Introduction
Selv om genetisk utveksling mellom to celler er den sentrale hendelsen i seksuell reproduksjon, det er avhengig av en kjede av hendelser som fremmer celledifferensiering, gir mulighet for valg av partner, utfører celle-celle fusjon og vedlikeholde genomisk stabilitet. Dermed seksuell livssyklus presenterer seg som et modellsystem for å studere en rekke biologiske spørsmål om utviklings brytere, reaksjon på ytre stimuli, plasma membran fusion, kromosom segregering, osv Exploring fisjons gjær seksuell syklus for å studere disse fenomenene bringer fordelene av modellsystem kraftige genetikk, veletablerte high-throughput tilnærminger og sofistikert mikroskopi. Sex i fisjon gjær er en heterotypic hendelse mellom en P-celle og en M-celle distinkte parring typer. De to celletyper differensielt uttrykk for en rekke gener 1,2 inkludert de for fremstilling av det utskilte P- og M-feromoner, feromon-reseptorer Map3 og Mam2 samt feromon-proteases Sxa1 og Sxa2. Homo-thallisk-stammer, slik som vanligvis brukes H90 belastning, bærer den genetiske informasjonen for både parring typer i en enkelt genom og cellene gjennomgå en komplekst mønster av paringstypen veksling gjennom den mitotiske livssyklusen (oversikt i Ref. 3). Multiple isolater av heterothallic spalting gjær som sjelden eller aldri bytte paringstypen er også ofte brukt til 4, mest fremtredende h + N (P-type) og h -S (M-type) stammer.
I fisjon gjær, inntreden i den seksuelle livssyklus er under streng ernæringsmessig regulering. Bare nitrogen sultet fisjonsgjærceller arrestere mitotisk reproduksjon og produsere diffusible feromoner for å signalisere tilstedeværelsen av en paring partner og fremme ytterligere trinn av seksuell syklus (anmeldt i Ref. 5). Nitrogen deprivasjon de-undertrykker nøkkelen transcriptional regulator av parring Ste11 som fungerer som en utviklings bryter og fremmer eXpression av parring spesifikke gener inkludert feromon reseptoren og feromon produksjons gener 6,7. Pheromone-reseptor engasjement aktiverer reseptor-koblede protein G-alfa og nedstrøms MAPK signal som ytterligere forbedrer Ste11 transkripsjonen aktivitet 8-10, og dermed øke feromon produksjonen i en positiv tilbakemelding mellom parringspartnere. Feromon nivåer er avgjørende for å indusere forskjellige celle polarisering stater ved å regulere mester arrangør av celle polaritet, Rho-familien GTPase Cdc42 11. Ved eksponering for lave konsentrasjoner feromon er aktiv Cdc42 anskueliggjort på dynamiske flekker utforske cellen periferi, og ikke cellevekst observeres på dette stadiet. Økte nivåer feromon fremme stabiliseringen av Cdc42 aktivitet til en enkelt sone og vekst av en polarisert fremspring, betegnet Shmoo, som bringer partnerceller i kontakt. Deretter de to haploide paring partnere sikring for å danne en diploid zygote. Nyere arbeider avslører the eksistensen av en roman aktin struktur avgjørende for fusjon som er satt sammen av parings-indusert formin Fus1 12. Denne fusjon fokus konsentrater type V myosin avhengige prosesser og posisjonerer celleveggen degradering maskineri, og dermed gir ombygging av celleveggen for å tillate plasmamembranen kontakt uten cellelyse 12. Ved celle-celle fusjon, kjernen kommer i kontakt og gjennomgå karyogamy. En fremtredende dynein avhengig back-og-tilbake bevegelse av kjernen i zygoten (hestehale bevegelse) fremmer deretter sammenkoblingen av kromosom homologer 13,14, som er etterfulgt av meiose. Endelig er de fire produkter av meiose pakket i individuelle sporer under sporulering.
