Introduction
Även genetiskt utbyte mellan två celler är den centrala händelsen i sexuell reproduktion, bygger det på en kedja av händelser som främjar celldifferentiering, tillåter partner val, utföra cellcellfusion och upprätthålla genomisk stabilitet. Således sexuell livscykel presenterar sig som ett modellsystem för att studera ett antal biologiska frågor kring utvecklings växlar, svar på yttre stimuli, plasmamembranfusion, kromosomsegregation, etc. utforska fissionsjäst sexuella cykeln för att studera dessa fenomen ger fördelarna med modellsystem kraftfulla genetik, väletablerade hög genomströmning metoder och avancerad mikroskopi. Sex i fissionsjäst är en hetero händelse mellan en P-cell och en M-cell distinkta parningstyper. De två celltyper differentiellt uttrycka ett antal gener 1,2 inklusive sådana för produktion av den utsöndrade P- och M-feromoner, feromonreceptorer Map3 och Mam2 samt feromon-proteaSES Sxa1 och Sxa2. Homotalliska stammar, såsom den vanligen använda h90-stam, bär den genetiska informationen för båda parningstyper i en enda genomet och cellerna genomgår ett komplext mönster av parningstyp omkoppling genom hela den mitotiska livscykel (översikt i ref. 3). Flera isolat av heterotallism fissionsjäst som sällan eller aldrig byta parning typ används också ofta 4, framförallt H + N (P-typ) och h -S (M-typ) stammar.
I fissionsjäst är inträde i den sexuella livscykel under strikt närings reglering. Endast kväve svalt klyvningsjästceller gripa mitotisk reproduktion och producerar diffunderbara feromoner för att signalera närvaron av en passande partner och främja ytterligare steg i den sexuella cykeln (översikt i ref. 5). Kvävebrist de-undertrycker nyckeltranskriptionsregulator för parning Ste11 som fungerar som en utvecklings switch och främjar eXpression av parning specifika gener inklusive feromonreceptorn och feromonproduktionsgener 6,7. Feromon-receptor engagemang aktiverar receptor kopplat protein G-alfa och nedströms MAPK signaleringen vilket ytterligare förbättrar Ste11 transkriptionsaktivitet 8-10, vilket ökar feromonproduktion i en positiv feedback mellan parningspartner. Feromonnivåer är avgörande för att framkalla olika cellpolariseringstillstånd genom att reglera huvudarrangören av cell polaritet, Rho-familjen GTPas Cdc42 11. Vid exponering för låga feromon koncentrationer är aktiv Cdc42 visualiseras i dynamiska fläckar utforska cell periferi, och ingen celltillväxt observeras i detta skede. Ökade feromonnivåerna främja stabiliseringen av Cdc42 verksamhet till en enda zon och tillväxt av en polariserad projektion, benämnd shmoo, som ger partnerceller i kontakt. Därefter de två haploida passande partners smälter för att bilda en diploid zygot. Senaste arbete visar the förekomsten av en ny aktin struktur nödvändig för fusion som sätts samman genom parning-inducerad formin FUS1 12. Detta fusions fokus koncentrerar typ-V myosin beroende processer och positionerar maskiner och cellväggsnedbrytning, vilket möjliggör ombyggnad av cellväggen för att tillåta plasmamembrankontakt utan cellys 12. Vid cell-cellfusion, kärnorna kommer i kontakt och genomgå karyogamy. En framstående dynein beroende back-och-tillbaka rörelse av kärnan i den zygot (hästsvans rörelse) främjar då hopkopplingen av kromosomhomologer 13,14, vilket följs av meios. Slutligen, de fyra produkter av meios förpackas i enskilda sporer under sporulering.
