Introduction
Anche se lo scambio genetico tra due cellule è l'evento centrale nella riproduzione sessuale, si basa su una catena di eventi che promuovono la differenziazione cellulare, permettono di scelta del partner, svolgono la fusione cellula-cellula e mantenere la stabilità genomica. Così il ciclo di vita sessuale si presenta come un sistema modello per studiare una serie di questioni biologiche riguardanti gli interruttori di sviluppo, risposta a stimoli estrinseci, fusione della membrana plasmatica, la segregazione dei cromosomi, ecc Esplorando il lievito di fissione ciclo sessuale di studiare questi fenomeni porta i vantaggi della genetica potenti del sistema modello, ben stabiliti approcci high-throughput e sofisticato microscopio. Sex in fissione lievito è un evento heterotypic tra una P-cellulare e una M-cellula tipi di accoppiamento distinti. I due tipi di cellule in modo differenziale esprimono un numero di geni 1,2, compresi quelli per la produzione del P secreto e M-feromoni, feromone-recettori map3 e MAM2 così come feromone-proteases Sxa1 e Sxa2. Ceppi Homothallic, come il ceppo H90 comunemente usato, trasportano le informazioni genetiche per entrambi i tipi di accoppiamento in un singolo genoma e cellule subiscono un complesso schema di commutazione tipo di accoppiamento nell'intero ciclo mitotico (valutata in Rif. 3). Molteplici isolati di heterothallic lievito di fissione che cambiano raramente o mai il tipo di accoppiamento sono comunemente utilizzati 4, il più prominente H + N (P-type) e h -S (tipo M) ceppi.
Nel lievito di fissione, l'ingresso nel ciclo di vita sessuale è sotto stretta regolamentazione nutrizionale. Solo le cellule di lievito di fissione azoto-fame arrestano riproduzione mitotico e producono feromoni diffusibili per segnalare la presenza di un partner di accoppiamento e promuovere ulteriori fasi del ciclo sessuale (rivisto in Rif. 5). Azoto privazione de-reprime il regolatore trascrizionale chiave di accoppiamento Ste11 che agisce come un interruttore di sviluppo e promuove eXpression di accoppiamento specifici geni tra cui il recettore feromone e il feromone geni di produzione 6,7. Impegno feromone-recettore attiva la proteina recettore accoppiato G-alfa ed a valle di segnalazione MAPK che migliora ulteriormente Ste11 attività trascrizionale 8-10, aumentando così la produzione di feromoni in un feedback positivo tra i partner di accoppiamento. Livelli di feromone sono cruciali per indurre diversi stati di polarizzazione delle cellule regolando l'organizzatore maestro di polarità delle cellule, la Rho-famiglia GTPasi Cdc42 11. Dopo l'esposizione a basse concentrazioni di feromoni, attiva Cdc42 viene visualizzato nella patch dinamici esplorare la periferia cellulare, e nessuna crescita cellulare si osserva in questa fase. I livelli aumentati di feromoni promuovere la stabilizzazione dell'attività Cdc42 ad una singola zona e la crescita di una proiezione polarizzata, chiamata shmoo, che porta le cellule socio a contatto. Successivamente, i due partner di accoppiamento aploidi si fondono per formare uno zigote diploide. Un recente lavoro rivela °e esistenza di una struttura actina nuova essenziale per la fusione che è assemblato dal formin accoppiamento indotta Fus1 12. Questa focalizzazione fusione concentra tipo V miosina processi dipendenti e posiziona il macchinario degrado parete cellulare, permettendo così rimodellamento della parete cellulare per consentire il contatto membrana plasmatica senza lisi cellulare 12. Al momento della fusione cellula-cellula, i nuclei vengono a contatto e sottoposti cariogamia. Un importante dynein-dipendente movimento avanti e indietro del nucleo all'interno della zigote (il movimento coda di cavallo) promuove quindi l'abbinamento di omologhi cromosomi 13,14, che è seguito da meiosi. Infine, i quattro prodotti della meiosi sono confezionati in singole spore durante sporulazione.
A causa della sua complessità e le numerose fasi, monitoraggio dettagliato di accoppiamento è stato impegnativo. Due difficoltà notevoli sono che l'intero processo richiede ben oltre quindici ore e che le cellule sono difficili da sincronizzare. questi difficulties sono aggirate da approcci di microscopia unicellulari. Qui un protocollo generale per indagare il ciclo di vita sessuale di lievito di fissione è presentato. Con piccoli aggiustamenti, questo protocollo permette lo studio di tutte le varie fasi del processo, vale a dire l'induzione di accoppiamento prodotto del gene, la polarizzazione delle cellule e abbinamento tra sorelle cellule dopo il passaggio da tipo di accoppiamento e tra i partner non-sorella, la fusione cellula-cellula, e post-fusione coda di cavallo il movimento, la meiosi e sporulazione. Questo metodo permette di 1) facilmente visualizzare fluorescently tag proteine nel corso del tempo pre, durante e post-fusione; 2) discriminare il comportamento delle cellule di tipo opposto accoppiamento; e 3) misura e quantificare parametri come shmooing, l'accoppiamento, la fusione o l'efficienza sporulazione.
