Summary
Эта рукопись описывает подробный протокол для сбора данных давления объемом от мыши.
Abstract
Понимание причин и прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний представляет собой серьезную проблему для биомедицинского сообщества. Генетический гибкость мыши обеспечивает большой потенциал для изучения функции сердца на молекулярном уровне. Небольшой размер мыши представляет некоторые проблемы в отношении проведения подробного сердца фенотипирования. Миниатюризация и другие достижения в области технологии сделали много методов оценки сердечной возможной у мышей. Из них одновременный сбор данных давления и объема обеспечивает детальную картину сердечной функции, которая не доступна через любой другой модальности. Вот подробная процедура сбора данных контура давления объема описывается. В комплект входит обсуждение принципов, лежащих в основе измерения и потенциальные источники ошибок. Обезболивающий управления и хирургические подходы обсуждаются в мельчайших подробностях, как они оба важны для получения измерения гемодинамического высокого качестваs. также рассматриваются принципы разработки протокола гемодинамика и соответствующие аспекты анализа данных.
Introduction
Сердечно - сосудистые заболевания по- прежнему является важной причиной смертности и заболеваемости по всему миру 1. Болезни сердца представляют особенно сложные проблемы в разработке новых методов лечения. Достижения в области генетики обеспечивают возможность идентифицировать множество потенциальных генетических доноров к развитию сердечно-сосудистых заболеваний. Интегративный характер сердечно-сосудистой системы требует, чтобы эти генетические цели быть подтверждено в интактных животных моделях. Генетические гибкость и низкие издержки на жилье мыши принесли его на первый план для оценки физиологической роли данного гена. Небольшой размер мыши представляет некоторые уникальные проблемы для оценки функции сердца. Есть несколько условий, которые могут предоставить информацию о функции сердца, но только одновременное измерение давления и объема желудочка позволяет давление-объем (PV) анализ петли функции левого желудочка. PV петли всевл сердечной функции для анализа зависит от его соединения с сосудистой сетью; Важным фактором при определении функциональной роли конкретного генетического элемента.
Оценка контуров давления объема было экспериментально и клинически используется на протяжении многих лет , и обширная литература существует относительно анализа этих наборов данных 2,3. Адаптация технологии петли PV к мыши стала важным шагом вперед в понимании мышиной физиологии сердца 4-6. Катетер на основе технологии контура PV пара датчик давления и использование проводимости для оценки желудочковой объема. Желудочков объем определяется путем анализа изменений в электрическом поле, создаваемом с помощью катетера. Этот метод моделирует желудочек как цилиндр, высота которого определяется расстоянием между электродами на катетере и радиус вычисляется по проводимости электрического поля через кровь вжелудочек 7-9. Сигнал Проводимость измеряется с помощью катетера имеет два компонента. Первым из них является проводимость через кровь; это зависит от объема желудочка и представляет собой первичный сигнал, используемый для определения желудочковой объема. Второй компонент является результатом проводимости через и вдоль стенки желудочка. Это называется параллельная проводимость и должны быть удалены, чтобы определить абсолютный объем желудочков. Есть два коммерчески доступные системы для сбора данных давления объема в научно - исследовательской лаборатории и метода , используемого для расчета и удаления параллельной проводимости является основным различием между ними 6,10,11. Електропроводимостьи катетеры требуют инъекцию гипертонического раствора для расчета параллельной проводимости. Эта инъекция скоротечно изменяет проводимость крови в желудочке, в то время как проводимость стенки остается постоянной. Исходя из этих данных можно определитьсоставляющая сигнала проводимости, который берет свое начало из крови и что исходит от стенки желудочка. Такой подход предполагает, что параллельно проводимость не изменяется в течение сердечного цикла. Метод допуска зависит от фазовых превращений в электрическом поле, чтобы оценить вклад стенки желудочков к общему сигналу громкости. Этот метод основан на множестве заранее определенных констант для проводимости крови и миокарде, чтобы определить конечный объем, но делает непрерывные меры параллельной проводимости в течение сердечного цикла. Обе эти системы обеспечивают хорошие оценки объема левого желудочка и различия между ними, вероятно, не быть физиологически значимым. Цилиндрическая модель желудочка и других предположений делают эти катетерной подходы не столь точны, как другие методы, но эти данные предоставляются на основе ритм-по-ударом, который имеет важное значение для оценки нагрузки независимых мер сердечной функции.
Процедура , описанная здесь используется в моей лаборатории и предоставила данные для большого количества исследований по изучению основных патофизиологических механизмов дистрофических кардиомиопатия 12-18. Процедура, описанная ниже, является одним из двух, которые могут быть использованы для получения данных контура PV. В то время как многие принципы применимы для любого подхода, этот протокол будет сосредоточено на открытой грудной клетке верхушечного подхода; закрытый протокол грудной клетки был подробно описан в другом месте 19,20. В то время как процедура будет описана подробно, важные основополагающие принципы должны подвергать сердце с минимальным повреждением либо сердца или легких. На протяжении всего протокола, важно помнить, что это процедура непроявленности и имеющие хорошее воздействие на сердце является критически важным для правильного размещения катетера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Перед выполнением любой из процедур, описанных в этом протоколе, получить одобрение местного институционального ухода за животными и использование комитета.
1. Настройка экспериментального стенда
Примечание: Эта процедура выполняется на наркотизированных животных и качество данных, пропорциональна качеству анестезирующий поддержки , предлагаемых животному. Эта первая деталь секция будет оборудование и процедуры, необходимые для обеспечения анестезии с помощью мыши при выполнении этого протокола.
