsning er forårsaget af retrotransposon insertion. vPMOs er blevet vist at redde splejsningsmønster i både en FCMD musemodel og i humane cellelinier 64. Næste generation AON kemier udviser højere effektivitet og lavere toksicitet ville lette en effektiv oversættelse af multi-exon skipping tilgang til klinisk anvendelse. Derudover kunne multi-exon skipping potentielt anvendes på andre genetiske sygdomme, såsom dysferlinopathies 24, 65.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse’s Journey – The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children’s Health Research Institute (WCHRI).
2'OMePS Transfection of Dog Myoblasts | |||
3ml 6 welled plates | IWAKI | 5816-006 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.01 | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | 200 U/mL |
Lipofectin | Invitrogen | 18292-011 | Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin. 10 mL lipofectin for 5 mg RNA. |
2’OMePS | Eurogentec | Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC). | |
Horse Serum | Gibco | 16050-114 | 2% |
streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 200 ug/mL |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Insulin | |||
Morpholino transfection of dog myoblasts | |||
All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts for culturing | |||
Antisense morpholinos | Gene-tools |
Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC |
|
Endo-Porter | Gene-tools | ||
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Invitrogen | 15596-018 | 1mL/plate |
RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) | |||
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Invitrogen | 15596-018 | 1mL/plate |
Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | 200 uL |
1.5 ml Tubes | Eppendorf | 22363204 | |
Centrifudge | Beckman-Coulter | ||
75% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | |
UV Spectrometer | |||
Forward primer in exon 5 | Invitrogen | CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA 1.5 mL 10 mM |
|
Reverse primer in exon 10 | Invitrogen | TGCTTCGGTCTCTGTCAATG 1.5 L 10 mM |
|
dNTPS | Clontech | 3040 | |
One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
Thermo-cycler | Scinco | ||
Complementary DNA (cDNA) Sequencing | |||
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Centrifudge | |||
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337454 | |
Intramuscular injections or open muscle biopsy | |||
Surgical Tools | Scissors, Scapal, needle, surgical thread | ||
Vet Ointment | |||
Iodophors | webtextiles | 12190-71-5 | |
chlorohexidine | Peridex | 12134 | |
Surgical Drapes | |||
Srubs | |||
Facial Mask | |||
Surgical Gloves | |||
Head Covering | |||
Thiopental sodium | Mitsubishi Tanabe Pharma | 20 mg/kg | |
Isoflurane | Abbott laboratories | 05260-05 | 2-3% |
Antisense morpholinos | Gene-tools | Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT), Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC) Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media. 120–200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline |
|
27G Needles | TERUMO | SG3-2325 | |
50 mL syringe | TERUMO | SG2-03L2225 | |
buprenorphine hydrochloride | |||
Tougne Depressor | |||
cephalexin | 15 to 30 mg/kg | ||
cefazolin | 15 to 30 mg/kg | ||
buprenorphine | 0.01 mg/kg | ||
buprenorphine hydrochloride | 0.02 mg/kg | ||
Systemic Injections | |||
Syringe infusion pump | Muromachi | ||
22G Indwelling needles | TERUMO | SG3-2225 | |
27G Needles | TERUMO | SG3-2325 | |
50 mL syringe | TERUMO | SG2-03L2225 | |
Saline | Ohtsuka-Pharmaceutical | 28372 | |
Clinical Grading of Dogs | |||
Video Camera | |||
Stop watch | |||
Magnetic resonance imaging (MRI) | |||
3 Tesla MRI l | |||
18 cm diameter/18 cm length human extremity coi | |||
Muscle sampling and preparation (necropsy) | |||
Thiopental sodium | Mitsubishi Tanabe Pharma | 20 mg/kg | |
Isoflurane | Abbott laboratories | 05260-05 | 2-3% |
Tragacanth gum | 10-20 mL | ||
Liqoud Nitrogrn | |||
Cork Discs | Iwai-kagaku | 101412-806 | |
Dry Ice | |||
Tweezers | |||
Poly-l-lysine–coated slides | Fisher | 22-037-216 | |
Cryostat Microsystem | Leica | cm1900 | |
Immunohistochemistry | |||
DYS1 | Novocastra | NCL-DYS1 | 1:150 dilutions |
DYS2 | Novocastra | NCL-DYS2 | 1:150 dilutions |
Alexa 594 goat antimouse IgG1 | Invitrogen | A-21125 | 1:2,500 dilutions |
Alexa 594 goat antimouse IgG2 | Invitrogen | A-11005 | 1:2,500 dilutions |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Contans mounting agent |
Goat Serum | Invitrogen | 10000C | 15% |
PBS | |||
Moisture chamber | Scientific Devise Laboratory | 197-BL | |
Chamber slide | Lab-tek | 154453 | |
Cover Glasses | Fisher | 12-540A | |
Hydrophobic barrier pen | |||
Flpurescent microcope | 594 nm at 20X magnification. | ||
Western Blotting | |||
Distillied Water | |||
Hand Homogenizer | |||
2× Laemmli SDS-loading buffer | 0.1 M Tris–HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue | ||
SDS gels | Bio-Rad | 161-1210 | 5% resolving |
SDS gels | Invitrogen | Invitrogen, WG1601BOX | 3-8% |
PVDF membrane | GE | 10600021 | |
Methanol | |||
Transfer buffer (10×) | 250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine | ||
Transfer buffer (1×) | 10% 10× buffer, 20% methanol | ||
0.05% PBS/Tween 20 (PBST) | 2,000 mL 3× 200 mL for washing |
||
PBST/5% milk powder | 100 mL | ||
Protein Assay Kit | BCA | T9650 | |
Tween 20 | Sigma | P5927 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Tris-Acetate | Sigma | ||
Tris HCL | Sigma | T3253 | |
Glycerol | Sigma | G8773 | |
Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
NaCl | Sigma | S3014 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
Cathode Buffer | .025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20 % Methanol | ||
desmin antibody | Abcam | ab8592 | |
DYS1 | Novocastra | NCL-DYS1 | 1:150 dilutions |
Image J Software |