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Protocol
Analisi al microscopio di lievito di fissione riproduzione sessuale
1. Carta Preparazione
- Preparare terreno minimo sporulazione (MSL-N) 15 mescolando i seguenti componenti: Glucosio: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl 0,1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Aggiungere Oligoelementi (10.000X): 100 l / L, vitamine (1,000x): 1 ml / L, e 0,1 M CaCl 2 ml / L. Filtro-sterilizzare utilizzando un formato di filtro 0,22 micron pori e conservare a temperatura ambiente (RT).
- Utilizza il seguente Vitamine (1,000x) stock: pantotenato: 1 g / L, acido nicotinico: 10 g / L, inositolo: 10 g / L, biotina: 10 mg / l. Filtro-sterilizzare utilizzando un formato di filtro 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C.
- Utilizzare i seguenti oligoelementi (10.000X) stock: Acido borico: 5 g / L, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / l , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / L, CuSO 4· 5H 2 O: 0,4 g / L, acido citrico: 10 g / L. Filtro-sterilizzare utilizzando un formato di filtro 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C.
- Preparare MSL-N agarosio 2% (usato per fare camere pad agarosio) combinando 10 ml di MSL-N con 0,2 g di agarosio. Melt per ~ 2 minuti ad alta potenza in un forno a microonde fino a quando si scioglie agarosio e aliquote da 0,5 ml in tubi microcentrifuga. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare terreno minimo sporulazione con azoto (MSL + N) da MSL-N aggiungendo (NH 4) 2 SO 4: 1 g / L, Leucina: 0,225 g / L, adenina: 0,225 g / L, Uracil: 0,225 g / L . Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro dimensione dei pori di 0,22 micron. Conservare a temperatura ambiente.
Nota: leucina, adenina e uracile vengono aggiunti a questo mezzo per consentire la crescita di ceppi auxotrofi. Ulteriori supplemento di aminoacidi dovrebbe essere incluso se il ceppo utilizzato porta un auxotrofia distinta (per esempio his3Δ). Si prega di notare, inoltre, che il lavoro con ceppi completamente prototroph è consigliato, in quanto solotali ceppi permetteranno alta efficienza di accoppiamento. - Preparare 200 ml VALAP per la sigillatura della camera. In un becher aggiungere pesi uguali di lanolina, vaselina (o altro vaselina), e paraffina. miscela di calore a bassa temperatura e mescolare di tanto in tanto fino a quando completamente mescolato. Aliquota del mix in diversi piccoli capsule di Petri. Conservare a temperatura ambiente.
2. I ceppi Coltura lievito di fissione per esperimenti di accoppiamento (Figura 1).
- Giorno 1, Sera:
Seminare ceppi appena striate da un supporto solido in provette di coltura contenente 3 ml di MSL + N. Utilizzare tubi a fondo piatto di circa 2,5 cm di diametro. Utilizzare altri tubi di coltura o di boccette con volume di cultura adattato. Incubare per una notte (O / N) con agitazione a 25 ° C, 200 giri al minuto. Se si lavora con ceppi heterothallic, inoculare separatamente.- Diluire sospensioni cellulari in mezzi la mattina seguente per garantire che le culture hanno densità ottica misurata a 600 nm (OD 600) di 0,4-0,8 sera.
Nota:OD 600 misurazioni come proxy di concentrazione cellulare di lievito di fissione sono lineari nel range di circa 0,1-1,0. Per il nostro OD spettrofotometro 600 = 0.1 corrisponde a 1,4 x 10 6 cellule per ml. Così, se OD iniziale 600 legge sono al di fuori di questo intervallo campioni devono essere diluiti / concentrato per misurazioni affidabili.
- Diluire sospensioni cellulari in mezzi la mattina seguente per garantire che le culture hanno densità ottica misurata a 600 nm (OD 600) di 0,4-0,8 sera.
- 2 ° giorno, da sera:
Diluire le cellule in 20 ml di MSL + N media per OD 600 = 0,025 in 100 ml flaconi. Incubare ceppi O / N a 30 ° C, 200 giri al minuto.