På grund av sin komplexitet och de många stegen har detaljerad kontroll av parning varit utmanande. Två anmärkningsvärda svårigheter är att hela processen tar väl över femton timmar och att cellerna är svåra att synkronisera. dessa difficulties kringgås av encelliga mikroskopi metoder. Här en allmän protokoll för att undersöka sexuell livscykel i fissionsjäst presenteras. Med smärre justeringar, medger detta protokoll studiet av alla de olika stegen i processen, nämligen induktionen av parnings genprodukten, cell polarisering och parning mellan syster celler efter parning typ växling och mellan icke-syster partners, cell-cellfusion, och efter fusionen hästsvans rörelse, meios och sporulering. Denna metod gör det möjligt att 1) enkelt visualisera fluorescerande taggade proteiner tiden före, under och efter fusionen; 2) diskriminera beteendet hos celler av motsatt parningstyp; och 3) mått och kvantifiera parametrar såsom shmooing, parning, fusion eller sporulering effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mikroskopi analys av fissionsjäst sexuell reproduktion
1. Beredning av media
- Förbereda Minsta Sporulering medium (MSL-N) 15 genom att blanda följande komponenter: Glukos: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: 0,1 g / L, MgSO 4 · 7 H2O: 0,2 g / L. Lägg Spårelement (10000): 100 l / L, vitaminer (1,000x): 1 ml / L och 0,1 M CaCl2 ml / L. Filter sterilisera genom att använda en 0,22 um porstorlek filter och förvara vid rumstemperatur (RT).
- Använd följande Vitaminer (1,000x) lager: pantotenat: 1 g / L, nikotinsyra: 10 g / L, Inositol: 10 g / L, Biotin: 10 mg / L. Filter-sterilisera med användning av ett 0,22 ^ m porstorlek filter och förvara vid 4 ° C.
- Använd spårämnena (10000) lager: Borsyra: 5 g / L, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO 4 · 7 H2O: 4 g / L, FeCl2 · 6H 2 O: 2 g / L , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / L, CUSO4· 5H 2 O: 0,4 g / L, Citronsyra: 10 g / L. Filter-sterilisera med användning av ett 0,22 ^ m porstorlek filter och förvara vid 4 ° C.
- Förbered MSL-N Agarose 2% (används för att göra agarosen pad kammare) genom att kombinera 10 ml MSL-N med 0,2 g agaros. Smälta för ~ 2 minuter vid hög effekt i en mikrovågsugn tills agaros upplöses och delprov 0,5 ml i mikrocentrifugrör. Förvara vid RT.
- Förbereda Minsta Sporulering medium med kväve (MSL + N) från MSL-N genom tillsats av (NH4) 2 SO4: 1 g / L, leucin: 0,225 g / L, Adenin: 0,225 g / L, Uracil: 0,225 g / L . Filter-sterilisera med användning av ett 0,22 ^ m porstorlek filter. Förvara vid RT.
Notera: Leucin, adenin och uracil sättes till detta medium för att tillåta tillväxt av auxotrofa stammar. Ytterligare aminosyratillskott bör ingå om den använda stammen bär en tydlig auxotrofi (till exempel his3Δ). Observera även att arbetet med fullt prototrof stammar rekommenderas, eftersom endastsådana stammar ska medge en hög parning effektivitet. - Förbereda 200 ml valap för kammarförsegling. I en bägare till lika vikter av lanolin, vaselin (eller annan vaselin), och paraffin. Värmeblandningen vid låg temperatur och rör om då och då tills blandas grundligt. Alikvotera mixen i flera små petriskålar. Förvara vid RT.
2. Odling Fission jäststammar för parning Experiment (Figur 1).
- Dag 1, kväll:
Inokulera nyligen strimmig stammar från fasta medier i odlingsrör innehållande 3 ml MSL + N. Använd flatbottnade rör av ca 2,5 cm i diameter. Använd andra odlingsrör eller flaskor med anpassade odlingsvolym. Inkubera över natten (O / N) med skakning vid 25 ° C, 200 rpm. Om man arbetar med heterotallism stammar ympa separat.- Späd cellsuspensioner i medium följande morgon för att säkerställa att kulturer har optisk densitet mäts vid 600 nm (OD 600) av 0,4 till 0,8 på kvällen.
Notera:OD 600 mätningar som en skattning av cellkoncentration för fissionsjäst är linjär i området ca 0,1-1,0. För vår spektrofotometer OD 600 = 0,1 motsvarar 1,4 x 10 6 celler per ml. Således, om inledande OD 600 läser är utanför detta område prover måste spädas / koncentreras för tillförlitliga mätningar.
- Späd cellsuspensioner i medium följande morgon för att säkerställa att kulturer har optisk densitet mäts vid 600 nm (OD 600) av 0,4 till 0,8 på kvällen.
- Dag 2, kväll:
Späd celler i 20 ml MSL + N media till OD 600 = 0,025 i 100 ml kolvar. Inkubera stammar O / N vid 30 ° C, 200 rpm.