På grunn av sin kompleksitet og de mange trinnene som er involvert, har detaljert overvåking av parring vært utfordrende. To kjente problemer er at hele prosessen tar godt over femten timer, og at cellene er vanskelig å synkronisere. disse difficulties blir omgått ved encellede mikros tilnærminger. Her en generell protokoll for å undersøke den seksuelle livssyklus i fisjon gjær er presentert. Med mindre justeringer, tillater denne protokollen studiet av alle de forskjellige trinnene i prosessen, nemlig induksjon av parring genprodukt, celle polarisering og sammenkoblingen mellom søster-celler etter Mating Typ veksling og mellom ikke-beslektede partnere, celle-cellefusjon og post-fusjon hestehale bevegelse, meiose og sporulation. Denne metoden gjør det mulig å 1) lett visualisere fluorescens-merket proteiner over tid før-, under og etter fusjon; 2) diskriminere oppførselen til celler av motsatt parrings type; og 3) måle og kvantifisere parametere som shmooing, parring, fusjon eller sporulation effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mikroskopi analyse av fisjon gjær seksuell reproduksjon
1. Media Forberedelse
- Forbered Minimum sporulering medium (MSL-N) 15 ved å blande følgende komponenter: Glukose 10 g / l KH 2PO 4: 1 g / l, NaCl: 0,1 g / l MgSO4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Legg Sporstoffer (10,000x): 100 mL / L, vitaminer (1,000x): 1 ml / l og 0,1 M CaCl2 ml / l. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer porestørrelse filter og oppbevares ved romtemperatur (RT).
- Bruke følgende vitaminer (1,000x) lager: Pantothenate: 1 g / l, nikotinsyre: 10 g / l, Inositol: 10 g / l Biotin: 10 mg / l. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer porestørrelse filter og oppbevares ved 4 ° C.
- Bruk følgende Sporstoffer (10,000x) lager: borsyre: 5 g / l, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO4 · 7H 2 O: 4 g / l, FeCl ^ 2 · 6H 2 O: 2 g / L Moo 3: 0,4 g / l, KI: 1 g / l, CuSO4· 5H 2O: 0,4 g / l sitronsyre 10 g / l. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer porestørrelse filter og oppbevares ved 4 ° C.
- Forbered MSL-N Agarose 2% (som brukes til å lage agarose puten kamre) ved å kombinere 10 ml MSL-N med 0,2 g agarose. Smelte for ~ 2 minutter ved høy effekt i en mikrobølgeovn inntil agarose oppløses og alikvote 0,5 ml i mikrosentrifugerør. Oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered Minimum sporulering medium med nitrogen (MSL + N) fra MSL-N ved tilsetning av (NH4) 2 SO 4: 1 g / L, leucin: 0,225 g / l, adenin: 0,225 g / l, Uracil: 0,225 g / l . Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer porestørrelse filter. Oppbevar ved romtemperatur.
Merk: Leucin, adenin og uracil blir tilsatt til dette medium for å tillate veksten av auxotrofe stammer. Tilleggs aminosyre supplement bør inkluderes hvis belastningen brukes bærer et tydelig auxotrofi (for eksempel his3Δ). Vær også oppmerksom på at arbeidet med fullt prototrof stammer anbefales, som bareslike stammer vil tillate høy parring effektivitet. - Forbered 200 ml VALAP for kammeret tetting. I et begerglass legger til like vekter av lanolin, vaselin (eller annen vaselin), og parafin. Heat blandingen ved lav temperatur og rør av og til inntil grundig blandet. Delmengde blandingen i flere små petriskåler. Oppbevar ved romtemperatur.
2. Dyrking fisjon gjærstammer for parring Experiments (figur 1).
- Dag 1, Kveld:
Vaksinere fersk stripete stammer fra faste medier i kultur rør som inneholder 3 ml MSL + N. Bruk flatbunnede rør med omtrent 2,5 cm diameter. Bruk andre kultur rør eller flasker med tilpasset kulturen volum. Inkuber over natten (O / N) med risting ved 25 ° C, 200 rpm. Hvis du arbeider med heterothallic stammer, vaksinere seg.- Fortynn cellesuspensjoner i media i formiddag for å sikre at kulturer har optisk tetthet målt ved 600 nm (OD 600) 0,4-0,8 i kveld.
notat:OD 600 målinger som en proxy av cellekonsentrasjonen for spalting gjær er lineære i området fra ca 0,1-1,0. For vårt spektrofotometer OD 600 = 0,1 tilsvarer 1,4 x 10 6 celler pr ml. Hvis således utgangs OD 600 leser er utenfor dette området, prøver må fortynnes / konsentrert for pålitelige målinger.
- Fortynn cellesuspensjoner i media i formiddag for å sikre at kulturer har optisk tetthet målt ved 600 nm (OD 600) 0,4-0,8 i kveld.
- Dag 2, kveld:
Fortynn cellene i 20 ml MSL + N media til OD600 = 0,025 i 100 ml kolber. Inkuber stammer O / N ved 30 ° C, 200 rpm.