- Выберите анестезирующий протокол. Inhalant анестетики имеют много полезных свойств для проведения анализа PV-контура, хотя некоторые инъекционные протоколы были использованы также. Смотрите обсуждение для получения дополнительной информации о выборе обезболивающий режима.
- Безопасные сжатые баллоны с кислородом на операционном столе или на стене возле хирургического участка.
- При использовании Inhalant анестетиков, использовать испаритель, чтобы гарантироватьправильное дозирование. Калибруйте испарители ежегодно, чтобы обеспечить их предоставление соответствующей дозы анестезирующего газа. Подключение испарителей к расходомеру, который позволяет контролировать скорость, с которой газ поступает в контур анестетик. Установите на уровне 0,5 - 1,0 л / мин.
- Используйте коллектор, чтобы обеспечить направленный поток анестезирующего газа до 1) индукционную камеру, 2) маску и 3) вентилятор. Scavenging анестезирующего газа является критически важным и должно быть выполнено с помощью активной системы, либо вентиляционные отверстия в вытяжной шкаф (или другой аналогичной инфраструктурой здания) или через канистры, предназначенные для удаления анестезирующих газов.
Примечание: Проверьте с местными чиновниками гигиены труда , чтобы обеспечить соблюдение всех местных правил. - Поддерживать температуру тела с помощью грелки и / или согревающие лампы. Постоянно контролировать температуру тела с помощью ректального термометра. Это позволит упреждающих увеличивается или уменьшается при нагревании, чтобы обеспечить физиологическую температуру тела (ͭ6; 37 ° C) во время сбора гемодинамических данных.
- Обеспечить поддержку жидкости, чтобы противодействовать потере крови и нечувствительным потерю объема.
- Готовят 10% раствор альбумина в 0,9% NaCl, принимая по 1 мл 25% альбумина и добавлением 1,5 мл 0,9% физиологического раствора в шприце.
- Подготовьте низкий остаточный объем внутрисосудистого катетера.
- Используйте плоскогубцы, чтобы раздавить пластиковую втулку 0,5 дюйма 30 калибра иглы. Используя иглодержатели, возьмите иглу и снимите втулку. Скрип остатки клея с иглы с помощью кровоостанавливающего. Вставьте тупой конец иглы в длину microbore трубки. Используйте менее 20 дюймов длины для труб.
- Используйте шприцевой насос, чтобы обеспечить точные объемы поставок.
- Обеспечьте надлежащую вентиляцию для сбора данных PV высокого качества. Есть множество вентиляторов мыши, доступных для покупки. Давление под контролем вентиляторы обеспечивают закрытую среду, необходимую для ингаляционного аnesthetic газы и обеспечивают лучший контроль вентиляции во время процедуры.
- Убедитесь в том, что давление на вдохе ограничены <15 см H 2 O для предотвращения баротравмы. Установите вентилятор, чтобы доставить вдохе пульс в течение 35% дыхательного цикла. Применение положительного давления в конце выдоха (PEEP) на уровне 4 - 5 см H 2 O значительно улучшает вентиляцию мыши, предотвращая ателектаз легкого и поддержки газообмен.
- Ограничить мертвого пространства дистальнее Y-соединения в цепи вентиляторной. Это очень важно, потому что дыхательный объем мышки очень мала и любое мертвое пространство вычитает от поставки свежего вдыхаемого воздуха.
- Создание размера эндотрахеальной (ET) трубки мыши путем отрезания кончика прочь 20 калибра пребывающей внутрисосудистого катетера. Это обеспечивает коническую точку для более удобной вставки. Поместите конец врезается в Y-соединении схемы анестетика.
- Используйте гибкий шланг в дыхательных путяхцепь. Любая структурная память в трубке будет создавать внешние силы, которые имеют потенциал, чтобы вытащить эндотрахеальную трубку из дыхательных путей мыши.
- Пусть мышь определить частоту дыхания, используя самый низкий уровень, который подавляет эндогенное дыхательный привод. Начало на относительно медленной скорости дыхания около 60 вдохов в минуту.
Примечание: При надлежащей вентиляции мышь должна сделать очень мало усилий , чтобы дышать. Тем не менее, при недостаточной вентиляции, накопление СО 2 в крови будет инициировать дыхательные усилия с помощью мыши. Если это наблюдается, увеличение частоты дыхания является прямой способ для увеличения альвеолярной вентиляции. Часто бывает необходимо увеличивать частоту дыхания в ответ на повышение активности сердечной рабочей нагрузки, связанной с бета-адренергической стимуляции рецептора. - После того, как дыхательный контур готов, давление проверить систему путем подключения кончика эндотрахеальной (ET) трубкис пальцем. Обеспечить давление в дыхательных путях из ≈10 КМЗ 2 O. Этот тест следует проводить перед каждой процедурой.
2. Хирургический подход
- Используйте маленькие щипцы и ножницы и другое оборудование из таблицы 1. Все инструменты достаточно малы , чтобы позволить для легкого использования в увеличенных операционное поле. С помощью хирургического стереомикроскопа обеспечить адекватное увеличение для нескольких аспектов хирургической процедуры.
- Используйте прижигание, чтобы максимизировать гемостаза во время процедуры.
Примечание: Есть несколько широких классов прижиганием. Thermocautery нагревает тонкий металлический элемент, который будет прорезать мышечную ткань и остановить кровотечение. Эти системы изначально относительно недорогими; Тем не менее, важно отметить, что кончики проволоки являются хрупкими и относительно дорогостоящим. Electrocautery системы являются более дорогостоящими, чтобы купить на начальном этапе, но кончики очень прочные и не нужно будет заменитьd. - Индукционные и Хирургическая подготовка
- Получить массу тела мыши.
- Поместите мышь в индукционную камеру, которая заполнена 5% изофлуран.