Nota: colture di cellule wild-type dovrebbe raggiungere OD 600 ~ 0,8 la mattina seguente (15 ore più tardi). Se si lavora con ceppi con tempo più lungo di generazione regolare la diluizione di conseguenza. - 3 ° giorno, Mattina:
Misura OD 600 per verificare che le culture hanno densità cellulare di OD 600 ~ 0.8. Se si lavora con ceppi heterothallic, mescolare un numero uguale di cellule partner. Cellule pellet a 1.000 xg, trasferire in un 1,5 mltubo. Lavare le cellule tre volte in 1 ml di terreno MSL-N. Risospendere le cellule in 3 ml di terreno MSL-N e diluire le cellule ad OD 600 = 1.5.- Per monitorare l'accoppiamento tra le cellule sorelle montare direttamente le cellule per l'imaging (vedi protocollo sezione 2.4). Utilizzare ceppi H90 homothallic, in quale tipo di accoppiamento di commutazione avrà luogo durante le divisioni mitotiche che si verificano dopo deprivazione di azoto. montaggio immediato di celle del pad agarosio assicura che, dopo la divisione cellulare, sorella-cellule rimangono accanto all'altro.
- Per monitorare polarizzazione cellulare (dinamiche esplorative e shmooing) incubare 1-3 ml di coltura cellulare a 30 ° C, 200 rpm per 3-4 ore prima di celle di montaggio per l'imaging. All'interno di questi 3-4 ore, si sono verificati l'ultima divisione mitotica. A poche cellule saranno hanno avviato la polarizzazione, ma la maggior parte saranno solo iniziando la loro dinamica di polarizzazione esplorativi.
- Per monitorare la fusione cellula-cellula incubare 1-3 ml di coltura cellulare a 30 ° C, 200 rpm per 4-6 hr prio alle cellule di montaggio per l'imaging.
- Monitorare eventi post-fusione incubare 1-3 ml di colture cellulari a 30 ° C, 200 rpm per 8 ore prima di celle di montaggio per l'imaging.
- Per monitorare la risposta ad una concentrazione di feromone specifico (solo per ceppi heterothallic) incubare 3 ml di coltura cellulare a 30 ° C, 200 rpm per 3-4 ore prima di celle di montaggio per l'imaging.
- Rimuovere la provetta MSL-N-contenente dal blocco C di calore 95 ° (vedere la sezione Protocollo 2.4.1. Di seguito). Aggiungere P-factor o fattore M alla concentrazione desiderata direttamente in agarosio fuso MSL-N. Mescolare bene nel vortex prima della preparazione immediata pad.
- Dopo il montaggio cella, incubare il pad per 15-30 minuti a 25 ° C prima di imaging. P-factor e fattore M i feromoni sono stati utilizzati da una soluzione stock di 1 mg / ml in metanolo.
Nota: Se si lavora con mutante ceppi tempi di incubazione possono variare. Aggregazione delle cellule può verificarsi dopo incubazione prolungata in m liquidoedia e può essere particolarmente forte in alcuni ceppi mutanti. cellule aggregata non possono essere individuati sul pad agarosio in un unico strato e quindi sono difficili da autofocus e immagine. In caso di forte aggregazione cellulare montare celle pastiglie agarosio dopo lavaggi e risospensione in mezzi azoto privo (come nella sezione protocollo 2.3.1.) E incubare a 30 ° C prima di imaging.
- Le cellule di Imaging di montaggio:
- Preparare MSL-N pastiglie agarosio 16 fondendo una aliquota in un 95 ° C di calore-blocco per 10-15 minuti e aggiungendo 200 microlitri tra due vetrini separati da distanziali (Figura 1B). Utilizzare distanziatori con uno spessore di ~ 0,5 mm. Per rendere distanziatori, utilizzare strisce ritagliate di cartone, come quello fornito con enzimi di restrizione.
- Pellet 100 microlitri di cellule a 1.000 xg per 1 minuto, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in residuo medio 2-4 microlitri. NON risospendere in terreno fresco come ritardaaccoppiamento.
- Dopo 2-3 minuti rimuovere con cautela distanziali e il vetrino superiore. Se diversi ceppi devono essere montati, preparare la cellula si concentra prima di preparare il pad agarosio.
- Aggiungere 1 ml di cellule per il pad e attendere che il calo inizia l'essiccazione (~ 1 min) prima di coprire con il coperchio slip e sigillatura con VALAP.
- Lasciate che il pad riposare per almeno 30 minuti prima di imaging a 25 ° C o RT.
- Per ottenere una miscela di cellule in varie fasi di accoppiamento, fare un tampone subito dopo lavaggi in MSL-N (vedi Sezione 2.3.) E incubare a 18 ° CO / N (~ 15 ore). Questo approccio è utile per l'imaging cellule nelle fasi di accoppiamento distinte con alta risoluzione temporale o campioni con segnale debole.