Merk: Wild-type cellekulturer bør nå OD 600 ~ 0,8 påfølgende morgen (15 timer senere). Hvis du arbeider med stammer med lengre generasjonstid justere fortynning tilsvarende. - Dag 3, morgen:
Måle OD 600 for å verifisere at kulturer har celletetthet på OD600 ~ 0,8. Hvis du arbeider med heterothallic stammer, bland like mange partner celler. Pellet cellene ved 1000 xg og overføring til et 1,5 mlrør. Vask cellene tre ganger i 1 ml MSL-N medium. Re-suspendere celler i 3 ml MSL-N medium og fortynn cellene til OD600 = 1,5.- For å overvåke parring mellom beslektede celler direkte montere celler for avbildning (se protokoll pkt 2.4). Bruk homo-thallisk H90 stammer, der parring typen veksling vil finne sted i løpet av de mitotiske divisjoner som oppstår etter nitrogenmangel. Umiddelbar montering av celler på agarose puten sørger for at, etter celledeling, søster-celler forblir ved siden av hverandre.
- For å overvåke cellepolarisering (utforskende dynamikk og shmooing) inkuber 1-3 ml cellekultur ved 30 ° C, 200 rpm i 3-4 timer før monterings celler for avbildning. Innenfor disse 3-4 timer, vil den siste mitotiske divisjon har oppstått. Noen celler vil ha initiert polarisering, men de fleste vil bare være å starte sin utforskende polarisering dynamikk.
- For å overvåke celle-cellefusjon inkuber 1-3 ml cellekultur ved 30 ° C, 200 rpm i 4-6 timer prieller til montering celler for bildebehandling.
- Å overvåke post-fusjonsbegivenheter inkuber 1-3 ml av cellekulturer ved 30 ° C, 200 rpm i 8 timer før montering celler for avbildning.
- For å overvåke responsen på en bestemt feromon konsentrasjon (bare for heterothallic stammer) inkubere 3 ml cellekultur ved 30 ° C, 200 rpm i 3-4 timer før montering celler for avbildning.
- Fjern det MSL-N-inneholdende mikrosentrifugerør fra 95 ° C varmeblokk (se Protocol avsnitt 2.4.1. Nedenfor). Legg P-faktor eller M-faktor ved den ønskede konsentrasjon direkte i smeltet MSL-N agarose. Bland godt ved å virvle før umiddelbar pad forberedelse.
- Etter celle montering, inkuber puten for 15-30 min ved 25 ° C før avbildning. P-faktor og M-faktor feromoner ble anvendt fra en stamløsning av 1 mg / ml i metanol.
Merk: Hvis du arbeider med mutant stammer inkubasjonstider kan variere. Klumping av celler som kan oppstå etter langvarig inkubering i væske media og kan være spesielt sterk på noen mutante stammer. Klumpet seg celler kan ikke bli sett på agarose pads i et enkelt lag, og dermed er vanskelige å autofokus og bilde. I tilfelle av utstrakt celle klumping montere cellene på agarose elektrodene umiddelbart etter vask og re-suspensjonen i nitrogen-mangler medium (som i protokollen avsnitt 2.3.1.) Og inkubere dem ved 30 ° C før avbildning.
- Monterings Cells for bildebehandling:
- Fremstille MSL-N agarose putene 16 ved å smelte en prøve i en 95 ° C varmeblokk i 10-15 minutter og tilsetning av 200 pl mellom to glassplater atskilt av avstandsstykker (figur 1B). Bruke avstandsstykker med en tykkelse av ~ 0,5 mm. For å gjøre avstandsstykker, anvender strimler kuttet ut av papp, slik som den som leveres med restriksjonsenzymer.
- Pellet 100 ul av cellene ved 1000 xg i 1 min, fjern supernatanten og re-suspendere celler i rest 2-4 ul medium. IKKE re-suspendere i frisk medium som det forsinkelserparring.
- Etter 2-3 min forsiktig fjerne spacere og toppglass. Hvis flere stammer skal monteres, forberede cellen konsentrerer før forbereder agarose puten.
- Tilsett 1 mL av celler til puten og vente til rulle starter tørking (~ 1 min) før du dekker med dekkglass og forsegling med VALAP.
- La puten sitte i minst 30 minutter før bildebehandling ved 25 ° C eller RT.