Примечание: мышь не может выжить более чем на несколько минут в этой среде. Только 45 - 60 секунд требуется для мыши, чтобы потерять свои рефлекс (выпрямления усилия, чтобы перевернуться при размещении на его спине или на боку). - После того, как нужный рефлекс теряется, снизить изофлуран концентрации до 2% и открыть анестезирующего газа к маске.
- Быстро перевести курсор мыши на операционном столе и поместите его в спинных лежачее с его носом в маске.
- При использовании электрокоагуляции, используйте физиологический раствор, смоченную марлю для электрического соединения мышь к заземляющей колодки системы электрохирургической.
- Закрепить конечности с хирургической лентой. Эта лента обеспечивает адгезионные свойства даже во влажном состоянии.
- Вставьте ректального термозонда для основного контрольного органатемпература. Крепится с помощью ленты.
- Нанесите депиляции на шее и груди мыши. Подождите 2 - 3 мин для удаления волос на работу, а затем удалите шерсть из этих областей, используя ватным аппликатором и / или лабораторных салфеток.
Примечание: драпировке из операционного поля не требуется, поскольку это процедура непроявленности, но может быть желательно , чтобы ограничить воздействие хирурга к прижигания заземления колодки, если он используется. - После того, как мышь нацелен на операции, оценить хирургический плоскость мыши, выполняя схождения крайнем случае. После того, как уверены в соответствующей глубине анестетика мышь готова для первого разреза.
- Получить контроль воздушной трассы через оральной интубации или трахеотомии. Трахеотомии удобный подход, который относительно прост в исполнении.
Примечание: В данном описании процедурного все направления и ориентации будут по отношению к хирургу.- Сделайте надрез в то леVel грудины выемкой, простирающейся от ≈ 5 мм справа от средней линии до ≈ 5 мм слева от средней линии.
- Сделать второй надрез, проходящий вдоль правого края первого надреза, простирающийся ростральным до уровня ≈ 2 мм каудально по отношению к концу нижней челюсти.
- Сделать третий разрез, идущий от ростральной конца второго разреза к ≈ 5 мм слева от средней линии. Втяните полученный лоскут кожи влево, чтобы выставить основные ткани.
- Отделить околоушные и подчелюстные слюнные железы на средней линии по тупым. Это позволит раскрыть основные мускулатуру вышележащих трахеи.
- Попросту отделить правую и левую мышцы sternohyoideus, чтобы разоблачить трахеи.
- Передаёт ≈10 см кусок 3-0 шелковой нити под трахеи, следя за тем, чтобы не включать в пищевод.
- Определить место для трахеотомии: просто каудально по отношению к гортань существует разрыв до первого кольца трахеи, это идеял место для выполнения трахеотомии.
- Отрегулируйте коллектор, чтобы обеспечить анестезирующего газа к вентилятору и включите вентилятор.
- Проверить на наличие утечек, подключив кончик эндотрахеальной (ET) трубки с пальцем. Обеспечить давление в дыхательных путях из ≈10 cmH2O.
- Использование 20 иглы калибра как скальпель, надрезать трахеи. Сделать надрез относительно широкими, так как труба ЕТ заполнит большую часть трахеи просвет.
- Перемещение быстро, снимите маску и аккуратно вставьте трубку ET в трахею. Не заставляйте его, как ткани очень хрупкие и разбивая через стенку трахеи может привести к пневмотораксом.
Примечание: Сразу же после введения, грудь экскурсии должны стать очевидными. - Закрепите вентиляционную цепь с лентой, чтобы предотвратить трубки ET от вытягивания.
- Tie единый узел в сверху вниз 3-0 шовного материала, чтобы сформировать уплотнение вокруг трубки ET.
Примечание: В этой точке груди excursiдополнения должны быть отчетливо видно. Если не то, как правило позиционирование трубки ET в трахее, что является проблемой. Потяните трубку ET назад и попытаться изменить его, сосредоточив внимание на ориентации трахеи в качестве ориентира.
- Получение яремной вене сайта
- Отвод левые слюнные железы ростральной-боковом направлении, разоблачающих наружную яремную вену.
- Рассекают тонкой мышцы (sternomastoideus), покрывающий вену с тупым. Это подвергнет внешнюю поверхность яремной вены.
- Тщательно очистить от любых крупных кусков ткани, хотя осторожность должна быть использована в качестве стенки вены очень тонкие. После того, как эта задача будет завершена, покрывают яремную вену с слюнных желез, чтобы сохранить его для пункции позже.
- Thoracotomy; входя в плевральную полость , не повреждая сердце или легкие
- Удалите большую часть кожи, покрывающей грудь, расширяющий правый крайоригинальный кожа надрез вниз до уровня мечевидного отростка, а затем через срединную линию до ≈ 1,5 см слева от средней линии.
Примечание: Следует соблюдать осторожность при резке через внешние молочных сосудов, что может быть существенным источником кровотечения. Прижигание эти суда, прежде чем их сокращения будет в значительной степени предотвратить это кровотечение. - Используя отслаивания, втяните кожный лоскут в боковом направлении, чтобы выставить основной мускулатуру.
- Изолировать введение грудную мажор на правой стороне рядом с каудальной грудины с использованием сосуда расширяющий щипцов. Прижигание и разрезают мышцы.
- Разрезать грудную майора вдоль ее прикрепления к грудине. Cauterize обрезных кромок для обеспечения гемостаза.
- Далее подорвать широчайшие мышцы спины на той же стороне, что является большой лист мышцы покрытия латеральной мыши. Прижигание и сократить эту мышцу, а затем убрать отрезанного конца краниально. Это может потребовать некоторых тупыерассечение.