Imaging 3. Live-cell di accoppiamento cellule di lievito
- Regola immagine Impostazioni di acquisizione.
Nota: le impostazioni di acquisizione di immagini qui presentate sono state ottimizzate per la piattaforma DeltaVision composto da una Olympus IX-71 personalizzatomicroscopio invertito con Plan Apo 60X / 1.42 NA o U-Plan Apo 100X / 1.4 obiettivi NA, una macchina fotografica CoolSnap HQ2 e un Insight SSI 7 colori unità combinata illuminatore. L'hardware è controllato da Softworx V4.1.2, che consente anche di autofocus digitale.- Assicurarsi che gli intervalli di autofocus non superano 15 min dal Z-deriva nel tempo più lungo può superare la capacità del sistema software autofocus. Se si utilizza un sistema di autofocus basato su hardware, utilizzare intervalli più grandi.
- Regolare intervallo di imaging. Prendere immagini ogni 10 min per ~ 15 hr come punto di partenza quando si lavora con un fluorescente contrassegnati proteine per la prima volta. Questo intervallo offre una buona panoramica di tutto il processo di accoppiamento senza vasta sbiancamento.
- Immagine con 5 min intervalli più brevi o più precisamente a eventi temporali come la fusione. intervalli più brevi richiedono fluorofori forti che permettono ridotti tempi di esposizione e poco sbiancamento. Per l'imaging con intervalli inferiori a 1 min evitare di O / N microscopiae invece preparare una miscela di tutte le fasi di accoppiamento come descritto nel protocollo sezione 2.4.6.
- Regolare il tempo di esposizione dell'immagine. tempi di esposizione di prova tra i 50 e 300 msec. Lo scopo di trovare un equilibrio tra il rapporto e photobleaching segnale-rumore da ottenere un elevato numero di punti temporali con un segnale percepibile (tipicamente oltre 100).
- Regolare Z-sezionamento. Sezioni ogni 0,3 micron che coprono 5 micron di fornire una buona profondità di imaging. Si noti che ulteriori aumenti foto-danni Z-sezionamento, che può essere minimizzata utilizzando il OAI (asse integrazione ottica - un'unica acquisizione spazzata di profondità campione totale). Buon sistema di messa a fuoco automatica riduce la necessità di molti Z-sezioni ed è altamente raccomandato.
- Suggerimenti per Studiare comportamenti di accoppiamento Tipo-specifici:
- Per i ceppi heterothallic, usa h- e h + cellule esprimenti fluorofori distinti, in modo che i due tipi di cellule possono essere distinti. Utilizzare qualsiasi fluoropho geneticamente codificatori espresso come una versione citosolica o fusione di una proteina endogena, anche se abbiamo avuto un buon successo con sfGFP, una variante veloce pieghevole di GFP 17. Proteine endogene di solito sono contrassegnati alla loro locus genomico endogeno per ricombinazione omologa 14.
- Per i ceppi homothallic, esprimere una proteina fluorescente citosolica geneticamente codificato sotto il controllo di promotori specifici tipo di accoppiamento come quelle dei geni dei recettori feromone map3 e MAM2 per guidare l'espressione in cellule P e M rispettivamente. I promotori di map3 e MAM2 sono inattivi durante la crescita vegetativa e sono indotte su di azoto fame 18,19. Costrutti guida l'espressione di GFP citosolico o mCherry sotto il controllo di tali promotori sono generalmente integrati in un locus genomico (ura4, leu1) che non interferisce con la normale progressione del ciclo sessuale 12.
4. Quantificazione di accoppiamento e Fusion efficienze
- Per quantificare l'accoppiamento e la fusione efficienze 11,12, le cellule del punto subito dopo MSL-N lavare su MSL-N pad agarosio, come al punto 2.3.1, e lasciare per 24 ore a 25 ° C prima di imaging (Figura 1A). Usando questo protocollo una homothallic wild-type efficienza ceppo di accoppiamento raggiunge ~ 60% e l'efficienza di fusione del 99%. Per verificare se qualsiasi riduzione di questi valori osservati nei ceppi mutanti riflettono un fenotipo terminale o un ritardo, ripetere l'esperimento con un tempo di incubazione 36 ore.
- Calcolare l'efficienza di accoppiamento come
coppie di accoppiamento includono zigoti, ASCI, e le coppie di cellule non fuse identificati dala loro posizione e crescita verso ogni altri. - Calcolare l'efficienza fusione come
Nota: accoppiamenti accoppiamento fuso sono identificati dalla loro capacità di formare spore se è noto che il mutante in esame non influenza sporulazione. Se sporulazione non può essere utilizzato come read-out, la fusione è determinata osservando la diffusione di un marcatore citosolico espressa in un solo partner di accoppiamento in entrambi i partner.
coppie di accoppiamento includono zigoti, ASCI, e le coppie di cellule non fuse identificati dala loro posizione e crescita verso ogni altri. 
