Introduction
Obwohl genetische Austausch zwischen zwei das zentrale Ereignis in der sexuellen Fortpflanzung ist es, Zellen, stützt sie sich auf eine Kette von Ereignissen, die Zelldifferenzierung fördern, ermöglichen die Partnerwahl durchführen Zell-Zell-Fusion und genomische Stabilität aufrechtzuerhalten. So ist die sexuelle Lebenszyklus selbst als Modellsystem stellt eine Reihe von biologischen Fragen in Bezug auf Entwicklungs Schalter, als Reaktion auf extrinsische Reize, Plasmamembranfusion, die Chromosomensegregation zu studieren, usw. Erforschung der Spalthefe Sexualzyklus , diese Phänomene zu studieren , bringt die Vorteile der Modellsystem leistungsstarke Genetik, gut etablierte High-Throughput-Ansätze und anspruchsvolle Mikroskopie. Sex in Spalthefe ist ein heterotypic Ereignis zwischen einer P-Zelle und einer M-Zelle von unterschiedlichen Paarungstypen. Die beiden Zelltypen differentiell eine Reihe von Genen 1,2 einschließlich der für die Produktion des sekretierten P- und M-Pheromonen, Pheromon-Rezeptoren Map3 und MAM2 sowie Pheromon-protea auszudrückenses Sxa1 und Sxa2. Homothallischen Stämmen wie den H90 - Stamm häufig verwendet, tragen die genetische Information für beide Paarungstypen in einem einzigen Genom und Zellen durchlaufen ein komplexes Muster von Paarungstyp Schalt ganzen Lebenszyklus mitotische ( zusammengefasst in Ref. 3). Mehrere Isolate von heterothallisch Spalthefe , die selten oder nie Paarungstyp wechseln werden auch häufig 4, am deutlichsten die h + N (P-Typ) und h -S (M-Typ) Stämme verwendet.
In Spalthefe, Eintritt in den sexuellen Lebenszyklus ist unter strengen Ernährungs Regulierung. Nur verhaften Stickstoff verhungert Spalthefezellen mitotischen Reproduktion und produzieren diffusionsfähig Pheromone Anwesenheit eines Paarungspartner zu signalisieren , und weitere Schritte des Sexualzyklus fördern ( beschrieben in Ref. 5). Stickstoffentzug de-reprimiert den Schlüssel Transkriptionsregulator der Paarung Ste11, die als Entwicklungs Schalter wirkt und fördert expression spezifischer Gene einschließlich des Pheromon - Rezeptor - Paarung und dem Pheromon Produktion Gene 6,7. Pheromon-Rezeptor Engagement aktiviert den Rezeptor-gekoppelten Protein G-alpha und Downstream - MAPK - Signalisierung , die eine weitere Verbesserung Ste11 Transkriptionsaktivität 8-10, somit Pheromonproduktion in einer positiven Rückkopplung zwischen Paarungspartner zu erhöhen. Pheromone Ebenen sind von entscheidender Bedeutung verschiedener Zellpolarisationszustände zu induzieren , indem die Master - Organisator der Zellpolarität Regulierung der Rho-Familie GTPase Cdc42 11. Bei Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen Pheromon ist aktiv Cdc42 in dynamischen patches visualisiert der Zellperipherie Erkundung und kein Zellwachstum in diesem Stadium beobachtet werden. Erhöhte Pheromon Ebenen, um die Stabilisierung der Cdc42-Aktivität zu einer einzigen Zone und das Wachstum eines polarisierten Projektion fördern, zu bezeichnen die shmoo, die Partnerzellen in Kontakt bringt. Anschließend verschmelzen die beiden haploiden Paarungspartnern einen diploiden Zygote zu bilden. Die jüngsten Arbeiten zeigt the Existenz eines neuartigen Aktin Struktur essentiell für die Fusion, die durch die Paarung induzierten formin Fus1 12 zusammengebaut ist. Dieses Fusions Fokus konzentriert Typ-V - Myosin abhängige Prozesse und positioniert die Abbaumaschinen Zellwand, wodurch Remodellierung der Zellwand ermöglicht 12 Plasmamembran Kontakt ohne Zell - Lyse zu ermöglichen. Bei der Zell-Zell-Fusion, kommen die Kerne in Kontakt und Karyogamie unterziehen. Ein prominentes dynein abhängigen Hin- und Her - Bewegung des Kerns in der Zygote (die Pferdeschwanzbewegung) fördert dann die Paarung von Chromosom Homologe 13,14, die durch Meiose folgt. Schließlich werden die vier Produkte der Meiose in einzelne Sporen während der Sporulation verpackt.
Aufgrund seiner Komplexität und der zahlreichen Schritte, die eine detaillierte Überwachung der Paarung wurde herausfordernd. Zwei bemerkenswerte Schwierigkeiten sind, dass der gesamte Prozess dauert mehr als 15 Stunden und die Zellen sind schwierig zu synchronisieren. Diese difficulties werden durch Einzelzell-Mikroskopie Ansätze umgangen. Hier ein allgemeines Protokoll der sexuellen Lebenszyklus in Spalthefe zu untersuchen, wird präsentiert. Mit kleineren Anpassungen, dieses Protokoll die Studie über die verschiedenen Schritte des Verfahrens ermöglicht, nämlich die Induktion von Paarungs Genprodukts, Zellpolarisation und Paarung zwischen Schwester-Zellen nach der Paarungstyp Schalten und zwischen Nicht-Schwester Partner, Zell-Zell-Fusion, und nach der Fusion Pferdeschwanzbewegung, Meiose und Sporulation. Dieses Verfahren ermöglicht auf 1) leicht sichtbar fluoreszent markierte Proteine im Laufe der Zeit vor, während und nach der Fusion; 2) unterscheiden, die das Verhalten von Zellen des entgegengesetzten Paarungstyps; und 3) messen und zu quantifizieren Parameter wie shmooing, Paarung, Fusion oder Sporulationseffizienz.