Obs: Vildtyp cellkulturer bör nå OD 600 ~ 0,8 följande morgon (15 timmar senare). Om man arbetar med stammar med längre generationstiden justera utspädning därefter. - Dag 3, morgon:
Mät OD 600 för att verifiera att kulturer har celldensitet av OD 600 ~ 0,8. Om man arbetar med heterotallism stammar, blanda lika många partnerceller. Pellets celler vid 1000 xg och överför till en 1,5 mlrör. Tvätta cellerna tre gånger i 1 ml MSL-N-medium. Återsuspendera celler i 3 ml MSL-N-medium och späd cellerna till OD 600 = 1,5.- Att övervaka parning mellan systerceller direkt montera celler för avbildning (se protokoll avsnitt 2.4). Använd homotallisk H90 stammar, där parning typ omkoppling kommer att äga rum under de mitotiska divisioner inträffar efter kvävebrist. Omedelbar montering av cellerna på agarosen pad säkerställer att, efter celldelning, syster-celler förblir intill varandra.
- Att övervaka cell polarisering (sonderande dynamik och shmooing) inkubera 1-3 ml cellkultur vid 30 ° C, 200 rpm under 3-4 timmar innan monterings celler för avbildning. Inom dessa 3-4 timmar, kommer den sista mitotiska division har inträffat. Några celler har inlett polarisering, men de flesta kommer bara att starta sina undersökande polariserings dynamik.
- Att övervaka cell-cellfusion inkubera 1-3 ml cellkultur vid 30 ° C, 200 rpm under 4-6 h prieller till monteringsceller för avbildning.
- Att övervaka post-fusionshändelser inkubera 1-3 ml cellkulturer vid 30 ° C, 200 rpm under 8 h före montering celler för avbildning.
- Att övervaka svar till en specifik feromon koncentration (endast för heterotallism stammar) inkubera 3 ml cellkultur vid 30 ° C, 200 rpm under 3-4 h före montering celler för avbildning.
- Ta bort MSL-N-innehållande mikrocentrifugrör från 95 ° C värmeblock (se protokoll avsnitt 2.4.1. Nedan). Lägg P-faktor eller M-faktor vid den önskade koncentrationen direkt i den smälta MSL-N agaros. Blanda väl genom att vortexa innan omedelbar pad förberedelse.
- Efter cellmontering, inkubera dynan under 15-30 minuter vid 25 ° C före avbildning. P-faktor och M-faktorferomoner användes från en förrådslösning av 1 mg / ml i metanol.
Obs: Om man arbetar med mutant stammar inkubationstider kan variera. Hopklumpning av celler kan uppstå efter långvarig inkubation i flytande media och kan vara särskilt stark i vissa mutantstammar. Hopklumpade celler kan inte fläckas på agaros dynor i ett enda lager och är således svåra att autofokus och bild. Vid omfattande cellklumpning montera celler på agaros kuddar omedelbart efter tvättar och åter suspension i kvävebristande medie (som i protokollet avsnitt 2.3.1.) Och inkubera dem vid 30 ° C före avbildning.
- Monterings celler för Imaging:
- Förbered MSL-N agaros kuddar 16 genom att smälta en delmängd i en 95 ° C värmeblock för 10-15 minuter och tillsätta 200 pl mellan två glasskivor åtskilda av distanser (Figur 1B). Använda distanselement med en tjocklek av ~ 0,5 mm. För att göra distansorgan, använda remsor skärs ut av kartong, som den som levereras med restriktionsenzymer.
- Pellets 100 pl celler vid 1000 xg under 1 minut, avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i resterande 2-4 il medium. INTE återsuspendera i färskt medium som det fördröjerparning.
- Efter 2-3 minuter försiktigt bort distanser och den övre glasskiva. Om flera stammar skall monteras, förbereda cellen koncentrerar innan förbereda agarosen pad.
- Tillsätt 1 l av celler till dynan och vänta tills droppen börjar torka (~ 1 minut) innan du täcker med täckglas och tätning med valap.
- Låt dynan stå under åtminstone 30 minuter innan avbildning vid 25 ° C eller RT.
- För att erhålla en blandning av celler i olika stadier av parning, göra en dyna omedelbart efter tvättar i MSL-N (se avsnitt 2.3.) Och inkubera vid 18 ° CO / N (~ 15 timmar). Detta tillvägagångssätt är användbart för avbildning celler vid olika parningssteg med hög temporal upplösning eller prover med svag signal.