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Representative Results
Lievito di fissione la crescita e l'accoppiamento Dynamics dopo la rimozione di una fonte di azoto
Come fame di azoto è un prerequisito per l'inizio della riproduzione sessuale in lievito di fissione, il ceppo selvatico homothallic H90 è stato monitorato su passaggio da medio di azoto-privato ricco di azoto (figura 2), seguendo il protocollo descritto nella Figura 1. In breve, le cellule sono state coltivate O / N a fase esponenziale (OD 600 = 0,5) in media MSL + N, raccolti, lavati e risospesi in MSL-N mezzo liquido di OD finale 600 = 1.5. Ogni 2 aliquote hr di cellule erano calcofluor-macchiato e ripreso (Figura 2A - D).
Calcofluor colorazione (Figura 2A) ha rivelato che in media ricca di azoto ~ 21% delle cellule sono state septating (n> 300, Figura 2B) e che la lunghezza media cella diviSion era 15,2 ± 1,4 micron (n = 50, Figura 2C). Le cellule non-dividendo ha mostrato un'ampia distribuzione delle lunghezze delle cellule (8-14 micron; n> 200, Figura 2D). Tuttavia, due ore dopo il passaggio a mezzo MSL-N c'è stato un drastico cambiamento nella distribuzione di lunghezza di cellule non-dividendo, con oltre il 60% delle cellule più corti di 9 micron (n> 200, Figura 2D). Cellulare septation stata anche rilevata la lunghezza ridotta di 9,8 ± 0,8 micron (n = 50, Figura 2A, 2C). è stata inoltre osservata una ulteriore riduzione in lunghezza sia non-separazione e divisione delle cellule, come il tempo in MSL-N aumentato. Infatti, dopo 8 ore l'indice septation della cultura sceso sotto il 2% (n> 300) e più dell'85% delle cellule arrestato loro ciclo cellulare a lunghezze inferiori a 7 micron (n> 200, Figura 2D).
Le cellule hanno cominciato a formare accoppiamento coppie quattro ore dopo il passaggio a liquido MSL-Nmedio (<1%, Figura 2A). Successivamente il numero di coppie di accoppiamento rapidamente aumentata e 8 ore dopo il turno 10% delle cellule impegnato un partner di accoppiamento (n> 200, Figura 2B).
Per monitorare le dinamiche di accoppiamento, 6 ore dopo l'induzione di fame, una aliquota di cellule è stato montato anche su MSL-N pad agarosio per l'imaging. Cellule sottoposti shmooing, fusione e sporulazione (Figura 2E, 2F) nel successivo 21 hr senza sincronia apparente (Film S1). L'efficienza di accoppiamento dipendeva dalla posizione relativa e la densità delle cellule in un determinato campo di vista, con oltre il 60% delle cellule impegnato un partner quando posizionato densamente in un monostrato (figura 2G e film S1).
I ceppi wild-type heterothallic h h- lievito di fissione + e sono stati sottoposti allo stesso protocollo con unn ulteriore fase di miscelazione h cellule h- + e in un rapporto uno a uno al momento della rimozione dell'azoto. Sono stati osservati simili fame e di accoppiamento dinamiche, ma l'efficienza di accoppiamento è stato leggermente inferiore (figura 2G, Film S2).
Monitoraggio Dinamica di fluorescenza proteine Tagged in accoppiamento fissione cellule di lievito
Cellule h- Per monitorare la dinamica di tipo-V miosina Myo52 (Ref 20) in accoppiamento cellule, esponenzialmente cresciute esprimono Myo52-3GFP dal locus nativa sono stati mescolati con + cellule h esprimono simile Myo52-tdTomato, nonché GFP citosolica dalla P -cell specifica promotore map3. La sospensione cellulare è stato lavato, diluito in terreno MSL-N ed incubate per 6 ore a 30 ° C, 200 rpm prima cellule montaggio su MSL-N pastiglie agarosio per l'imaging O / N a 10 intervalli min.
Come riportato in precedenza 11,12 Myo52 zone dinamiche inizialmente formato in tutta la corteccia cellulare (Figura 3A, punte di freccia e Movie S3). Myo52 segnale è stato poi stabilizzato (Figura 3A, frecce e film S3) in un singolo fuoco poco prima dell'evento di fusione, che è stato visualizzato mediante il trasferimento del segnale GFP citosolica dalla h + nella cellula h- (Figura 3A e film S3) . Il segnale Myo52-tdTomato potrebbe anche essere osservato al collo di fusione durante la sua espansione, ma nessun segnale percepibile era evidente come lo zigote proceduto a sporulazione (figura 3A e Movie S3).