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Protocol
Mikroskopie Analyse von Spalthefe geschlechtliche Fortpflanzung
1. Medienvorbereitung
- Bereiten Minimum Sporulationsmedium (MSL-N) 15 durch Vermischen der folgenden Komponenten: Glucose: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / l, NaCl: 0,1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Hinzufügen Spurenelemente (10.000X): 100 & mgr; l / L, Vitamine (1,000x): 1 ml / L und 0,1 M CaCl 2 ml / L. Filter-sterilisieren einen 0,22 um Porengröße Filter und Speicher unter Verwendung von bei Raumtemperatur (RT).
- Verwenden Sie die folgenden Vitamine (1,000x) Lager: Pantothenate: 1 g / l, Nicotinsäure: 10 g / l, Inositol: 10 g / l, Biotin: 10 mg / l. Filter-sterilisieren einen 0,22 um Porengröße Filter und Speicher unter Verwendung bei 4 ° C.
- Verwenden Sie die folgenden Spurenelemente (10.000fach) Lager: Borsäure: 5 g / l, MnSO 4: 4 g / l, ZnSO 4 · 7 H 2 O: 4 g / l, FeCl 2 · 6 H 2 O: 2 g / L , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / l, CuSO 4· 5H & sub2 ; O: 0,4 g / L, Zitronensäure: 10 g / L. Filter-sterilisieren einen 0,22 um Porengröße Filter und Speicher unter Verwendung bei 4 ° C.
- Bereiten MSL-N 2% Agarose (Agarose verwendet pad Kammern bilden) durch Kombinieren von 10 ml MSL-N mit 0,2 g Agarose. Schmelzen Sie für ~ 2 min bei hoher Leistung in einem Mikrowellenofen bis Agarose löst und aliquote 0,5 ml in Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie bei RT.
- Bereiten Minimum Sporulationsmedium mit Stickstoff (MSL + N) aus MSL-N durch Zugabe von (NH 4) 2 SO 4: 1 g / L, Leucin: 0.225 g / L, Adenin: 0,225 g / l, Uracil: 0.225 g / L . Filter-sterilisieren einen 0,22 um Porengröße Filter. Lagern Sie bei RT.
Anmerkung: Leucine, Adenin und Uracil werden in diesem Medium zugesetzt, um das Wachstum von auxotrophen Stämmen zu ermöglichen. Zusätzliche Aminosäure Ergänzung sollte aufgenommen werden , wenn die verwendete Stamm einen deutlichen Auxotrophie trägt (zum Beispiel his3Δ). Bitte beachten Sie auch mit voll Prototroph Stämme, dass die Arbeit beachten wird empfohlen, da nursolche Stämme werden hohe Paarungseffizienz ermöglichen. - Bereiten Sie 200 ml VALAP für Kammerdichtung. In einem Becher hinzufügen gleichen Gewichten von Lanolin, Vaseline (oder andere Vaseline) und Paraffin. Wärme Mischung bei niedriger Temperatur und umrühren, bis sie gründlich vermischt. Aliquot der Mischung in mehrere kleine Petrischalen. Lagern Sie bei RT.
2. Anzucht Fission Hefestämmen für Mating Experimente (Abbildung 1).
- 1. Tag, Abend:
Impfen frisch ausgestrichenen Stämme aus festen Medien in Kulturröhrchen mit 3 ml MSL + N. Verwenden Sie Flachbodenröhrchen von etwa 2,5 cm Durchmesser. Verwenden Sie andere Kulturröhrchen oder Flaschen mit angepassten Kulturvolumen. Inkubieren über Nacht (O / N) mit bei 25 ° C Schütteln, 200 UpM. Wenn mit heterothallisch Stämme arbeiten, impfen getrennt.- Verdünnte Zellsuspensionen in Medien am nächsten Morgen um sicherzustellen , dass Kulturen optische Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,4 bis 0,8 am Abend , gemessen.
Hinweis:OD 600 Messungen als Proxy der Zellkonzentration für Spalthefe sind linear im Bereich von etwa 0,1-1,0. Für unsere Spektrophotometer OD 600 = 0,1 entspricht 1,4 x 10 6 Zellen pro ml. Wenn also Anfangs - OD 600 liest sind außerhalb dieses Bereichs Proben müssen für zuverlässige Messungen verdünnt / konzentriert werden.
- Verdünnte Zellsuspensionen in Medien am nächsten Morgen um sicherzustellen , dass Kulturen optische Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,4 bis 0,8 am Abend , gemessen.
- Tag 2, Abend:
Verdünnte Zellen in 20 ml MSL + N Medien 600 = 0,025 in 100 ml - Kolben zu Od. Inkubieren Stämme O / N bei 30 ° C, 200 Umdrehungen pro Minute.