3. Levande cell imaging av parning jästceller
- Justera bildupptagningsinställningar.
Obs: bilden förvärvet inställningar som presenteras här har optimerats för Deltavision expertpanel med en anpassad Olympus IX-71inverterat mikroskop med Plan Apo 60X / 1,42 NA eller U-Plan Apo 100X / 1,4 NA mål, en CoolSNAP HQ2 kamera och en Insight SSI 7 färg kombinerade enheten belysnings. Hårdvaran kontrolleras av softWoRx v4.1.2 som också möjliggör digital autofokus.- Säkerställa att autofokusintervallen inte överstiger 15 min, eftersom Z-drift över längre tid kan överträffa kapaciteten av programvaran autofokussystem. Vid användning av en hårdvarubaserad autofokussystem, använda större intervaller.
- Justera imaging intervallet. Ta bilder varje 10 min för ~ 15 timmar som en utgångspunkt när man arbetar med en fluorescerande taggade protein för första gången. Detta intervall ger en god överblick över hela parningsprocessen utan omfattande blekning.
- Bild med 5 minuters intervaller eller kortare att mer exakt tids händelser såsom fusion. Kortare intervall kräver starka fluoroforer möjliggör låga exponeringstider och lite blekning. För avbildning med intervall under en minut undvika O / N mikroskopioch istället förbereda en blandning av alla parningssteg som beskrivs i protokoll avsnitt 2.4.6.
- Justera bildexponeringstiden. Test exponeringstider mellan 50 och 300 ms. Sträva efter att hitta en balans mellan den signal-brusförhållande och fotoblekning för att uppnå ett stort antal tidpunkter med en urskiljbar signal (typiskt över 100).
- Justera Z-sektionering. Sektioner var 0,3 um omfattar 5 um ger en bra bilddjupet. Observera att Z-sektionering ökar ytterligare foto skador, som kan minimeras genom att använda OAI (optiska axeln integration - en enda svep förvärv av hela provet djup). Bra autofokus systemet minskar behovet av många Z-profiler och rekommenderas starkt.
- Tips för att studera Mating typ specifika beteenden:
- För heterotallism stammar, använd h- och h + celler som uttrycker distinkta fluoroforer, så att de två celltyper kan urskiljas. Använd någon genetiskt kodade fluorophore uttryckt som ett cytosoliskt version eller fusion till ett endogent protein, även om vi har haft god framgång med sfGFP, en snabbt hopfällbar variant av GFP 17. Endogena proteiner är vanligtvis märkta på deras endogena genom locus genom homolog rekombination 14.
- För homotalliska stammar, uttrycker en genetiskt kodad cytosoliskt fluorescerande protein under kontroll av parningen typspecifika promotorer såsom de av de feromonreceptorgener map3 och mam2 för att driva expression i P och M-celler, respektive. Främjare av map3 och mam2 är inaktiva under vegetativ tillväxt och induceras vid kväve svält 18,19. Konstruktioner som driver uttryck av cytosoliskt GFP eller mCherry under kontroll av dessa promotorer är vanligtvis integrerade i en genomisk locus (ura4, Leu1) som inte stör den normala utvecklingen av den sexuella livscykel 12.
4. Kvantifiering av parning och Fusion Efficiencies
- För att kvantifiera parning och fusionseffektivitet 11,12, spotceller direkt efter MSL-N tvätta på MSL-N agaros kuddar, som i steg 2.3.1 ovan, och låt stå i 24 timmar vid 25 ° C före avbildning (Figur 1A). Med hjälp av detta protokoll en homotallisk vildtypstam parning effektivitet når ~ 60% och fusionseffektivitet 99%. För att testa om någon sänkning av dessa värden som observerades i mutantstammarna återspeglar en terminal fenotyp eller en försening, upprepa experimentet med en 36 h inkubationstid.
- Beräkna parning effektivitet som
Parningsspar innefattar zygoter, ASCI och icke sammansmälta cell par identifierats frånsin position och tillväxt mot varandra. - Beräkna fusionseffektivitet som
Notera: Sammansmälta hoppassande paren identifieras genom deras förmåga att bilda sporer, om det är känt att mutanten som studeras inte påverkar sporulering. Om sporulering inte kan användas som utläsning är fusion bestäms genom att observera spridningen av ett cytosoliskt markör uttryckt i endast en passande partner till båda parter.