Примечание: Ребра теперь ясно видно , и сердце может быть также видны в некоторых штаммов мыши. В большинстве мышей, входя в грудь в каудальной половине четвертого межреберья обеспечит хороший доступ к сердцу. Четвертое межреберье является вторым наиболее каудально пространство. - Для входа в грудь, используйте пару острых щипцов тщательно проанализируем вниз через межреберные слои мышц.
- После плевральной полости был открыт, аккуратно вставьте тупым наконечником расширители сосудов. Использование расширители сосудов, чтобы обеспечить мягкое направленное вверх усилие на стенки грудной клетки, используйте тупым концом пружинные ножницы, чтобы тщательно надрезать остаток межреберных мышц.
- Во-первых вырезать в боковом направлении, стараясь не порезать доли легкого внизу. Далее продлить разрез медиально, но при этом оставаться 3 - 4 мм сбоку от средней линии, чтобы избежать внутренней грудной артерии.
Примечание: внутренние грудные сосуды проходят параллельно грудинеи может привести к значительной потере крови, если вырезать случайно. - Тщательно прижечь обрезанный край межреберных мышц, с помощью небольшой ватной палочки, чтобы катить ткани вверх, чтобы обеспечить прижиганием контакт с вырезом ткани, не вступая в контакт с легких или сердца.
- Поместите солевым пропитанной небольшой ватную палочку через разрез, указывая в сторону от средней линии. Обеспечить нежную вверх тягу, чтобы потянуть стенки грудной клетки от базовых структур. Начинают прижигание стенки грудной клетки у медиального края разреза и заканчивая ≈ 1 см латеральнее от средней линии на левой стороне.
- Авансовые аппликатор влево так, чтобы она непрерывно под кончиком прижигания.
- После того, как ткань тщательно прижигали, используйте ножницы, чтобы тщательно прорезать грудины. Верхушка сердца должна быть четко видна в этой точке.
- Использование тупым, нарушить перикарда и идентифицировать хвостового полую вену.
- Проверить на наличие каких-либо кровотечения и прижечь его сейчас. После того, как все кровотечение было адресовано, аккуратно удалите драпировке, на прижигание заземления площадку, и солевым пропитанной марли.
- Удалите большую часть кожи, покрывающей грудь, расширяющий правый крайоригинальный кожа надрез вниз до уровня мечевидного отростка, а затем через срединную линию до ≈ 1,5 см слева от средней линии.
- Размещение катетеру яремной вене
- Подключите катетер, сделанное на этапе 1.6.2 в шприц, содержащий 10% альбумина, тщательно пряча трубку в течение 30-иглу калибра.
- Начинают вливание альбумина через катетер.
- Сориентируйте катетер таким образом, что игла лежит на яремную вену на своей собственной, с иглой скосом вверх. При необходимости, используйте держатель иглы, чтобы повернуть иглу в трубку, чтобы переместить скос к правильной ориентации.
- Когда катетер полностью очищено остановить вливание.
- Возьмитесь катетера иглы с пинцетом. С другой стороны, использование щипцов ткани, чтобы убрать слюнные железы, чтобы визуализировать яремной вены. Нанесите нежную тягу к тканям, окружающих дистального яремную венувены создавая напряженность на стенке сосуда. Используя неглубокую угол подхода, осторожно вставить иглу в вену. Авансовые кончик иглы 3 - 4 мм в сосуд.
- Перед тем как отпустить катетер иглы фиксации трубки катетера с куском ленты, это ограничит любое движение иглы после освобождения.
- Отпустите иглу и осторожно потянуть назад на поршень шприца, чтобы подтвердить, что катетер находится в просвете сосуда, визуализацией крови в линии.
- После размещения в месте должным образом закрепить катетер с хирургическим клеем, чтобы прикрепить иглу к основным слюнных желез.
- Вычислить общий объем подлежащего инфузии. Если не было значительной потери крови объемом 5 мкл / г массы тела будет достаточно. Если была значительная потеря крови вливая 6 - 6,5 мкл / г может потребоваться. Установите скорость потока таким образом, что весь настой будет завершена в 10 - 15 мин.
- PV Катетер Размещение вЛевый желудочек
- Во время хирургической процедуры, описанной выше, поместите PV катетер в шприц, содержащий солевой раствор, чтобы позволить ему уравновешиваться.
- Незадолго до размещения, перемещения шприца и катетера рядом с мышью. С кончика катетера примерно на том же уровне, что и сердце, обнулить показания давления.
- Используя солевой вымачивают небольшой хлопок наконечником аппликатором, маневрировать сердце, чтобы обеспечить визуализацию вершины.
- С помощью иглы калибра 25, делают надрез ножом как можно ближе к центру вершины, как это возможно.
- После удаления иглы, быстро вставить катетер через разрез. Это не займет много сил, чтобы вставить катетер, поэтому проявлять сдержанность при продвижении катетера в желудочке. Время от времени необходимо проводить дополнительную ножевое надрез. Если это необходимо, попытайтесь выполнить последующую надрез вблизи исходного положения, чтобы свести к минимуму повреждения сердца.
Нее: После того , как катетер продвигают в желудочке окончательное размещение имеет решающее значение. Трассировка желудочков давление будет очевидно низким диастолического давления (<10 мм рт.ст.) и высокого давления (систолического> 80 мм рт.ст. в этой точке). В идеальном случае, катетер будет центрирован в желудочке с внешними электродами только в пределах желудочка. Точная регулировка в положении катетера может быть выполнена путем наблюдения данных PV-контура, ищет отслеживании коробчатой с ≈ 90 ° углы между сторонами.