Hinweis: Wildtyp - Zellkulturen sollte OD 600 ~ 0,8 am nächsten Morgen (15 Stunden später) zu erreichen. Bei der Arbeit mit den Stämmen mit längeren Generationszeit entsprechend anpassen Verdünnung. - Tag 3, Morgen:
Messen Sie 600 OD , um zu überprüfen , dass Kulturen Zelldichte von OD 600 ~ 0,8 haben. Wenn mit heterothallisch Stämme arbeiten, die gleiche Anzahl von Partnerzellen mischen. Pellet-Zellen bei 1000 × g und in ein 1,5 mlTube. Wasche die Zellen dreimal in 1 ml MSL-N-Medium. Re-suspendieren Zellen in 3 ml MSL-N Medium und Zellen zu verdünnen 600 = 1,5 bis Od.- Zur Paarung zwischen Schwesterzellen Zellen direkt für die Bildgebung Halter (siehe Protokoll Abschnitt 2.4) zu überwachen. Verwenden Sie homothallisch H90 - Stämme, bei dem Paarungstyp Schalten findet während der mitotischen Teilungen nehmen nach dem Stickstoffentzug auftreten. Sofortige Montage von Zellen auf der Agarose-Pad ist sichergestellt, dass nach der Zellteilung, Schwester-Zellen nebeneinander bleiben.
- Zellpolarisation (Sondierungsdynamik und shmooing) inkubieren 1-3 ml Zellkultur für die Bildgebung bei 30 ° C, 200 Upm für 3-4 Stunden vor der Montage Zellen zu überwachen. Innerhalb dieser 3-4 Stunden wird sich die letzte mitotische Teilung aufgetreten. Einige Zellen haben Polarisation eingeleitet, aber die meisten werden nur ihre Sondierungspolarisationsdynamik beginnen.
- Zur Überwachung der Zell-Zell-Fusion 1-3 ml Zellkultur bei 30 ° C, 200 Upm für 4-6 h pri inkubierenoder an Zellen für die Bildgebung Montage.
- Zu überwachen post-Fusionsereignisse inkubieren 1-3 ml der Zellkulturen bei 30 ° C, 200 Upm für 8 Stunden vor der Zellen für die Bildgebung Montage.
- Zur Überwachung Reaktion auf eine bestimmte Pheromonkonzentration (nur für heterothallisch Stämme) inkubieren 3 ml der Zellkultur bei 30 ° C, 200 Upm für 3-4 Stunden vor der Zellen für die Bildgebung Montage.
- Entfernen Sie die MSL-N-haltige Mikrozentrifugenröhrchen aus dem 95 ° C Wärmeblock (siehe Protokoll Abschnitt 2.4.1. Unten). In P-Faktor oder M-Faktor bei der direkt im geschmolzenen MSL-N Agarose gewünschte Konzentration. Gut mischen durch Vortexen bevor sofortige Pad Vorbereitung.
- Nach der Zellmontage, Inkubation vor der Bildgebung das Pad für 15-30 min bei 25 ° C. P-Faktor und Faktor M-Pheromone wurden aus einer Stammlösung von 1 mg / ml in Methanol verwendet.
Hinweis: Wenn mit mutierten Arbeits Stämme Inkubationszeiten variieren. Verklumpung der Zellen kann nach längerer Inkubation in flüssiger m auftretenedia und kann besonders stark sein, in einigen mutierten Stämmen. Verklumpten Zellen können nicht auf Agarose-Pads in einer einzigen Schicht gesichtet werden und somit schwer zu Autofokus und Bild. Bei umfangreichen Zelle Verklumpung Halterung Zellen auf Agarose-Pads sofort nach Waschungen und Resuspension in Stickstoff-fehlt-Medien (wie im Protokoll Abschnitt 2.3.1.) Und inkubieren bei 30 ° C vor der Bildgebung.
- Montagezellen für Imaging:
- Bereiten MSL-N Agarose Kissen 16 , indem ein Aliquot in einem 95 ° C-Wärmeblock für 10-15 min Aufschmelzen und Zugabe von 200 & mgr; l zwischen zwei Glasobjektträger getrennt durch Abstandshalter (1B). Verwenden Abstandshalter mit einer Dicke von ~ 0,5 mm. Um Verbreiterungen machen, aus Pappe, wie die Verwendung Streifen mit Restriktionsenzymen geliefert geschnitten.
- Pellet 100 ul Zellen bei 1.000 × g für 1 min, um den Überstand zu entfernen und erneut zu suspendieren Zellen in Rest 2-4 & mgr; l Medium. Sie NICHT in frischem Medium erneut zu suspendieren, wie es verzögertPaarung.
- Nach 2-3 min sorgfältig Abstandhalter entfernen und die obere Glasträger. Wenn mehrere Stämme zu montieren sind, bereiten die Zelle konzentriert sich vor der Agarose-Pad vor.
- 1 & mgr; l der Zellen mit dem Pad und warten, bis der Tropfen Trocknen beginnt (~ 1 min), bevor sie mit Deckglas bedeckt und Abdichten mit VALAP.
- Lassen Sie die Unterlage für mindestens 30 min vor der Bilderzeugung bei 25 ° C oder RT sitzen.
- Zu einer Mischung von Zellen in verschiedenen Stadien der Paarung zu erhalten, machen Sie ein Pad sofort nach Waschungen in MSL-N (siehe Abschnitt 2.3.) Und Inkubation bei 18 ° CO / N (~ 15 h). Dieser Ansatz ist nützlich für die Zellen an unterschiedlichen Paarungs Phasen mit hoher zeitlicher Auflösung oder Proben mit schwachem Signal Bildgebung.