- For å få en blanding av celler i ulike stadier av parring, lage en pute umiddelbart etter vask i MSL-N (se punkt 2.3.) Og inkuberes ved 18 ° CO / N (~ 15 timer). Denne tilnærmingen er nyttig for å avbilde celler på forskjellige parrings stadier med høy tidsoppløsning eller prøver med svakt signal.
3. Levende celler Imaging av Mating gjærceller
- Juster bildet oppkjøpet innstillinger.
Merk: Bildeoppkjøps innstillinger som presenteres her var optimalisert for Deltavision plattformen består av en tilpasset Olympus IX-71invertert mikroskop med Plan Apo 60x / 1,42 NA eller U-Plan Apo 100X / 1.4 NA mål, en CoolSNAP HQ2 kamera og en Insight SSI 7 farger kombinert enhet lyset. Maskinvaren er kontrollert av softWoRx v4.1.2 som også gjør det mulig for digital autofokus.- Pass på at autofokus intervallene ikke overstige 15 minutter siden Z-drift i løpet av lengre tid kan overgå kapasiteten programvaren autofokussystem. Hvis du bruker en maskinvarebasert autofokus system, bruke større intervaller.
- Juster bildeintervall. Ta bilder hver 10 min for ~ 15 timer som utgangspunkt når du arbeider med et fluorescerende merket protein for første gang. Dette intervallet gir en god oversikt over hele paring prosessen uten omfattende bleking.
- Bilde med 5 minutters mellomrom eller kortere til mer presist tids hendelser som fusjon. Kortere intervaller krever sterk fluorophores muliggjør lave eksponeringstider og lite bleking. For bildebehandling med intervaller under 1 min unngå O / N mikrosog i stedet lage en blanding av alle parring etapper som beskrevet i protokollen avsnitt 2.4.6.
- Juster bildeeksponering tid. Test eksponeringstider mellom 50 og 300 msek. Tar sikte på å finne en balanse mellom signal-til-støy-forhold og fotobleking for å oppnå et stort antall av tidspunkter med en merkbar signal (typisk over 100).
- Juster Z-seksjonering. Seksjoner hvert 0,3 mikrometer som dekker 5 mikrometer gi en god bildedybde. Merk at Z-seksjonering ytterligere økning foto-skade, som kan reduseres ved å bruke OAI (optiske aksen integrasjon - en enkelt sveip oppkjøpet av det totale utvalget dybde). God autofokus system reduserer behovet for mange Z-profiler og er sterkt anbefalt.
- Tips for å studere Mating Type-spesifikke atferd:
- For heterothallic stammer, bruk h- og h + celler som uttrykker forskjellige fluoroforer, slik at de to celletyper kan skilles. Bruk noen genetisk kodet fluorophore uttrykt som en cytosoliske versjon eller fusjon til et endogent protein, selv om vi har hatt god suksess med sfGFP, en rask folding variant av GFP 17. Endogene proteiner blir vanligvis merket ved deres endogene genomiske lokuset ved homolog rekombinasjon 14.
- For homo-thallisk stammer, uttrykker et genetisk kodet cytosolisk fluorescerende protein under kontroll av paringstypespesifikke promotorer slik som de av feromon reseptorgener map3 og mam2 for å drive ekspresjon i P og M-celler, respektivt. Initiativtakerne map3 og mam2 er inaktive i løpet av vegetativ vekst og blir indusert på nitrogen sult 18,19. Konstruksjoner som driver ekspresjonen av cytosoliske GFP eller mCherry under kontroll av disse promotorer er vanligvis integrert i en genomiske lokuset (ura4, leu1) som ikke forstyrrer den normale progresjon av den seksuelle livssyklus 12.
4. Kvantifisering av parring og Fusion Effektivitet
- For å kvantifisere parring og fusion effektivitet 11,12, spot celler direkte etter MSL-N vaske på MSL-N agarose pads, som i trinn 2.3.1 ovenfor, og la stå i 24 timer ved 25 ° C før imaging (figur 1A). Ved hjelp av denne protokollen en homo-thallisk villtypestamme parring effektivitet når ~ 60% og fusjonseffektivitet 99%. For å teste om noen reduksjon i disse verdiene observert i mutantstammer reflektere en terminal fenotype eller en forsinkelse, gjenta eksperimentet med en 36 timers inkubasjonstid.
- Beregn parring effektivitet som
Mating parene inkluderer zygotes, ASCI, og sammensmeltede celler par identifisert frasin posisjon og vekst mot hverandres. - Beregn fusjon effektivitet som
Merk: Fused paring parene er identifisert av sin evne til å danne sporer hvis det er kjent at den muterte under studien ikke påvirker sporulation. Hvis sporulering ikke kan brukes som leses ut, blir sammensmelting bestemmes ved å observere spredning av en cytosoliske markør uttrykt i bare en parring partner til begge parter.