Monitoraggio del comportamento di Heterothallic fissione cellule di lievito esposto ai feromoni esterne
Celle H- Heterothallic manca il proteasi Sxa2 che degrada P-fattore per la desensibilizzazione rispondono prontamente al sintetico P-fattore. un h- sxa2Δ ceppo, esprimono Scd2-GFP come marcatore per attiva Cdc42 11, è stato coltivato in mezzo di MSL + N, di conseguenza per il protocollo descritto. Le cellule sono state lavate in terreno MSL-N e incubate per 4 ore a 30 ° C. MSL-N pastiglie agarosio contenente metanolo (dati non mostrati), 0,1 mg / ml (bassa feromone, Figura 3B) o 1 mg / ml (alta feromone, figura 3C) del fattore P sono stati preparati, tagliati e posizionati su una nuova diapositiva per generare mini-pastiglie contenenti diverse quantità di feromoni. 0,5 ml di sospensione cellulare è stato montato su ogni mini-pad per l'imaging O / N a 5 min intervalli.
In accordo con i risultati pubblicati 11, bassi livelli di fattore P promosso la formazione di zone Scd2 dinamiche senza crescita (Figura 3B, film S4), mentre alti livelli di fattore P stabilizzato una singola zona Scd2, inducendo così shmoo allungamento dalla pole una cella (FIGURA 3C, Film S5).
Figura 1:.. Rappresentazione schematica del protocollo (A) descrizione schematica dei protocolli utilizzati per monitorare lievito di fissione del ciclo di vita sessuale e (B) per preparare i campioni fissione lievito per l'imaging a lungo termine Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 2:. Crescita e dinamica accoppiamento delle cellule di lievito Fission spostato da MSL + N per MSL-N media microscopio (A) epifluorescenza delle cellule calcofluor macchiati spostato a MSL-N supporti per i periodi indicati di tempo. (B) Percentualecellule di septating (linea blu scuro, n> 300 per timepoint) e l'accoppiamento (linea azzurra, n> 300 per timepoint) spostato a MSL-N supporti per i periodi indicati di tempo. (C) la durata media delle cellule septating spostato a MSL-N supporti per i periodi indicati di tempo (n = 50 per timepoint ad eccezione di 8 ore timepoint dove n = 20). (D) la distribuzione Lunghezza di cellule non-dividendo spostato a medio MSL-N per i periodi indicati di tempo (n> 200 per timepoint). (E) frazione media di non condensato (linea blu scuro), fusa (linea azzurra) e sporulanti (linea nera), le cellule in una popolazione di H90 wild-type lievito spostato a MSL-N supporti per i periodi indicati di tempo e montato su un pad agar a timepoint 6 ore (n> 900 cellule per timepoint da tre diversi timelapses). Le cellule sono state prese in considerazione fusa quando nessuno parete cellulare di rifrazione tra i partner era visibile nelle micrografie DIC e formazione della parete cellulare spore è stato utilizzato per segnare per sporulating cellule. (F) DIC microscopio delle cellule di accoppiamento spostato a MSL-N supporti per i periodi indicati di tempo. (G) l'efficienza di accoppiamento in funzione della densità cellulare in pastiglie agarosio per H90 (punti blu scuro) e H + / h- cellule (punti luce blu) spostata verso MSL-N supporti per 24 ore. La densità più adatto di cellule per l'imaging a lungo termine è raggiunta a circa 25.000 cellule / mm 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Dinamica localizzazione delle proteine fluorescenti durante lievito di fissione di accoppiamento (A) Deconvolved singoli microscopio piano z epifluorescenza delle cellule con i genotipi indicati spostati da MSL + N per MSL-N multimediale per 6 ore e montate suMSL-N pad agarosio per il tempo indicato. Punte di freccia indicano zone Myo52-3GFP dinamiche e la freccia sottolinea Myo52 localizzazione al fuoco di fusione. (B), (C) Deconvolved singolo piano z micrografie epifluorescenza di cellule con genotipi indicati spostata dal MSL + N per MSL-N supporti per 4 ore e montate su MSL-N mini-pad agarosio contenente 0,1 mg / ml (B) o 1 mg / ml (C) di P-fattore per il tempo indicato. Punte di freccia indicano dinamica (B) o stabili zone (C) Scd2-GFP. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film supplementare 1: Timelapse DIC di wild-type H90 lievito di fissione ce LLS che erano azoto-digiuno per 6 ore prima di imaging. (clic destro per il download).
Supplementare Movie 2: . Timelapse DIC di cellule di lievito di fissione h- wild-type H + e che erano misti e azoto-digiuno per 6 ore prima di imaging (Tasto destro del mouse per scaricare).