3. Bildgebung lebender Zellen von Mating-Hefezellen
- Justieren Sie Bildaufnahme-Einstellungen.
Hinweis: Die Bildaufnahme-Einstellungen hier vorgestellt wurden für die Deltavision-Plattform optimiert, bestehend aus einem maßgeschneiderten Olympus IX-71inverses Mikroskop mit Plan Apo 60x / 1,42 NA oder U-Plan Apo 100X / 1.4 NA Ziele, eine CoolSNAP HQ2 Kamera und einen Einblick SSI 7 Farbe kombinierte Einheit Illuminator. Die Hardware wird durch Softworx V4.1.2 gesteuert, die auch digital Autofokus ermöglicht.- Sicherzustellen, dass die Autofokus-Intervalle nicht überschreiten 15 min, da die Z-Drift über längere Zeit die Kapazität der Software Autofokussierungssystem übertreffen können. Bei Verwendung eines Hardware-basierten Autofokus-System, verwenden Sie größere Intervalle.
- Stellen Sie Imaging-Intervall. Nehmen Sie Bilder alle 10 Minuten für ~ 15 Stunden als Ausgangspunkt, wenn sie mit einem fluoreszierend markierten Proteins zum ersten Mal arbeiten. Dieses Intervall bietet einen guten Überblick über den gesamten Paarung ohne umfangreiche Bleichen.
- Bild mit 5-Minuten-Intervallen oder zu verkürzen, genauer Zeitereignisse wie Fusion. Kürzere Intervalle erfordern starke Fluorophore ermöglicht niedrige Belichtungszeiten und wenig Bleichen. Für die Bildgebung mit Abständen von weniger als 1 min vermeiden O / N-Mikroskopieund stattdessen eine Mischung aller Paarungsstufen herzustellen, wie in Protokoll Abschnitt 2.4.6 beschrieben.
- Passen Sie die Bildbelichtungszeit. Test-Belichtungszeiten zwischen 50 und 300 ms. Richten Sie ein Gleichgewicht zwischen dem Signal-zu-Rausch-Verhältnis und Photobleaching zu schlagen, wie eine große Anzahl von Zeitpunkten mit einem wahrnehmbaren Signal (in der Regel mehr als 100) zu erreichen.
- Stellen Sie Z-Schnitte. Abschnitte alle 0,3 & mgr; m Abdeckung 5 & mgr; m bieten eine gute Bildtiefe. Beachten Sie, dass Z-sectioning weitere Erhöhungen photo Schäden, die durch Verwendung der OAI (optische Achse Integration - eine einzige Sweep Erwerb der gesamten Probentiefe) minimiert werden kann. Gute Autofokus-System reduziert die Notwendigkeit von vielen Z-Abschnitte und ist sehr zu empfehlen.
- Tipps Paarungstyp-spezifischen Verhaltensweisen zu studieren:
- Für heterothallisch Stämme verwenden h- und h + Zellen unterschiedliche Fluorophore exprimieren, so daß die zwei Zelltypen unterschieden werden können. Verwenden Sie eine beliebige genetisch kodierte fluorophowieder als cytosolische Version oder Fusion an ein endogenes Protein exprimiert, obwohl wir mit sfGFP guten Erfolg gehabt haben, eine schnelle Faltungs Variante von GFP 17. Endogene Proteine werden in der Regel an ihren endogenen genomischen Locus durch homologe Rekombination 14 markiert.
- Für homothallischen Stämmen exprimieren, jeweils eine genetisch kodierte cytosolischen fluoreszierendes Protein unter der Kontrolle des Paarungstyp spezifischen Promotoren , wie jene der Pheromon - Rezeptor - Gene map3 und MAM2 die Expression in P und M - Zellen zu treiben. Die Promotoren von map3 und MAM2 inaktiv sind während des vegetativen Wachstums und zeichnen sich bei Stickstoffmangel 18,19 induziert. Konstrukten Antreiben der Expression der cytosolischen GFP oder mCherry unter der Kontrolle dieser Promotoren werden typischerweise in einer genomischen Locus (ura4, leu1) integriert ist, die nicht mit dem normalen Verlauf des Sexuallebens Zyklus 12 nicht stört.
4. Quantifizierung der Paarung und Fusion Effizienzen
- Paarung und Fusionseffizienzen 11,12, Spot - Zellen direkt nach der MSL-N waschen auf MSL-N Agarose - Pads, wie in Schritt 2.3.1 oben, und lassen Sie für 24 Stunden bei 25 ° C vor der Bildgebung (Abbildung 1A) zu quantifizieren. Unter Verwendung dieses Protokolls ein homothallisch Wildtyp-Stamm Paarungseffizienz ~ 60% und Fusionseffizienz von 99% erreicht. Um zu testen, ob eine Reduzierung dieser in mutierten Stämmen beobachteten Werte spiegeln ein Terminal Phänotyp oder eine Verzögerung, wiederholen Sie den Versuch mit einer 36 Stunden Inkubationszeit.