Mating parene inkluderer zygotes, ASCI, og sammensmeltede celler par identifisert frasin posisjon og vekst mot hverandres. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fisjons Gjær Vekst og Mating Dynamics ved fjerning av en nitrogenkilde
Som nitrogen sult er en forutsetning for initiering av seksuell reproduksjon i fisjon gjær, ble villtype-homo-thallisk H90 belastning overvåkes ved overgang fra nitrogen-rik på nitrogen-belastede medium (figur 2), etter den protokoll som er beskrevet i figur 1. I korthet ble cellene ble dyrket O / N til eksponensiell fase (OD600 = 0,5) i MSL + N medium, samlet opp, vasket og resuspendert i MSL-N væskemedium til den endelige OD 600 = 1,5. Hver 2 timers porsjoner av celler var calcofluor-farget og avbildes (figur 2A - D).
Calcofluor farging (figur 2A) viste at i nitrogen-rikt medium ~ 21% av cellene ble septating (n> 300, figur 2B), og at gjennomsnittlig cellelengde på utbyttesion var 15,2 ± 1,4 mikrometer (n = 50, figur 2C). Ikke-delende celler viste en bred distribusjon av cellelengder (8-14 mikrometer; n> 200, figur 2D). Imidlertid, to timer etter skift til MSL-N medium var der en drastisk endring i lengden fordeling av ikke-delende celler, med over 60% av celler som er kortere enn 9 pm (n> 200, figur 2D). Celle septumdannelse ble også påvist ved redusert lengde på 9,8 ± 0,8 um (n = 50, figur 2A, 2C). En ytterligere reduksjon i lengden av både ikke-delende og delende celler ble også observert, som tiden i MSL-N økt. Faktisk, etter 8 timer ble septumdannelse indeksen av kulturen ble redusert under 2% (n> 300) og over 85% av cellene arrestert deres cellesyklus ved lengder kortere enn 7 um (n> 200, figur 2D).
Celler begynt å danne parring par fire timer etter overgangen til flytende MSL-Nmedium (<1%, figur 2A). Deretter antall parring par økt raskt og 8 timer etter skiftet 10% av celler engasjert en paring partner (n> 200, figur 2B).
For å overvåke parring dynamikk, seks timer etter sult induksjon, en delmengde av celler ble også montert på MSL-N agarose pad for bildebehandling. Celler gikk shmooing, fusjon og sporulation (figur 2E, 2F) i den påfølgende 21 timer uten noen åpenbar synkront (Movie S1). Parings effektivitet avhengig av den relative plasseringen og tettheten av celler i en gitt synsfelt, med over 60% av cellene er engasjert en partner når den er plassert tett i et monolag (figur 2G og film S1).
De villtype heterothallic h + og h- spalting gjærstammer ble også utsatt for den samme protokoll med enn ytterligere trinn med å blande h + og H-celler i en en-til-en-forhold på tidspunktet for nitrogenfjerning. Lignende sult og parring dynamikk ble observert, men paring effektivitet var noe lavere (figur 2G, Movie S2).
Overvåking Dynamics of fluorescerende Tagged Proteiner i Mating Fission gjærceller
For å overvåke dynamikken i type V myosin Myo52 (Ref 20) i paring celler, dyrket eksponentielt h- celler som uttrykker Myo52-3GFP fra det native locus ble blandet med h + celler på samme måte som uttrykker Myo52-tdTomato, samt cytosoliske GFP fra P -celle spesifikt map3 promoter. Cellesuspensjonen ble vasket, fortynnet i MSL-N-medium og inkubert i 6 timer ved 30 ° C, 200 rpm før montering celler mot MSL-N agarose puter for O / N avbildning ved 10 min intervaller.
Som tidligere rapportert 11,12 Myo52 opprinnelig dannet dynamiske soner gjennom hele celle cortex (figur 3A, pilspisser og Movie S3). Myo52 signal ble deretter stabilisert (figur 3A, piler og film S3) i en enkelt fokus like før fusjon arrangementet, som ble visualisert ved overføring av det cytosoliske GFP signalet fra h + inn i H- cellen (figur 3A og film S3) . Den Myo52-tdTomato signal kan også observeres ved fusjon halsen under sin ekspansjon, men ingen merkbar signal var tydelig som zygoten satte å sporulation (figur 3A og Movie S3).