Parningsspar innefattar zygoter, ASCI och icke sammansmälta cell par identifierats frånsin position och tillväxt mot varandra. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fission jäst tillväxt och parning Dynamics vid avlägsnande av en kvävekälla
Kväve svält är en förutsättning för initiering av sexuell reproduktion i fissionsjäst ades vildtyp homotallisk h90 stam övervakas vid övergången från kväverik till kväve-berövade medium (Figur 2), efter det protokoll som beskrivs i figur 1. I korthet celler odlades O / N till exponentiella fasen (OD 600 = 0,5) i MSL + N-medium, uppsamlades, tvättades och åter-suspenderades i MSL-N flytande medium till slutlig OD 600 = 1,5. Varje 2 tim portioner av celler var kalkofluor-färgade och avbildas (Figur 2A - D).
Kalkofluor-färgning (figur 2A) avslöjade att i kväve-rikt medium ~ 21% av cellerna septating (n> 300, figur 2B), och att medelcell längd vid divisionen var 15,2 ± 1,4 pm (n = 50, figur 2C). Icke-delande celler visade en bred fördelning av cell längder (8-14 m; n> 200, figur 2D). Men två timmar efter övergången till MSL-N-medium fanns en drastisk förändring i längdfördelningen av icke-delande celler, med över 60% av cellerna är kortare än 9 pm (n> 200, figur 2D). Cell septumbildning detekterades också vid den reducerade längden på 9,8 ± 0,8 m (n = 50, figur 2A, 2C). En ytterligare minskning i längd av både icke-delande och delande celler observerades också, som tiden i MSL-N ökat. Ja, efter 8 timmar den septumbildning index av kulturen sjunkit under 2% (n> 300) och över 85% av cellerna arrested deras cellcykeln vid längder kortare än 7 | j, m (n> 200, figur 2D).
Celler började bildas parning par fyra timmar efter övergången till flytande MSL-Nmedium (<1%, Figur 2A). Därefter antalet samverkande par snabbt ökat och 8 h efter övergången 10% av cellerna i ingrepp en passande partner (n> 200, figur 2B).
Att övervaka parning dynamik, 6 h efter svält induktion, en alikvot av celler var också monterat på MSL-N agaros pad för avbildning. Celler genomgick shmooing, fusion och sporulering (figur 2E, 2F) i den efterföljande 21 timmar utan någon uppenbar synkront (Film S1). Parnings effektivitet beroende på den relativa positionen och densiteten av celler i ett givet synfält, med över 60% av cellerna engagerade en partner när placerad tätt i ett monolager (figur 2G och Film S1).
De vildtyp heterotallism h + och h- klyvning jäststammar utsattes också för samma protokoll med enn ytterligare steget att blanda h + och H-celler i en en-till-en-förhållande vid tidpunkten för kväverening. Liknande svält och parning dynamik observerades, men den passande effektiviteten var något lägre (figur 2G, film S2).
Övervakning Dynamics of fluorescerande taggade proteiner i parning Fission jästceller
Att övervaka dynamiken i typ-V myosin Myo52 (Ref 20) i parning celler, exponentiellt odlade H- celler som uttrycker Myo52-3GFP från infödda locus blandades med h + celler på samma sätt uttrycker Myo52-tdTomato, liksom cytosoliskt GFP från P -cell specifik map3 promotor. Cellsuspensionen tvättades, späddes i MSL-N-medium och inkuberades under 6 h vid 30 ° C, 200 varv per minut före monterings celler på MSL-N agaros kuddar för O / N bildåtergivning vid 10 minuters intervall.
Som tidigare rapporterats 11,12 Myo52 ursprungligen bildade dynamiska zoner hela cellen cortex (Figur 3A, pilspetsar och film S3). Myo52 signal sedan stabiliserades (Figur 3A, pilar och film S3) i ett enda fokus strax innan fusionen händelsen, som synliggjordes genom överföring av den cytosoliska GFP signalen från H + i h- cell (Figur 3A och film S3) . Den Myo52-tdTomato signal kan också observeras vid fusions halsen under sin expansion men ingen urskiljbar signal var tydlig zygoten fortsatte att sporulering (Figur 3A och film S3).