- Berechnen Paarungseffizienz als
Mating Paare umfassen Zygoten, Asci, und nicht fusionierten Zellpaare identifiziert ausihre Position und das Wachstum gegenüber der jeweils anderen. - Berechnen Fusionseffizienz als
Anmerkung: Fused Paarungspaare durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, Sporen zu bilden, wenn bekannt ist, dass die Mutante zu untersuch nicht Sporulation nicht beeinflusst. Wenn Sporulation nicht als Auslesen verwendet werden, Fusion wird durch die Beobachtung der Ausbreitung eines cytosolischen Marker in nur einem Paarungspartner in die beiden Partner bestimmt.
Mating Paare umfassen Zygoten, Asci, und nicht fusionierten Zellpaare identifiziert ausihre Position und das Wachstum gegenüber der jeweils anderen. 
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Representative Results
Fission Yeast Wachstum und Mating Dynamics nach der Entfernung einer Stickstoffquelle
Als Stickstoffmangel eine Voraussetzung für die Einleitung der sexuellen Fortpflanzung in Spalthefe ist, wurde Wildtyp homothallisch H90 - Stamm bei Verschiebung von stickstoffreichen bis 1 Stickstoff entzogen Medium (Abbildung 2), nach dem Protokoll skizziert in Abbildung überwacht. Kurz gesagt, Zellen O / N wurden auf exponentiellen Phase gezüchtet (OD 600 = 0,5) in MSL + N - Medium, gesammelt, gewaschen und in MSL-N flüssigen Medium bis zur endgültigen OD 600 = 1,5 resuspendiert. Alle 2 Stunden Aliquots von Zellen wurden Calcofluor-gefärbt und abgebildet (2A - D).
Calcofluor - Färbung (2A) gezeigt , dass in stickstoffreichen Medium ~ 21% der Zellen wurden septating (n> 300, Figur 2B) , und dass die durchschnittliche Zellenlänge bei Division betrug 15,2 ± 1,4 & mgr; m (n = 50, 2C). Nicht teilende Zellen zeigte eine breite Verteilung der Zelllängen (8-14 & mgr; m; n> 200, 2D). Jedoch zwei Stunden nach der Verschiebung zu MSL-N Medium gab es eine drastische Änderung in der Längenverteilung von nicht teilende Zellen mit mehr als 60% der Zellen kürzer als 9 & mgr; m (n> 200, 2D). Zelle Septierung wurde auch bei der reduzierten Länge von 9,8 ± 0,8 & mgr; m (n = 50, 2A, 2C) detektiert. Eine weitere Reduzierung der Länge von sowohl nicht-Unterteilungs- und sich teilende Zellen wurde auch als die Zeit beobachtet, in MSL-N erhöht. Tatsächlich nach 8 Stunden die Septierung Index der Kultur verringert unter 2% (n> 300) und über 85% der Zellen verhaftet ihren Zellzyklus bei Längen von weniger als 7 & mgr; m (n> 200, 2D).
Die Zellen begannen Paare vier Stunden nach der Umstellung auf flüssige MSL-N zu bilden PaarungMedium (<1%, 2A). Anschließend wird die Anzahl der passenden Paare schnell erhöht und 8 Stunden nach der Schicht 10% der Zellen einen Paarungspartner Eingriff (n> 200, 2B).
Zur Paarungs Dynamik, 6 Stunden nach der Induktion Verhungern, ein Aliquot der Zellen wurde auch auf MSL-N Agarose-Pad angebracht zur Bildgebung überwachen. Die Zellen unterzog shmooing, Fusion und Sporulation (Abbildung 2E, 2F) in der darauffolgenden 21 Stunden ohne ersichtlichen Synchronität (Movie S1). Der Gegenwirkungsgrad auf der relativen Position und die Dichte der Zellen in einem gegebenen Sichtfeld abhing, mit mehr als 60% der Zellen in Eingriff , wenn ein Partner in einer Monoschicht (2G und Film - S1) dicht angeordnet sind .
Die Wildtyp - heterothallisch h + und h- Spalthefe Stämme wurden auch mit einem dem gleichen Protokoll unterworfenn zusätzlichen Schritt h + und h- Zellen in einer Eins-zu-Eins - Verhältnis zum Zeitpunkt der Stickstoffentfernung zu vermischen. Ähnliche Hunger und Paarungs Dynamik beobachtet, aber die Paarungseffizienz war etwas niedriger (2G, Film S2).
Überwachung Dynamik von fluoreszenz markierten Proteine in Mating Spalthefezellen
Um die Dynamik von Typ-V - Myosin Myo52 (Ref 20) in passenden Zellen überwachen, exponentiell h- Zellen gezüchtet Myo52-3GFP vom nativen Locus exprimieren , wurden gemischt mit h + Zellen Myo52-tdTomato ähnlich exprimierenden sowie cytosolischen GFP vom P -Zell spezifischen map3 Promotor. Die Zellsuspension wurde gewaschen, verdünnt in MSL-N-Medium versetzt und 6 h bei 30 ºC, 200 Upm vor der Montage Zellen auf MSL-N Agarose-Pads für O / N-Bildgebung bei 10 min Intervallen inkubiert.
Wie bereits berichtet 11,12 Myo52 zunächst gebildeten dynamischen Zonen in der Zelle Kortex (3A, Pfeilspitzen und Film - S3). Myo52 Signal wurde dann stabilisiert (3A, Pfeile und Film - S3) in einem einzigen Fokus unmittelbar vor dem Fusionsereignis, das durch die Übertragung des cytosolischen GFP - Signal von dem H + in die h- Zelle (3A und Film - S3) visualisiert . Das Myo52-tdTomato Signal könnte auch an der Fusions Hals während seiner Expansion beobachtet werden , aber keine wahrnehmbaren Signal war offensichtlich , da die Zygote Sporulation (3A und Film - S3) fort.