Overvåking av Behavior av Heterothallic Fission gjærceller utsettes for ytre Pheromones
Heterothallic h- celler som mangler Sxa2 protease som forringer P-faktor for desensitivisering lett å svare på syntetisk P-faktor. en h- sxa2Δ stamme, uttrykker Scd2-GFP som en markør for aktiv Cdc42 11, ble dyrket i MSL + N medium, i henhold til den beskrevne protokoll. Celler ble vasket i MSL-N-medium og inkubert i 4 timer ved 30 ° C. MSL-N agarose puter inneholdende metanol (data ikke vist), 0,1 ug / ml (lav feromon, figur 3B) eller 1 ug / ml (høy feromon, figur 3C) var fra P-faktor fremstilt, kuttet og plassert på en ny lysbilde å generere mini-pads som inneholder forskjellige feromon beløp. 0,5 mL av cellesuspensjon ble montert på hver mini-pads for O / N bildebehandling på 5 min intervaller.
I samsvar med publiserte resultater 11, lav P-faktor nivåer fremmet dannelsen av dynamiske Scd2 soner uten vekst (figur 3B, Movie S4), mens høye nivåer av P-faktor stabilisert én Scd2 sone, og dermed indusere Shmoo forlengelse fra en celle pol (Figur 3C, Movie S5).
Figur 1:.. Skjematisk fremstilling av Protocol (A) Skjematisk beskrivelse for protokollene som brukes til å overvåke fisjons gjær seksuell livssyklus og (B) for å forberede fisjonsgjærprøver for langsiktig bildebehandling Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 2:. Vekst og Mating Dynamics av fisjonsgjærceller flyttet fra MSL + N for å MSL-N Media (A) epifluorescence mikrografer av calcofluor-farget cellene skiftet til MSL-N media for de angitte tidsperioder. (B) Prosentav septating (mørk blå linje, n> 300 per endepunktet) og parring (lys blå linje, n> 300 per endepunktet) celler flyttet til MSL-N media for de angitte tidsperioder. (C) Gjennomsnittlig lengde på septating celler flyttet til MSL-N media for de angitte tidsperioder (n = 50 per endepunktet unntatt 8 timers endepunktet hvor n = 20). (D) Lengde distribusjon av ikke-delende celler flyttet til MSL-N medium for de angitte perioder (n> 200 per endepunktet). (E) Gjennomsnittlig brøkdel av ukondensert (mørk blå linje), smeltet (lys blå linje) og sporedannende (svart linje) celler i en populasjon av H90 vill-type gjær flyttet til MSL-N media for de angitte tidsrom, og montert på en agar pad på endepunktet 6 t (n> 900 celler per endepunktet fra tre forskjellige timelapses). Cellene ble ansett fusjonert når ingen brytningscellevegg mellom partnere var synlig i DIC mikrografer og dannelse av sporecelleveggen ble anvendt for å score for sporulating celler. (F) DIC mikrografer av sammenpassende cellene flyttet til MSL-N media for de angitte tidsperioder. (G) Mating effektivitet som en funksjon av celletetthet på agarose pads for H90 (mørk blå prikker) og h + / H- (lys-blå prikker) celler flyttet til MSL-N media i 24 timer. Den mest passende tetthet av celler for langsiktig bildebehandling oppnås ved ca 25 000 celler / mm 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Dynamisk Lokalisering av Fluorescent Proteiner under Fisjon Gjær Mating (A) dekonvolveres enkelt z-planet epifluorescence mikrografer av celler med de angitte genotypene flyttet fra MSL + N for å MSL-N media i 6 timer og monteres påMSL-N agarose pad for den angitte tiden. Pilspisser indikerer dynamiske Myo52-3GFP soner og pilen peker Myo52 lokalisering ved fusjon fokus. (B), (C) dekonvolveres enkelt z-plane epifluorescens mikrografer av celler med angitte genotyper forskjøvet fra MSL + N til MSL-N media i 4 timer og montert på MSL-N agarose miniputer inneholdende 0,1 ug / ml (B) eller 1 ug / ml (C) p-faktoren for den angitte tid. Pilspisser indikerer dynamisk (B) eller stabil (C) Scd2-GFP soner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplemental Movie 1: DIC timelapse av vill type H90 fisjon gjær ce lls som var nitrogen-sultet i 6 timer før bildebehandling. (Høyreklikk for å laste ned).