"> Film supplementare 3: Deconvolved epifluorescenza singolo piano z e DIC timelapse di cellule che esprimono h- Myo52-3GFP dal luogo nativo mescolato con h + cellule che esprimono Myo52-tdTomato dal luogo natale e GFP citosolico dalla specifica promotore map3 P-cell . le cellule sono state coltivate in terreno MSL-N per 6 ore a 30 ° C prima di imaging. Trasferimento di GFP citosolica nella cella h- definisce il tempo di fusione. (clic destro per il download).
Film supplementare 4: Deconvolved epifluorescenza singolo piano z e DIC timelapse di h- cellule sxa2 expressing Scd2-GFP dal suo promotore originario trattato con 0,1 mg / ml P-fattore. Le cellule sono state coltivate in terreno MSL-N per 4 ore a 30 ° C prima di imaging. (clic destro per il download).
Supplemental Movie 5: . Deconvolved epifluorescenza singolo piano z e DIC timelapse di cellule che esprimono sxa2 h- Scd2-GFP dal suo promotore originario trattati con 1 mg / ml P-fattore Le cellule sono state coltivate in terreno MSL-N per 4 ore a 30 ° C prima di imaging. (Tasto destro del mouse per scaricare).
| YSM995 | h- WT |
| YSM1371 | h + WT |
| YSM 1396 | H90 WT |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | h- scd2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
Tabella S1: I ceppi utilizzati in questo studio.
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Discussion
Condizioni ambientali, e la disponibilità di nutrienti, in particolare, influenzano pesantemente la fisiologia fissione lievito. L'azoto fame è necessario per l'impegno per la riproduzione sessuale e porta a notevoli cambiamenti nella progressione del ciclo cellulare mitotico (Rif. 21 e Figura 2) inizialmente. Alla rimozione azoto popolazione in crescita esponenziale, dimensione delle celle a divisione diminuisce rapidamente (Figura 2C) e la maggior parte delle cellule arrestare la progressione mitotico inferiore alla lunghezza di appena nati cellule cresciute esponenzialmente (Rif. 21 e Figura 2D). Come le cellule di tipi di accoppiamento opposti arrestano la progressione mitotico si impegnano accoppiamento partner e procedere a formare zigoti e producono spore (Figura 2B, 2E, 2F). Nel caso di un monostrato bidimensionale di cellule di tipo selvatico, oltre sessanta per cento delle cellule H90 si impegnerà un partner, e quasi tutti subirà fusione cellulare (figura 2G (figura 2G). Uno degli aspetti più critici del protocollo di ottenere elevate efficienze di accoppiamento è quello di assicurare che le cellule siano mantenute entro le densità indicati in tutto. Monitoraggio della dimensione cellulare e di efficienza di accoppiamento parametri come mostrato nella Figura 2 fornisce quindi un semplice controllo che le cellule stanno entrando efficiente riproduzione sessuale.
Notiamo che, dal momento che l'accoppiamento medio mancanza qualsiasi fonte di azoto (anche basse quantità di aminoacidi e basi azotate sono esclusi), efficienze elevate di accoppiamento, come quelli presentati nella Figura 2E e 2G si ottengono solo con ceppi completamente prototrofici. ceppi auxotrophic possono essere utilizzati, ma richiedono cure supplementari per garantire che le cellule siano in ogni momento detenuti all'interno densità di cellule indicati nel protocollo. Anche con cura, solosaranno osservati efficienze di accoppiamento inferiori. efficienza di accoppiamento è anche influenzato dalla temperatura, con efficienze più bassi osservati a temperature elevate, che possono limitare l'uso di alleli mutanti sensibili alla temperatura durante il processo di accoppiamento.
Il metodo qui presentato è usato principalmente per l'imaging a lungo termine del reporter fluorescenti. Perché l'imaging viene eseguito su lungo periodo di tempo, il successo di imaging di lievito di fissione accoppiamento è fortemente dipendente dalla configurazione di microscopia a disposizione. Per questo, la stabilità del microscopio set-up, la sensibilità e l'accesso a un sistema di autofocus sono critici. In entrambi i casi basati su software o sistemi di autofocus hardware built-in sono possibili. Inoltre, per aumentare la produttività, uno stadio motorizzato consente acquisizione multipoint è un'altra importante qualità.