Övervaka beteendet hos heterotallism fissionsjäst celler exponerade för externa Feromoner
Heterotallism H- celler som saknar den Sxa2 proteas som bryter ned P-faktor för hyposensibilisering lätt svara på syntetisk P-faktor. en h- sxa2Δ stam, som uttrycker Scd2-GFP som en markör för aktiv Cdc42 11, odlades i MSL + N-medium, följaktligen till den beskrivna protokollet. Celler tvättades i MSL-N-medium och inkuberades under 4 h vid 30 ° C. MSL-N agaros kuddar innehållande metanol (data ej visade), 0,1 mikrogram / ml (låg feromon, Figur 3B) eller 1 mikrogram / ml (hög feromon, figur 3C) var av P-faktor beredd, klippa och placeras på en ny bild att generera mini-kuddar innehållande olika feromon mängder. 0,5 pl av cellsuspensionen var monterad på varje minidynor för O / N avbildning på 5 minuters intervall.
I överensstämmelse med publicerade resultat 11, låg P-faktornivåer främjade bildandet av dynamiska Scd2 zoner utan tillväxt (Figur 3B, film S4), medan höga halter av P-faktor stabiliserat en enda Scd2 zon, vilket medför en shmoo förlängning från en cell pol (Figure 3C, Movie S5).
Figur 1:.. Schematisk representation av protokollet (A) Schematisk beskrivning av de protokoll som används för att övervaka fissionsjäst sexuell livscykel och (B) för framställning av fission jästprover för långsiktig imaging Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 2:. Tillväxt och Parning Dynamics av fissionsjäst Celler skiftat från MSL + N till MSL-N media (A) epifluorescence mikrofotografier av kalkofluor-färgade celler skiftade till MSL-N media under de angivna tidsperioder. (B) Procentav septating (mörkblå linje, n> 300 per tidpunkt) och parning (ljusblå linje, n> 300 per tidpunkt) celler flyttas till MSL-N media för de angivna tidsperioder. (C) Genomsnittlig längd septating celler skiftat till MSL-N media under de angivna tidsperioder (n = 50 per tidpunkt utom 8 hr tidpunkt där n = 20). (D) Längd distribution av icke-delande celler flyttas till MSL-N medium för de angivna tidsperioder (n> 200 per tidpunkt). (E) Genomsnittlig fraktion av icke kondenserad (mörkblå linje), smält (ljusblå linje) och sporbildande (svart linje) celler i en population av H90 vildtyp jäst skiftade till MSL-N media för de angivna tidsperioder och monterad på en agar pad på tidpunkt 6 h (n> 900 celler per tidpunkt från tre olika timelapses). Cellerna ansågs smält när ingen brytningscellvägg mellan partners var synlig i DIC micrographs och bildandet av spor cellvägg användes för att göra mål för sporulating celler. (F) DIC mikrofotografier av hoppassande celler skiftat till MSL-N media under de angivna tidsperioder. (G) Parnings effektivitet som en funktion av celltätheten på agaros kuddar för H90 (mörk blå prickar) och H + / H- (ljusblå prickar) celler flyttas till MSL-N medier under 24 timmar. Den mest lämpliga tätheten av celler för långsiktig avbildning uppnås vid ca 25.000 celler / mm 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Dynamisk Lokalisering av fluorescerande proteiner under fissionsjäst Mating (A) dekonvolvering enstaka z-planet epifluorescence mikrofotografier av celler med de angivna genotyper skiftat från MSL + N till MSL-N media under 6 timmar och monteras påMSL-N agarosen pad under den angivna tiden. Pilspetsar indikerar dynamiska Myo52-3GFP zoner och pilen pekar ut Myo52 lokalisering vid fusions fokus. (B), (C) dekonvolvering enda z-plans epifluorescence mikrofotografier av celler med indikerade genotyper skiftat från MSL + N till MSL-N medier under 4 h och monteras på MSL-N agaros mini kuddar innehållande 0,1 | ig / ml (B) eller 1 | ig / ml (C) från P-faktorn för den angivna tiden. Pilspetsar indikerar dynamisk (B) eller stabila (C) Scd2-GFP zoner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Movie 1: DIC timelapse av vildtyp h90 fissionsjäst ce lls som var kväve svalt under 6 timmar före avbildning. (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande Movie 2: . DIC timelapse av vildtyp h + och H klyvningsjästceller som blandades och kväve svalt under 6 timmar före avbildning (Högerklicka för att ladda ner).