3. Процедурные детали
Примечание: После того , как катетер на месте короткий период стабилизации (10 - 15 мин) необходимо , чтобы позволить животному , чтобы оправиться от некоторых из острого хирургического стресса и дать время для вливания жидкостей. После этого периода стабилизации фактический протокол может начаться.
- После того, как PV катетер и хирургических манипуляций прекратилось,убавьте изофлуран к ≈ 1%, так как потребность в глубокой хирургической плоскости анестезии уменьшается.
- В течение этого периода, тщательно следить за мышь, чтобы обеспечить надлежащий уровень анестезии поддерживается. Тщательно оценить любое движение; движение дыхательных мышц предполагает уровень гиповентиляции и может быть решена за счет увеличения частоты дыхания в искусственной вентиляции легких. Движение конечностей или подергивание усов признаки того, что мышь становится слишком легким и требует большего количества анестетика.
Примечание: Есть большое разнообразие перестановок лечения , которые могут быть использованы в комбинации с этим протоколом. Многие из этих методов лечения потребует вливания лекарств. Крайне важно, чтобы эффективно управлять объемом мертвого пространства. переключатели решение может быть достигнуто путем перемещения трубки катетера от иглы из одного шприца в другой. Делать это незадолго до конца предыдущей инфузии позволяет катетер трубки должен быть загруженсо следующего препарата. Необходимо знать объем внутри трубки катетера для определения времени выключателя раствора. Введение небольшого пузырька воздуха в линии позволяет точное время перехода для инфузии, чтобы определить; этот пузырь вливаются в венозное кровообращение хорошо переносится.
- В течение этого периода, тщательно следить за мышь, чтобы обеспечить надлежащий уровень анестезии поддерживается. Тщательно оценить любое движение; движение дыхательных мышц предполагает уровень гиповентиляции и может быть решена за счет увеличения частоты дыхания в искусственной вентиляции легких. Движение конечностей или подергивание усов признаки того, что мышь становится слишком легким и требует большего количества анестетика.
- Alter условий нагружения сердца, снижая преднагрузку и увеличивая постнагрузку.
- Снижение преднагрузки путем блокирования венозного возврата к сердцу. В этом препарате, визуализировать и закупоривать хвостового полая вена, как она проходит от диафрагмы к сердцу. Выполните эту преграду плавно и относительно быстро, продолжительностью не более 2 - 3 сек. Увеличение левого желудочка постнагрузку скоротечно, выполняя нежную брюшную сжатие продолжительностью 1 - 2 сек.
- В ходе этих изменений в нагрузке сердца, пауза дыханий для устранения любой артефакт, введенный в искусственной вентиляции легких.
- Калибровка сигнала громкости с помощью юе. проводимости катетеры Эти процедуры не нужны катетеры с использованием технологии допуска.
- После экспериментального протокола вводят 5 - 10 мкл гипертонического раствора (20% NaCl), чтобы вычислить параллельную электрическую проводимость.
- Собирают кровь путем удаления катетера и забора крови из левого желудочка в гепаринизированной шприца. Поместите эту кровь в кювет известного объема и использовать катетер для измерения проводимости.
- С помощью мер кювета проводимости для преобразования сигнала проводимости в объеме и параллельный Проводимость необходимо определить абсолютный объем, измеренный с помощью катетера.
- После того, как протокол завершен, эвтаназии мышь путем удаления сердца следуя перерезки полая вена и вложения аорте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с соглашением, объем откладывается по оси Х и давления на Y-оси , как на рисунке 1. Петли давления объема в результате черчения давления на объем должен напоминать прямоугольник, вертикальные ребра , представляющие изоволюмического изменения давления (то есть, когда оба митрального и аортального клапанов закрыты). Нижняя горизонтальная представляет желудочковой заполнение через митральный клапан и верхней горизонтальной части представляет желудочковую опорожнение через аортальный клапан. В здоровой мыши дикого типа левого желудочка давлением 90 - 110 мм ртутного столба , как ожидается , с максимальным Dp / DT 8000 - 12000 мм рт.ст. / с (см таблицу 1 для диапазонов нормальных гемодинамических параметров). Нормальные диапазоны, приведенные в таблице, основаны на значениях, полученных от дикого типа мышей C57BL / 10 и C57BL / 6; Тем не менее, важно отметить , что существуют значительные различия между штаммами 21. Процедура выводаutlined здесь фокусируется на использовании верхушечного колотой разреза в положение катетера внутри левого желудочка. Другой популярный подход, чтобы вставить катетер через ретроградного аортального клапана следующее введение катетера в правой сонной артерии. Ретроградный подход как преимущество в том, что она может быть выполнена с закрытой грудью, что приводит к поддержанию нормального внутри грудной клетки давления; Тем не менее, животные часто вентилируемые во время этой процедуры, которая ограничивает это преимущество. Закрытые пределы грудной клетки подход контроль над ориентацией катетера внутри желудочка, в то время как подход открытых груди обеспечивает большую возможность для маневра катетер внутри желудочка. Потенциальная проблема с ретроградным введением катетера является возможность обструкции оттока дорожки. Диаметр аорты мыши изменяется от 0,8 до 1,2 мм 22,23, диаметр коммерчески доступных катетеры давление-объем в диапазоне от 0,33 (1,0 французском) до 0,47 мм (1,4 ФреNCH). Относительные размеры этих катетеров в контексте большого и малого аорте изображены на рисунке 2. Фракцию пути оттока перекрыт катетера , пересекающей аорту может стать серьезной проблемой в меньших сердца и должны быть приняты во внимание при выполнении исследования цикла PV в маленьких сердцах. Есть несколько артефактов измерения, которые могут осложнить анализ данных PV, один из наиболее распространенных является катетер провокация. Это проявляется как всплеск давления в конце систолы , вероятно , в результате прямого прессования датчика давления с помощью папиллярной мышцы или другой динамической структуры в желудочке (рис 3). Это проблематично, так как большинство методов для определения функции систолического используют максимальное давление. Систолическое давление и максимальная производная от давления (Dp / DT) из наборов данных с катетером защемления необходимо внимательно изучить и анализ, возможно, должны быть изменены, чтобы получить значимые данные,
петли давление-объем может быть использован в самых разнообразных протоколов для оценки функции сердца. Они включают в себя оценку сердечного резерва через бета-адренергические стимуляции 12,14,16,17. Широкое разнообразие препаратов можно вливать для оценки каких-либо острых эффектов на физиологии сердца. Контроль воздушной трассы позволяет также введение измененными газовых смесей , позволяющих эффекты гипоксии и / или ацидоза на функцию сердца , чтобы быть адресованы непосредственно 24-27. Кроме того, анализ этих данных PV может также предоставить подробную оценку пассивных свойств левого желудочка, который может значительно изменяться в различных болезненных состояниях 12.