Überwachung des Verhaltens von heterothallisch Spalthefezellen Exposed Externe Pheromone
Heterothallisch h- Zellen die Sxa2 Protease fehlt , die P-Faktor für Desensibilisierung degradiert leicht zu synthetischen P-Faktor reagieren. Ein h- sxa2Δ Stamm, SCD2-GFP als Marker für aktive Cdc42 11 wurde in MSL + N - Medium gezüchtet exprimieren, entsprechend dem beschriebenen Protokoll. Zellen wurden in MSL-N-Medium inokuliert und 4 Stunden bei 30 ºC gewaschen. MSL-N Agarose pads Methanol (Daten nicht gezeigt) enthält, 0,1 & mgr; g / ml (niedriger Pheromon, 3B) oder 1 & mgr; g / ml (hohe Pheromon, 3C) des P-Faktor wurden hergestellt, geschnitten und auf einem neuen Folie positioniert Mini-Pads mit unterschiedlichen Pheromon Mengen zu erzeugen. 0,5 & mgr; l der Zellsuspension wurde für O / N-Bildgebung in 5 min Intervallen auf jedes Mini-Pads angebracht.
In Übereinstimmung mit den veröffentlichten Ergebnissen 11, niedrige P-Faktor Ebenen gefördert , die Bildung von dynamischen SCD2 Zonen ohne Wachstum (3B, Film S4), während ein hohes Maß an P-Faktor eine einzelne SCD2 Zone stabilisiert, so shmoo Dehnung von einer Zelle Pol induziert (Fild 3C, Film S5).
Abbildung 1:.. Schematische Darstellung des Protokolls (A) Schematische Darstellung der verwendeten Protokolle Spalthefe sexuellen Lebenszyklus und (B) zu Spalthefe Proben für die langfristige Bildgebung vorbereiten zu überwachen Bitte klicken hier , um eine größere Version dieser Figur .
Abbildung 2:. Wachstum und Mating Dynamik Spalthefezellen Verschobene von MSL + N auf MSL-N Medien (A) Epifluoreszenz mikroskopische Aufnahmen von Calcofluor-gefärbten Zellen verschoben MSL-N Medien für die angegebenen Zeiträume. (B) Prozentvon septating (dunkelblaue Linie, n> 300 pro Zeitpunkt) und Paarung (hellblaue Linie, n> 300 pro Zeitpunkt) verschobenen Zellen zu MSL-N Medien für die angegebenen Zeiträume. (C) Durchschnittliche Länge der septating Zellen verschoben MSL-N Medien für die angegebenen Zeiträume (n = 50 pro Zeitpunkt außer 8 hr Zeitpunkt , wo n = 20). (D) Länge Verteilung von nicht-teil verschobenen Zellen zu MSL-N - Medium für die angegebenen Zeiträume (n> 200 pro Zeitpunkt). (E) Durchschnittliche Fraktion nichtfusionierter (dunkelblaue Linie) fusioniert (hellblaue Linie) und sporulierendem (schwarze Linie) Zellen in einer Population von H90 Wildtyp - Hefe verschoben MSL-N Medien für die angegebenen Zeiträume und Zum Zeitpunkt 6 h (n> 900 Zellen pro Zeitpunkt aus drei verschiedenen Zeitraffer) auf einem Agar-Pad angebracht. Die Zellen wurden fusioniert betrachtet, wenn keine Brechungszellwand zwischen den Partnern in den DIC Mikroskopische Aufnahmen und die Bildung von Sporen Zellwand sichtbar war verwendet wurde sp punktenorulating Zellen. (F) DIC Mikroskopische Aufnahmen von zusammenpassenden Zellen verschoben MSL-N Medien für die angegebenen Zeiträume. (G) Mating Effizienz als Funktion der Zelldichte auf Agarose - Pads für H90 (dunkelblaue Punkte) und h + / h- (hellblaue Punkte) verschobenen Zellen zu MSL-N Medien für 24 Stunden. Die am besten geeignete Dichte der Zellen für die Langzeit Bildgebung wird auf etwa 25.000 Zellen / mm 2 erreicht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Dynamische Lokalisierung von Fluoreszierende Proteine während Fission Yeast Mating (A) entfalteten einzigen z-Ebene Epifluoreszenz- mikroskopische Aufnahmen von Zellen mit den angegebenen Genotypen verlagerte sich von MSL + N auf MSL-N Medien für 6 Stunden und montiert aufMSL-N Agarose-Pad für die angegebene Zeit. Pfeilspitzen zeigen dynamische Myo52-3GFP Zonen und der Pfeil weist darauf hin, Myo52 Lokalisation an der Fusions Fokus. (B), (C) entfalteten einzigen z-Ebene Epifluoreszenz- mikroskopische Aufnahmen von Zellen mit angegebenen Genotypen verlagerte sich von MSL + N auf MSL-N Medien für 4 Stunden und montiert auf MSL-N Agarose - Mini-Pads , die 0,1 ug / ml (B) oder 1 & mgr; g / ml (C) des P-Faktor für die angegebene Zeit. Pfeilspitzen zeigen dynamische (B) oder stabil (C) SCD2-GFP - Zonen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Supplemental Film 1: DIC Timelapse von Wildtyp - H90 Spalthefe ce lls , die waren Stickstoff verhungert für 6 Stunden vor der Bildgebung. (rechts zum Download anklicken).