"> Kompletterande Movie 3: dekonvolvering enda z-planet epifluorescence och DIC Timelapse av H- celler som uttrycker Myo52-3GFP från den nativa locuset blandas med h + celler som uttrycker Myo52-tdTomato från den nativa locuset och cytosoliska GFP från P-cellspecifika map3 promotor . Celler odlades i MSL-N-medium under 6 h vid 30 ° C före avbildning. Överföring av cytosoliskt GFP i h- cell definierar smälttiden. (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande Movie 4: dekonvolvering enda z-plan epifluorescence och DIC Timelapse H- sxa2 celler expressing Scd2-GFP från dess nativa promotor som behandlats med 0,1 | j, g / ml P-faktor. Celler odlades i MSL-N-medium under 4 h vid 30 ° C innan avbildning. (höger klicka för att ladda ner).
Kompletterande Movie 5: . Dekonvolvering enda z-planet epifluorescence och DIC Timelapse av H- sxa2 celler som uttrycker Scd2-GFP från dess nativa promotor som behandlats med 1 | ig / ml P-faktor Celler odlades i MSL-N-medium under 4 h vid 30 ° C innan avbildning. (Högerklicka för att ladda ner).
| YSM995 | h- vikt- |
| YSM1371 | h + vikt |
| YSM 1396 | h90 wt |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX PMAP3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | h- scd2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
Tabell S1: stammar som användes i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miljöförhållanden och tillgången på näringsämnen i synnerhet starkt påverka fissionsjäst fysiologi. Kväve svält är nödvändigt för engagemang för sexuell reproduktion och initialt leder till stora förändringar i mitotiska cellcykelprogression (ref. 21 och Figur 2). Vid kväverening från exponentiellt växande befolkning, cellstorlek på division minskar snabbt (figur 2C) och majoriteten av celler gripa mitotiskt progression kortare än längden av nyfödda exponentiellt odlade celler (ref. 21 och figur 2D). Som celler av motsatta parningstyper gripa mitotiska progression de bedriver parning partner och fortsätt att bilda zygoter och sporer (Figur 2B, 2E, 2F). I fallet med en tvådimensionell monoskikt av vildtyp-celler, över sextio procent av H90-celler kommer att ingripa med en partner, och nästan alla kommer att genomgå cellfusion (figur 2G (figur 2G). En av de mest kritiska aspekterna av protokollet att erhålla höga parning effektivitet är att se till att celler hålls inom de angivna tätheterna i hela. Övervakning av cellstorlek och parning effektivitetsparametrar såsom visas i figur 2 tillhandahåller sedan en enkel kontroll att celler går in i sexuell reproduktion effektivt.
Vi noterar att eftersom parning medel saknar kvävekälla (även små mängder av aminosyror och kvävebaser är undantagna), höga passande effektivitetsvinster, såsom de som presenteras i figur 2E och 2G är endast uppnås med fullt prototrofa stammar. Auxotrofa stammar kan användas, men kräver ytterligare försiktighetsåtgärder för att säkerställa att cellerna är alltid hålls inom celltätheter som anges i protokollet. Även med omsorg, baralägre parningseffektivitetsvinsterna kommer att observeras. Parning effektivitet påverkas också av temperaturen, med lägre effektivitet observerades vid förhöjd temperatur, vilket kan begränsa användningen av temperaturkänsliga muterade alleler under parningsprocessen.
Den metod som presenteras här används primärt för långtids avbildning av fluorescerande reportrar. Eftersom avbildning utförs över lång tidsperiod, är framgångsrik avbildning av fissionsjäst parning starkt beroende av mikroskopi inställning tillgänglig. För detta, stabiliteten i mikroskopet set-up, dess känslighet och tillgång till ett autofokussystem är kritiska. Antingen mjukvarubaserad eller inbyggda hårdvaruautofokussystemet är möjliga. Förutom att öka genomströmningen, en motoriserad skede möjliggör multi förvärv är en annan viktig egenskap.