| параметр | Нормальный диапазон |
| Систолическое давление | 90 - 110 мм рт.ст. |
| диастолическое давление | 4 - 10 мм рт.ст. |
| Максимальная дР / д | 8000 - 12000 мм рт.ст. / сек |
| Минимальное дР / DT | -8,500 - -12,000 Мм рт.ст. / сек |
| Тау | 5 - 6 сек |
| Частота сердцебиения | 550 - 600 ударов в минуту |
| Сердечный выброс | 10 - 13 мл / мин |
| выброс Фракция | 40 - 60% |
Таблица 1. Нормальные значения для выбранных параметров гемодинамики.
Рисунок 1: Типичные петли давление-объем от дикого типа C57BL / 10 Mouse данных , отображающих, которые были собраны с использованием процедур , описанных в Thi.s рукопись. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схематическое изображение Важность Аортальной диаметра и потенциального Отток Track непроходимости Схематическое изображение относительных размеров аорты мыши и коммерчески доступных катетеры давления объема для мышей.. Эти данные подчеркивают важность рассмотрения обструкции следа оттока при оценке мелких мышей с использованием ретроградного ввода катетера подход. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть три важных шагов в этой процедуре: 1) размещение интубационной трубки и соответствующей вентиляции, 2) размещение яремной IV катетера, и 3) надлежащее размещение PV катетера в левом желудочке. Определение подходящего дыхания является важной частью обеспечения респираторной поддержки. Сознательные мышей, как правило поддерживать альвеолярной вентиляции с быстрым неглубоких вдохов. В общем, вентилируемые мышей будут иметь намного большие объемы приливные. Таким образом, медленнее, частота дыхания требуется. Это важно, поскольку слишком мало вентиляции приведет к респираторного ацидоза и слишком много вентиляции приведет к респираторного алкалоза, как условия, которые изменяют функции сердца. Простой способ оптимизации частоты дыхания является принимать сигналы от дыхательных усилий мыши и использовать самую низкую частоту дыхания, которая устраняет дыхательные усилия от наркоза мыши.
Отличительным признаком контура PVанализ является поддержание достаточного уровня анестезии без значительного снижения функции сердца. Есть много обезболивающие режимы, которые могут быть успешно применены для выполнения анализа контура PV. Их можно разделить на две широкие категории: летучими и инъекционные анестетики. В пределах этой последней группы множество смесей , которые могут быть использованы, однако, многие из этих смесей , имеют потенциальные кардио-депрессивное действие 19. Инъекционной коктейлей, уретановые на основе анестетики имеют наименьшее количество кардио-депрессивные эффекты 4,19. Позаботьтесь , чтобы ограничить воздействие на персонал уретана как это канцероген 28. Isoflurane и севофлураном являются имеющиеся в настоящее время ингаляционные анестетики. Оба эти агенты имеют сердечно-депрессивные эффекты в дозах, достаточных для хирургических манипуляций. Важно отметить, что ингаляционные анестетики могут быть титрованию эффекта. Это позволяет более высокую дозу анальгезирующее во время хирургической подготовки, а затем нижний SEDATАйв доза для измерения сердечной функции, тем самым сводя к минимуму сердечно-депрессивные эффекты этих соединений.
Если гемодинамические параметры находятся ниже нормального уровня, существует несколько распространенных причин. Во-первых низкий объем крови, вторичным по отношению к потере крови или испарения. Это осложнение обычно решаются с введением жидкости, описанной в разделе 2.7. Как уже отмечалось в разделе 1.5, поддержание температуры тела ядра также очень важно для оценки функции гемодинамической. Таким образом, необходим тщательный контроль имеет важное значение, цифровая система обратной связи может быть полезным для поддержания температуру тела во время записи. Обеспечение того, что обезболивающее средство было должным образом уменьшено во время измерения фазы также является важным аспектом улучшения работы сердца.