qualità Imaging è limitata dalle proprietà del fluoroforo di interesse. I tempi di incubazione distinti nel mezzo liquido MSL-N dettagliato nella Protocol Sezione 2.3 sono finalizzate ad ottimizzare la fluorescenza sulle proteine taggati feromoni-indotta e riducendo al minimo lo sbiancamento inutili di imaging solo accoppiamento fasi di interesse. Mentre abbondanti o altamente focalizzate fluorescenti etichettati proteine consentono l'acquisizione di centinaia di punti temporali nel corso dell'intero ciclo di vita sessuale (Film S3), altre proteine sono difficili da immagine su tali tempi lunghi a causa di foto-sbiancamento. La qualità dell'immagine dipende anche dal fluoroforo scelta, tipicamente un derivato GFP. Abbiamo ripetutamente osservato che sfGFP 17 (Superfolder GFP), che si ripiega con cinetiche rapide, a condizione del segnale superiore durante il processo di accoppiamento, forse perché forte autofagia induce turnover proteico rapida. È importante sottolineare che non abbiamo monitorare la disponibilità di ossigeno necessaria per la maturazione proteina fluorescente 17,22. Pertanto, si raccomanda di essere prudenti nell'uso di misure di fluorescenza per quantificare i livelli di proteine espresse dopo che le cellule sono mounted su vetrini, o di utilizzare l'ossigeno dispositivi microfluidica permeabili alternativi per condurre tali esperimenti. Inoltre, pastiglie agarosio macchiato con cellule di sera e mantenuti a 18 ° C O / N sono stati molto utile per immagine reporter deboli come tali pastiglie contengono una miscela di cellule in ogni fase della riproduzione sessuale.
L'accoppiamento nel lievito di fissione non presenta sincronia e cellule possono essere facilmente visto l'avvio shmooing accanto ad altre cellule già sporulanti (Film S1, S2). Tali dinamiche della popolazione rende classica, tecniche biochimiche di massa difficile da usare, rendendo unico microscopio delle cellule qui descritto un metodo di scelta. Tutti gli approcci microscopia-based possono in linea di principio essere applicati a cellule preparate con il protocollo qui descritto. È importante sottolineare che questi approcci possono monitorare Processi che presentano accoppiamento dinamiche specifiche di tipo come la fusione cellula-cellula descritto da Dudin e colleghi 12. Per monitorare asimmetria, tipo di accoppiamento giornalistisono stati particolarmente utile (Figura 3A). Differenze tra i due tipi di accoppiamento si ottiene facilmente quando si lavora con ceppi heterothallic impiegando fluorofori distinti per codificare proteine nel h- e cellule H +. Tuttavia, questo non è fattibile per i ceppi homothallic. Un approccio sviluppato per differenziare il tipo di accoppiamento di cellule H90 è esprimere proteine fluorescenti citosoliche sotto il controllo di promotori specifici tipo di accoppiamento. In particolare, i promotori del recettore feromone geni map3 e MAM2 sono stati usati per guidare rispettivamente l'espressione di proteine GFP o mCherry in P e cellule M. Inoltre, questi marcatori permesso sincronizzazione precisa della fusione cellula-cellula, visualizzata come il trasferimento di segnale fluorescente da una cellula socio all'altro.
Feromoni accoppiamento sono determinanti cruciali per progredendo attraverso fasi distinte di riproduzione sessuale nel lievito 11,23. Diversi livelli di feromone sintetico piombo a distinti stati di polarizzazione cellulare in lievito di fissione (Figura 3B, 3C e Ref. 11). Il protocollo incluso sopra permette di valutare come diversi livelli di feromoni esogeni influenzano la fisiologia cellulare. Perché la proteasi feromone Sxa2 degrada rapidamente fattore P, un ceppo mutante heterothallic dove la proteasi è stata eliminata è stata utilizzata per ottenere risultati riproducibili. Tuttavia, in miscele di cellule di tipi di accoppiamento opposte, non solo i livelli ma anche la distribuzione spaziale dei feromoni emessi da un partner di accoppiamento sono probabilmente importanti. Analizzando gli effetti del feromone distribuzione spaziale della risposta cellulare richiederà lo sviluppo di configurazioni più sofisticate, come i dispositivi microfluidica impiegati su erba lievito 24,25.
In sintesi, presentiamo un metodo di base per microscopia a lungo termine del ciclo di vita sessuale di lievito di fissione. aggiustamenti minori di tale protocollo consentono research concentrarsi sulle risposte cellulari nelle fasi distinte del ciclo di vita sessuale. La combinazione di questo approccio con gli strumenti di biochimica delle cellule singole e dispositivi microfluidica promuoverà ulteriormente lievito di fissione riproduzione sessuale come sistema modello potente.
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Acknowledgments
AV è stato sostenuto da un lungo periodo borsa di studio postdottorato EMBO. La ricerca in laboratorio Martin è finanziato da una sovvenzione del CER di partenza (GeometryCellCycle) e una borsa di studio Science Foundation nazionale svizzero (31003A_155944) per SGM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
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