Supplemental Movie 2: . DIC timelapse av vill type h + og H fisjonsgjærceller som ble blandet og nitrogen-sultet i 6 timer før bildebehandling (Høyreklikk for å laste ned).
"> Supplemental Film 3: dekonvolveres enkelt z-planet epifluorescens og DIC timelapse H- celler som uttrykker Myo52-3GFP fra det native locus blandet med h + celler som uttrykker Myo52-tdTomato fra det native locus og cytosoliske GFP fra P-cellespesifikke promoter map3 . Cellene ble dyrket i MSL-N medium for 6 timer ved 30 ºC før bildebehandling. overføring av cytosoliske GFP inn i h- cellen definerer fusjon tid. (Høyreklikk for å laste ned).
Supplemental Movie 4: dekonvolveres enkelt z-planet epifluorescence og DIC timelapse H- sxa2 celler expressing Scd2-GFP fra sin opprinnelige arrangøren behandlet med 0,1 mg / ml P-faktor. Cellene ble dyrket i MSL-N medium for 4 timer ved 30 ºC før bildebehandling. (Høyreklikk for å laste ned).
Supplemental Movie 5: . Dekonvolveres enkelt z-planet epifluorescence og DIC timelapse H- sxa2 celler som uttrykker Scd2-GFP fra sin opprinnelige arrangøren behandlet med 1 mikrogram / ml P-faktor Cellene ble dyrket i MSL-N medium for 4 timer ved 30 ºC før bildebehandling. (Høyreklikk for å laste ned).
| YSM995 | h- vekt |
| YSM1371 | h + vekt |
| YSM 1396 | H90 vekt |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | h- scd2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
Tabell S1: Stammer brukt i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miljøforhold og næringsstoffer spesielt sterkt påvirke fisjon gjær fysiologi. Nitrogen sult er nødvendig for forpliktelse til seksuell reproduksjon og i utgangspunktet fører til slående endringer i mitotisk cellecyklusprogresjonen (Ref. 21 og figur 2). Ved nitrogenfjerning fra eksponentielt voksende befolkning, cellestørrelsen ved divisjon hurtig avtar (figur 2C) og flertallet av celler arrest mitotisk progresjon kortere enn lengden av nyfødte eksponentielt dyrkede celler (Ref. 21 og figur 2D). Som celler av motsatt parring typer arrestere mitotisk progresjon de engasjere parring partnere og fortsett å danne zygotes og sporulate (figur 2B, 2E, 2F). I tilfellet med en to-dimensjonal monolag av villtype-celler, over seksti prosent av H90-celler vil engasjere en partner, og nesten alle vil gjennomgå cellefusjon (figur 2G (figur 2G). En av de mest kritiske aspekter ved protokollen for å oppnå høye virkningsgrader sammenpassende er å sikre at cellene holdes innenfor de angitte tettheter gjennom. Overvåking av celle størrelse og parring effektivitetsparametere som vist i figur 2 gir deretter en enkel kontroll som cellene går inn seksuell reproduksjon effektivt.
Vi merker oss at, ettersom parring medium mangel hvilket som helst nitrogenkilde (selv lave mengder av aminosyrer og nitrogenbaser er ekskludert), høye sammenpassende virkningsgrader som de som er presentert i figur 2E og 2G kan bare oppnåes med fullt proto stammer. Auxotrofe stammer kan brukes, men krever ekstra forsiktighet for å sikre at cellene er til enhver tid holdes innenfor celletettheter angitt i protokollen. Selv med forsiktighet, barelavere parring effektivitet vil bli observert. Mating effektivitet er også påvirket av temperatur, med lavere effektivitet som observeres ved forhøyet temperatur, som kan begrense bruken av temperatursensitiv mutant alleler i parringsprosessen.
Metoden som presenteres her er først og fremst brukes til langsiktig avbildning av fluorescerende reportere. Fordi avbildning blir utført over lengre tidsrom, vellykket avbildning av fisjons gjær parring er svært avhengig av mikros oppsettet tilgjengelig. For dette stabiliteten av mikroskopet oppsett, dets følsomhet og adgang til en autofokussystem er kritiske. Enten programvarebasert eller innebygde hardware autofokussystemer er mulig. I tillegg til å øke gjennomstrømning, en motorisert stadium slik at multi Oppkjøpet er en annen viktig kvalitet.