Измерение не зависит от нагрузки параметров сократимости является одним из основных преимуществ анализа контура PV. В режиме реального времени одновременного сбора давления и тумэ данных обеспечивает уникальную способность измерять гемодинамические изменения в ответ на изменения условий нагрузки на сердце. Этот анализ позволяет сократительной функции сердца, чтобы быть изолированы от действий судов. Снижение преднагрузки через окклюзии венозного возврата, были использованы для оценки не зависит от нагрузки меры сократимости во многих моделях животных и человека 4,7,12-16,18,29-32. В мелких грызунов, эта процедура приводит к конечного систолического давления объемного отношения криволинейной 4,31,33. Это , вероятно , связано с сокращением в коронарной перфузии , что значительно ускоряет снижение систолической функции 34. У мышей, 2 - 3 сек нежных брюшных результатов сжатия в сдвига вправо ФВ петли. Это происходит в результате как увеличения постнагрузки и преднагрузки 12. Продолжительное увеличение постнагрузки результате в увеличении сократительной функции, феномен называется эффектом Анрепа 35. Однакокороткая продолжительность брюшной сжатия, используемых в этих исследованиях, указывает на то, что эффект Анрепа не влияет на функцию сердца с помощью этой процедуры. В других исследованиях, острый сужением аорты у собак было продемонстрировано увеличение сократительной функции, но это было сделано предположение, является результатом воздействия пониженной системной перфузии 36. Опять же продолжительность и тяжесть срыву аортального кровотока вследствие абдоминальной компрессии, как описано здесь, не достаточно, чтобы значительно увеличить сократительную функцию вторичной по отношению к гипо- перфузия системных тканей. Анализ петель PV, полученных брюшной сжатия хорошо согласуются с петель PV, полученных вскоре после каудальной полой вене окклюзии. Вместе эти наблюдения показывают, что переходный процесс брюшной полости сжатия, описанный здесь не приводит к существенному изменению сократительной способности сердца. Кроме того, эта процедура представляет собой важный метод для оценки пассивных свойств сердца в более широком RANGE конечных диастолического объемов.
Анализ не зависит от нагрузки мер требует выбор конкретных PV петли, которые будут включены в анализ. Крайне важно, чтобы это было сделано последовательно во всех экспериментального набора данных. Положительная вентиляция давления создает гемодинамический артефакт через дыхательные зависимых изменений преднагрузки на левый желудочек 37. Чтобы избежать этого артефакта, петли PV должны быть собраны в течение коротких периодов апноэ (3 - 4 сек). Паузы в дыхании, особенно полезны, поскольку они обеспечивают более эффективный контроль экспериментальных изменений в нагрузке на сердце. Важно, чтобы эти периоды апноэ короткие, чтобы избежать гиповентиляция. Процедуры, описанные в этой рукописи сбор данных не зависит от нагрузки от двух различных процедур, в каудальной полой вене окклюзии и брюшной сжатия, собранных примерно в то же самое время. Петли, выделенные из этих двух процедур должны быть объединены и проанализированы togethэр, поскольку они оба измеряют функцию того же сердца под, примерно, те же самые условия. Есть несколько принципов, которые следует учитывать при выборе петли для анализа. Избегайте аритмичные ударов. Удар после упал ритм всегда ненормально большой и экстрасистолия аномально малы; и нарушит анализ данных. Избегайте ударов, где давление падает, но объем постоянен. Они распространены в мыши после окклюзии каудальной полой веной и, вероятно, вторичными по отношению к недостаточной перфузии миокарда. И, наконец, включают только данные ударов непосредственно после изменения нагрузки; биения в период восстановления, вероятно, влияют изменения в симпатической нервной деятельности вторичной по отношению к изменениям системного артериального давления в результате манипуляций условий нагружения сердца.
Анализ контура PV обеспечивает чрезвычайно детальную оценку функции сердца. При применении в сочетании с генетическим Flexниках и низкие затраты на корпусе мыши может обеспечить практические средства оценки физиологии сердца на молекулярном уровне. Есть несколько важных ограничений, которые необходимо учитывать при принятии решения для выполнения этих анализов. Во-первых, это инвазивная процедура, в которой наркозом мышей, которые могут повлиять на важные аспекты сердечной функции. Кроме того, интерпретация данных контура PV требует детального понимания физиологии сердца как для выявления закономерностей в данных и возможных вмешивающихся переменных. Кроме того, поскольку эти анализы являются терминальными они не могут быть использованы для оценки той же мыши повторно. Объемы желудочковые, полученные из фотогальванических катетеры имеют тенденцию быть менее точными, чем анатомических объемов желудочков, предоставляемых МРТ. Это не удивительно, так как PV катетеры модель желудочек в виде цилиндра, который, несомненно, является оценка общего объема желудочка. Реальная сила является способность собирать эту информацию тома на высоком Freтота, таким образом позволяя биений к удару анализ изменения объема желудочков.
Сбор и анализ данных PV от мыши может быть сложной задачей, но метод предоставляет информацию о сердечной функции, которая не доступна через любой другой методологии. Эта процедура обеспечивает наиболее полную картину сердечной функции доступны и его использование в мышиной модели обеспечит важную платформу для определения молекулярных основ сложных состояний сердечных заболеваний, таких как сердечная недостаточность и унаследованных кардиомиопатии. Эта рукопись содержит подробную информацию о наиболее важных аспектах выполнения этой процедуры. Тем не менее, как и все сложные процедуры, это требует практики, чтобы построить микрохирургические навыки, которые необходимы для успешного выполнения этих экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Автор хотел бы отметить финансирование от NHLBI (K08 HL102066 и R01 HL114832).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont 5/45 (2) | Fine Science Tools | 11251-33 | |
| Vessel Dilating Forceps | Fine Science Tools | 18153-11 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissor | Roboz Instruments | RS-5668 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Curved | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Straight | Fine Science Tools | 11040-08 | |
| Dissector Scissors- Heavy Blade | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| 3-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| TOPO Ventilator | Kent Scientific | TOPO | |
| Martin ME 102 Electrosurgical Unit | Harvard Apparatus | PY2 72-2484 | |
| Syringe Pump | Lucca Technologies | GenieTouch | |
| Stereomicroscope with boom stand | Nikon | SMZ-800N | |
| Thermocouple Thermometer | Cole Parmer | EW-91100-40 | |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Data Acquision and Analysis | DSI | Ponemah ACQ-16 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), e29-e322 (2015).