Supplemental Movie 2: . DIC Timelapse von Wildtyp - h + und h- Spalthefezellen , die für 6 Stunden vor der Bildgebung gemischt und Stickstoff verhungert waren (Rechtsklick zum Download).
"> Supplemental Movie 3: entfalteten einzigen z-Ebene Epifluoreszenz und DIC Timelapse h- Zellen Myo52-3GFP vom nativen Locus exprimieren , gemischt mit h + exprimierenden Zellen Myo52-tdTomato vom nativen Locus und cytosolischen GFP aus der P-Zell - spezifischen Promotor map3 . die Zellen in MSL-N - Medium für 6 Stunden bei 30 ° C vor der Bildgebung angebaut wurden. Übertragung von cytosolischen GFP in die h- Zelle definiert die Schweißzeit. (rechts zum Download anklicken).
Supplemental Film 4: entfalteten einzigen z-Ebene Epifluoreszenz und DIC Timelapse h- sxa2 Zellen expRessing SCD2-GFP von seinem nativen Promotor mit 0,1 ug / ml P-Faktor behandelt. Die Zellen in MSL-N - Medium bei 30 ºC vor der Abbildung 4 Stunden gezüchtet wurden. (rechts zum Download anklicken).
Supplemental Film 5: . Entfalteten einzigen z-Ebene Epifluoreszenz und DIC Timelapse h- sxa2 Zellen SCD2-GFP von seinem nativen Promotor behandelt mit 1 & mgr; g / ml P-Faktor - Zellen wurden bei 30 ºC in MSL-N - Medium für 4 Stunden gezüchtet exprimierenden vor der Belichtung. (klicken zum rechten herunterladen).
| YSM995 | h- Gew |
| YSM1371 | h + wt |
| YSM 1396 | H90 Gew |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX PMAP3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | h- SCD2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
Tabelle S1: Dehnungen in dieser Studie verwendet.
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Discussion
Umweltbedingungen und Nährstoffverfügbarkeit insbesondere beeinflussen stark die Spalthefe Physiologie. Stickstoffmangel ist notwendig , um Engagement für die sexuelle Fortpflanzung und zunächst führt zu spektakulären Veränderungen in der mitotischen Zellzyklus - Progression (Ref. 21 und Abbildung 2). Bei Stickstoffentfernung aus exponentiell wachsenden Bevölkerung, bei Teilung der Zellgröße schnell abnimmt (2C) und die Mehrzahl der Zellen verhaften mitotischen Progression kürzer als die Länge der neu geboren exponentiell gewachsenen Zellen (Ref. 21 und 2D). Da Zellen von entgegengesetzten Paarungstypen mitotischen Progression verhaften engagieren sie Partner und gehen Sie zu bilden Zygoten und sporulieren (2B, 2E, 2F) Paarung. In dem Fall einer zweidimensionalen Monoschicht von Wildtyp- Zellen, mehr als sechzig Prozent der H90 - Zellen werden einen Partner greifen und fast alle Zellfusion (Figur 2G wird unterziehen (2G). Einer der kritischsten Aspekte des Protokolls hohe Steckeffizienzen zu erhalten, ist zu gewährleisten, dass die Zellen innerhalb der angegebenen Dichten im gesamten gehalten werden. Überwachung der Zellgröße und Parameter Paarungseffizienz wie in Abbildung 2 gezeigt , dann ist eine einfache Steuerung , die Zellen effizient sexuelle Fortpflanzung eintreten.
Wir stellen fest , dass, da jede Stickstoffquelle Medium Mangel Paarung (auch geringe Mengen an Aminosäuren und Stickstoffbasen sind ausgeschlossen), hohe Paarungseffizienz , wie sie dargestellt in 2E und 2G sind nur mit voll prototrophes Stämmen erhalten. Auxotrophe Stämme können verwendet werden, jedoch erfordern zusätzliche Sorgfalt, um sicherzustellen, dass Zellen jederzeit innerhalb der Zelldichten in dem Protokoll angegeben, gehalten werden. Auch mit Sorgfalt, nurgeringere Paarungseffizienzen werden beobachtet. Paarungseffizienz wird auch durch die Temperatur, wobei niedrigere Wirkungsgrade bei erhöhter Temperatur beobachtet beeinflusst, was die Verwendung von temperaturempfindlichen mutierten Allelen während des Paarungsprozesses begrenzen.
Das hier vorgestellte Verfahren ist für die Langzeitabbildungs fluoreszierender Reporter eingesetzt. Da Bildgebung über langen Zeitraum durchgeführt wird, erfolgreiche Abbildung von Paarungs Spalthefe ist stark abhängig von der Mikroskopie-Setup zur Verfügung. Hierzu wird die Stabilität des Mikroskopaufbau, dessen Empfindlichkeit und Zugang zu einem Autofokus-System kritisch sind. Entweder softwarebasierte oder eingebaute Hardware-Autofokus-Systeme sind möglich. Darüber hinaus den Durchsatz zu erhöhen, ein motorisiertes stufigen Zustimmtmehr Akquisition ist ein weiterer wichtiger Qualitäts.