Bildkvalitet begränsas av egenskaperna hos fluoroforen av intresse. De distinkta inkubationstider i flytande MSL-N-medium beskrivs i detalj i Protocol avsnitt 2.3 syftar till att optimera fluorescens på feromon-inducerad märkta proteiner och minimera onödig blekning genom avbildning endast parning stadier av intresse. Medan rikliga eller mycket focalized fluorescerande taggade proteiner tillåter förvärv av hundratals tidpunkter under loppet av hela sexuell livscykel (film S3), andra proteiner är svårt att bilden över så långa tider på grund av fotoblekning. Bildkvaliteten beror också på den valda fluorofor, typiskt en GFP-derivat. Vi observerade upprepade gånger att sfGFP 17 (Överordnad GFP), som fälls med snabb kinetik, förutsatt överlägsen signal under parningsprocessen, möjligen på grund stark autophagy inducerar snabb omsättning protein. Viktigt är vi inte övervaka tillgängligheten syrgas som är nödvändig för fluorescerande protein mognad 17,22. Således är det rekommenderas att vara försiktig med att använda fluorescensmätningar för att kvantifiera nivåerna av proteiner som uttrycks efter celler är mounted på objektglas, eller att använda alternativa syrepermeabla mikrofluidik enheter för att genomföra sådana experiment. Dessutom agaros kuddar fläckig med celler på kvällen och hölls vid 18 ° C O / N har varit mycket användbar för bild svaga reportrar som sådana dynor innehåller en blandning av celler vid alla stadier av sexuell reproduktion.
Parning i fissionsjäst inte uppvisar synkront och celler kan lätt ses initiera shmooing tillsammans med andra celler som redan sporbildande (filmer S1, S2). Sådana populationsdynamik gör klassiska, bulk biokemiska tekniker svåra att använda, vilket gör enda cell mikroskopi beskrivs här en metod för val. Alla mikroskopi-baserade metoder kan i princip tillämpas på celler som framställts med det protokoll som beskrivs här. Viktigt, kan dessa metoder att övervaka processer som uppvisar parning typspecifika dynamik såsom cellcellfusion beskrivs av Dudin och kollegor 12. Att övervaka asymmetri, parning typ reportrarhar varit särskilt användbara (figur 3A). Skilja mellan de två parningstyper är lätt uppnås när man arbetar med heterotallism stammar genom att använda olika fluoroforer för att märka proteiner i H- och H + celler. Emellertid är detta inte är möjligt för homotalliska stammar. Ett tillvägagångssätt utvecklats för att skilja den passande typen av H90 celler är att uttrycka cytosoliska fluorescerande proteiner under kontroll av parnings typspecifika promotorer. Framför allt var promotorerna för feromon receptorgenerna map3 och mam2 används för att driva uttryck av GFP eller mCherry proteiner i P och M-celler respektive. Dessutom är dessa markörer tillät exakta tidpunkten för cell-cellfusion, visualiseras som överföringen av fluorescenssignalen från en partnercell till en annan.
Parnings feromoner är viktiga faktorer för framskrider genom olika stadier av sexuell reproduktion i jäst 11,23. Olika nivåer av syntetisk feromon leder till olika cellpolariseringstillstånd i fissionsjäst (Figur 3B, 3C och Ref. 11). Protokollet ingår ovan tillåter att utvärdera hur olika exogena feromonnivåer påverkar cellfysiologi. Eftersom feromonet proteas Sxa2 degraderar snabbt P-faktorn, en heterotallism mutant stam där proteaset ströks användes för att erhålla reproducerbara resultat. Men i blandningar av celler av motsatta parningstyper, inte bara nivåer men även den rumsliga fördelningen av feromoner som avges av en passande partner är sannolikt att vara viktig. Analysera effekterna av feromon rumsliga fördelning på cellsvar kräver utveckling av mer sofistikerade inställningar såsom mikrofluidik enheter som används på spirande jäst 24,25.
Sammanfattningsvis presenterar vi en grundläggande metod för långsiktig mikroskopi av sexuell livscykel fissionsjäst. Smärre justeringar av detta protokoll tillåta research fokusera på cellulära svar på olika stadier av sexuell livscykel. Kombinera detta tillvägagångssätt med encelliga biokemi verktyg och mikrofluidik enheter kommer att ytterligare främja fissionsjäst sexuell reproduktion som ett kraftfullt modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AV-stöddes av en EMBO långsiktig postdoctoral gemenskap. Forskning i Martin lab finansieras genom ett ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) och Swiss National Science Foundation (31003A_155944) till SGM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