- Katz, A. M. Influence of altered inotropy and lusitropy on ventricular pressure-volume loops. J Am Coll Cardiol. 11 (2), 438-445 (1988).
- Kass, D. A., Maughan, W. L. From "Emax" to pressure-volume relations: a broader view. Circulation. 77 (6), 1203-1212 (1988).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 274 (4 Pt 2), H1416-H1422 (1998).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Feldman, M. D., et al. Validation of a mouse conductance system to determine LV volume: comparison to echocardiography and crystals. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279 (4), H1698-H1707 (2000).
- Baan, J., et al. Continuous measurement of left ventricular volume in animals and humans by conductance catheter. Circulation. 70 (5), 812-823 (1984).
- Salo, R. W., Wallner, T. G., Pederson, B. D. Measurement of ventricular volume by intracardiac impedance: theoretical and empirical approaches. IEEE Trans Biomed Eng. 33 (2), 189-195 (1986).
- Wei, C. L., et al. Volume catheter parallel conductance varies between end-systole and end-diastole. IEEE Trans Biomed Eng. 54 (8), 1480-1489 (2007).
- Kutty, S., et al. Validation of admittance computed left ventricular volumes against real-time three-dimensional echocardiography in the porcine heart. Exp Physiol. 98 (6), 1092-1101 (2013).
- Kottam, A., Dubois, J., McElligott, A., Henderson, K. K. Novel approach to admittance to volume conversion for ventricular volume measurement. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2514-2517 (2011).
- Meyers, T. A., Townsend, D. Early right ventricular fibrosis and reduction in biventricular cardiac reserve in the dystrophin-deficient mdx heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (4), H303-H315 (2015).
- Townsend, D., Yasuda, S., Li, S., Chamberlain, J. S., Metzger, J. M. Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther. 16 (5), 832-835 (2008).
- Townsend, D., et al. Systemic administration of micro-dystrophin restores cardiac geometry and prevents dobutamine-induced cardiac pump failure. Mol Ther. 15 (6), 1086-1092 (2007).
- Strakova, J., et al. Dystrobrevin increases dystrophin's binding to the dystrophin-glycoprotein complex and provides protection during cardiac stress. J Mol Cell Cardiol. 76, 106-115 (2014).
- Yasuda, S., et al. Dystrophic heart failure blocked by membrane sealant poloxamer. Nature. 436 (7053), 1025-1029 (2005).
- Townsend, D., Daly, M., Chamberlain, J. S., Metzger, J. M. Age-dependent dystrophin loss and genetic reconstitution establish a molecular link between dystrophin and heart performance during aging. Mol Ther. 19 (10), 1821-1825 (2011).
- Townsend, D., Yasuda, S., McNally, E., Metzger, J. M. Distinct pathophysiological mechanisms of cardiomyopathy in hearts lacking dystrophin or the sarcoglycan complex. FASEB J. 25 (9), 3106-3114 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect. J Vis Exp. (100), e52618-e52618 (2015).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiol Genomics. 42A (2), 103-113 (2010).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (5), H1829-H1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
- Palpant, N. J., Day, S. M., Herron, T. J., Converso, K. L., Metzger, J. M. Single histidine-substituted cardiac troponin I confers protection from age-related systolic and diastolic dysfunction. Cardiovasc Res. 80 (2), 209-218 (2008).
- Palpant, N. J., D'Alecy, L. G., Metzger, J. M. Single histidine button in cardiac troponin I sustains heart performance in response to severe hypercapnic respiratory acidosis in vivo. FASEB J. 23 (5), 1529-1540 (2009).
- Palpant, N. J., et al. Cardiac disease in mucopolysaccharidosis type I attributed to catecholaminergic and hemodynamic deficiencies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H356-H365 (2011).
- Townsend, D. Diastolic dysfunction precedes hypoxia-induced mortality in dystrophic mice. Physiol Rep. 3 (8), e12513 (2015).
- Schmähl, D., Port, R., Wahrendorf, J. A dose-response study on urethane carcinogenesis in rats and mice. Int J Cancer. 19 (1), 77-80 (1977).
- Freeman, G. L., Little, W. C., O'Rourke, R. A. The effect of vasoactive agents on the left ventricular end-systolic pressure-volume relation in closed-chest dogs. Circulation. 74 (5), 1107-1113 (1986).
- Reyes, M., et al. Enhancement of contractility with sustained afterload in the intact murine heart: blunting of length-dependent activation. Circulation. 107 (23), 2962-2968 (2003).
- Segers, P., et al. Conductance catheter-based assessment of arterial input impedance, arterial function, and ventricular-vascular interaction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (3), H1157-H1164 (2005).
- Townsend, D., et al. Chronic administration of membrane sealant prevents severe cardiac injury and ventricular dilatation in dystrophic dogs. J Clin Invest. 120 (4), 1140-1150 (2010).
- Sato, T., Shishido, T., et al. ESPVR of in situ rat left ventricle shows contractility-dependent curvilinearity. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 274 (5 Pt 2), H1429-H1434 (1998).
- Sunagawa, K., et al. Effects of coronary arterial pressure on left ventricular end-systolic pressure-volume relation of isolated canine heart. Circ Res. 50 (5), 727-734 (1982).
- Cingolani, H. E., Pérez, N. G., Cingolani, O. H., Ennis, I. L. The Anrep effect: 100 years later. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H175-H182 (2013).
- Baan, J., van der Velde, E. T. Sensitivity of left ventricular end-systolic pressure-volume relation to type of loading intervention in dogs. Circ Res. 62 (6), 1247-1258 (1988).
- Rankin, J. S., Olsen, C. O., et al. The effects of airway pressure on cardiac function in intact dogs. Circulation. 66 (1), 108-120 (1982).