Bildqualität wird durch die Eigenschaften des Fluorophors von Interesse beschränkt. Die unterschiedlichen Inkubationszeiten in flüssigem MSL-N-Medium ausführlich in Protocol Abschnitt 2.3 werden bei der Optimierung Fluoreszenz auf Pheromon-induzierten markierten Proteine und minimiert unnötige Bleichen soll durch die Abbildung nur Paarung Stufen von Interesse. Während reichlich vorhanden oder stark focalized fluoreszierend markierten Proteine Erwerb von Hunderten von Zeitpunkten über den Verlauf des gesamten sexuellen Lebenszyklus (Movie S3) ermöglichen, sind andere Proteine zu Bild über so lange Zeit aufgrund Photobleaching herausfordernd. Die Bildqualität hängt auch von dem gewählten Fluorophor, typischerweise ein GFP-Derivat. Wir beobachteten immer wieder , dass sfGFP 17 (Super GFP), die mit einer schnellen Kinetik faltet, überlegene Signal während der Paarungsprozess vorgesehen, möglicherweise , weil starke Autophagie schnelle Proteinumsatz induziert. Wichtig war, wir die Verfügbarkeit von Sauerstoff 17,22 notwendig für fluoreszierendes Protein Reifung nicht überwachen. Daher ist es empfehlenswert, sich mit der Fluoreszenzmessungen, vorsichtig zu sein, um die Mengen an Proteinen nach Zellen exprimiert zu quantifizieren sind mounted auf Folien oder alternative Sauerstoff-Geräte durchlässig Mikrofluidik zu verwenden, um solche Experimente durchzuführen. Zusätzlich Agarose pads mit Zellen in den Abend getupft und gehalten bei 18 ºC O / N wurden dem Bild schwach Reportern sehr nützlich als solche pads eine Mischung von Zellen in jeder Phase des sexuellen Fortpflanzung enthalten.
Mating in Spalthefe ausstellen nicht Synchronie und Zellen leicht shmooing sehen ist Initiieren neben anderen Zellen bereits sporulierende (Filme S1, S2). Solche Populationsdynamik macht klassische, bulk biochemischen Techniken schwierig zu verwenden, beschrieben einzelne Zellmikroskopie macht hier eine Methode der Wahl. Alle Mikroskopie basierte Ansätze in Prinzip kann auf Zellen mit dem Protokoll hier beschrieben hergestellt angewendet werden. Wichtig ist , dass diese Ansätze Prozesse überwachen , die 12 von Dudin und Kollegen typspezifische Dynamik wie Zell-Zell - Fusion beschrieben aufweisen Paarung. Asymmetrie, Paarungstyp Reportern zu überwachenBesonders bewährt haben sich (3A). Die Unterscheidung zwischen den beiden Paarungstypen leicht erreicht wird, wenn sie mit heterothallisch Stämmen durch den Einsatz unterschiedliche Fluorophore Arbeits Proteine in der h- zu markieren , und h + Zellen. Dies ist jedoch für die homothallischen Stämmen nicht durchführbar. Ein Ansatz entwickelt , um den Paarungstyp von H90 Zellen zu differenzieren ist cytosolischen fluoreszierende Proteine unter der Kontrolle der Paarungstyp spezifischen Promotoren zu exprimieren. Insbesondere wurden die Promotoren der Pheromon - Rezeptorgene map3 und MAM2 verwendet jeweils die Expression von GFP oder mCherry Proteine in P und M - Zellen zu fahren. Darüber hinaus erlaubt diese Marker präzise Timing der Zell-Zell-Fusion, wie die Übertragung von Fluoreszenzsignals von einer Partnerzelle zur anderen visualisiert.
Mating Pheromone sind entscheidende Faktoren für Fortschritte durch verschiedene Stadien der sexuellen Fortpflanzung in Hefe 11,23. Auf verschiedenen Ebenen von synthetischen Pheromon führen zu unterschiedlichen Zellpolarisationszustände in Spalthefe (3B, 3C und Ref. 11). Das Protokoll enthalten oben ermöglicht die Bewertung, wie verschiedene exogene Pheromon Ebenen Zellphysiologie beeinflussen. Da die Pheromon-Protease Sxa2 schnell abbaut P-Faktor, ein heterothallisch Mutantenstamm, wo die Protease gelöscht wurde verwendet, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. in Mischungen von Zellen entgegengesetzter Paarungstypen jedoch nicht nur das Niveau, sondern auch die räumliche Verteilung der Pheromone von einem Paarungspartner emittiert werden, sind wahrscheinlich wichtig. Die Analyse der Auswirkungen von Pheromonen räumlichen Verteilung auf Zellantwort wird Entwicklung anspruchsvollerer Setups erfordern wie Mikrofluidik - Geräte auf knospende eingesetzt Hefe 24,25.
Zusammenfassend stellen wir eine grundlegende Methode zur Langzeit Mikroskopie des sexuellen Lebenszyklus von Spalthefe. Kleinere Anpassungen dieses Protokoll erlauben research konzentrieren sich auf die zellulären Reaktionen auf verschiedene Phasen des sexuellen Lebenszyklus. diesen Ansatz mit einzelnen Zellbiochemie Werkzeuge und Mikrofluidik-Geräte Kombination wird weiter Spalthefe sexuelle Fortpflanzung als ein leistungsfähiges Modellsystem zu fördern.
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Acknowledgments
AV wurde durch ein EMBO langfristigen Postdoc-Stipendium unterstützt. Die Forschung im Labor Martin wird durch einen ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) und einer Schweizerischen National Science Foundation Grant (31003A_155944) zu SGM finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
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