Bildekvalitet er begrenset av egenskapene til den fluoroforen av interesse. De forskjellige inkubasjonstider i flytende MSL-N medium beskrevet i protokollen,l § 2.3 er rettet mot å optimalisere fluorescens på feromon-indusert merket proteiner og minimere unødvendig bleking av tenkelig bare parring stadier av interesse. Mens rike eller svært focalized fluorescens-merket proteiner tillate oppkjøpet av hundrevis av tidspunkter i løpet av hele seksuell livssyklus (Movie S3), andre proteiner er utfordrende å bilde over så lange tider på grunn av foto-bleking. Bildekvaliteten avhenger også av den valgte fluorofor, typisk et GFP-derivat. Vi gjentatte ganger observert at sfGFP 17 (superfolder GFP), som folder med raske kinetikk, forut overlegen signal i paringsprosessen, muligens fordi sterk autofagi induserer hurtig protein omsetning. Viktigere, vi gjorde ikke overvåke tilgjengeligheten av oksygen er nødvendig for fluorescerende protein modning 17,22. Dermed er det anbefalt å være forsiktig i å bruke fluorescens målinger for å kvantifisere nivåene av proteinene uttrykt etter cellene er Mounted på lysbilder, eller å bruke alternative oksygenpermeable MicroFluidics enheter for å gjennomføre slike eksperimenter. I tillegg agarose pads flekket med celler i kveld og holdt ved 18 ºC O / N har vært veldig nyttig for bilde svake journalister som slike pads inneholder en blanding av celler i alle faser av seksuell reproduksjon.
Mating i fisjon gjær utviser ikke synkront og celler kan lett sees initiere shmooing sammen med andre celler allerede sporedannende (Filmer S1, S2). Slike populasjonsdynamikk gjør klassiske, bulk biokjemiske teknikker vanskelig å bruke, og gjør enkelt celle mikros beskrevet her en metode for valg. All mikroskopi baserte tilnærminger kan i prinsippet anvendes på celler fremstilt med den protokoll som er beskrevet her. Viktigere, kan disse metodene overvåke prosesser som utviser parring typespesifikke dynamikk som celle-celle fusjon beskrevet av Dudin og kolleger 12. For å overvåke asymmetri, parring typen journalisterhar vært spesielt nyttig (figur 3A). Skille mellom de to koplingstyper er lett oppnås når du arbeider med heterothallic stammer ved å bruke forskjellige fluorophores å merke proteiner i h- og h + celler. Dette er imidlertid ikke mulig for homo-thallisk stammer. En tilnærming er utviklet for å skille paringstypen H90-celler, er å uttrykke cytosoliske fluorescerende proteiner under kontroll av paringstypespesifikke promotere. Spesielt ble promoterene av feromon reseptorgener map3 og mam2 anvendt for å drive ekspresjon av GFP eller mCherry proteiner i P og M-celler respektivt. Videre har disse markørene tillot nøyaktig timingen av celle-celle-fusjon, visualiseres som overføring av fluorescente signalet fra en partner celle til den annen.
Parring feromoner er avgjørende determinants for framdrift gjennom ulike stadier av seksuell reproduksjon i gjær 11,23. Ulike nivåer av syntetisk feromon fører til forskjellige celle polarisasjonstilstander i fisjon gjær (figur 3B, 3C og Ref. 11). Protokollen inkludert ovenfor kan vurdere hvordan forskjellige eksogene feromon nivåer påvirker cellefysiologi. Fordi feromon protease Sxa2 raskt degraderes P-faktor, en heterothallic mutant belastning hvor protease ble slettet ble brukt for å få reproduserbare resultater. Men i blandinger av celler av motstående sammenpassende typer, ikke bare nivåer, men også den romlige fordelingen av feromoner som utsendes av en sammenpassende partner er sannsynlig å være viktig. Analysere effektene av feromon romlige distribusjon på celle respons vil kreve utvikling av mer avanserte oppsett som MicroFluidics enheter ansatt på spirende gjær 24,25.
I sammendraget presenterer vi en enkel metode for langsiktig mikroskopi av den seksuelle livssyklusen til fisjons gjær. Mindre justeringer av denne protokollen tillater research fokus på cellulære responser på forskjellige stadier av seksuell livssyklus. Kombinere denne tilnærmingen med enkelt celle biokjemi verktøy og MicroFluidics enheter vil fremme fisjon gjær seksuell reproduksjon som en kraftig modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AV ble støttet av en EMBO langsiktig postdoktorstipend. Forskning i Martin lab er finansiert av et ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) og en sveitsisk National Science Foundation tilskudd (31003A_155944) til SDB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
