Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la collecte de données de pression-volume de la souris.
Abstract
Comprendre les causes et la progression de la maladie cardiaque présente un défi important pour la communauté biomédicale. La flexibilité génétique de la souris offre un grand potentiel pour explorer la fonction cardiaque au niveau moléculaire. La petite taille de la souris présente des défis en ce qui concerne l'exécution phénotypage cardiaque détaillée. Miniaturisation et d'autres progrès technologiques ont fait de nombreuses méthodes d'évaluation cardiaque possible chez la souris. Parmi ceux-ci, la collecte simultanée des données de pression et de volume fournit une image détaillée de la fonction cardiaque qui ne sont pas disponibles par le biais de toute autre modalité. Voici une procédure détaillée pour la collecte de données en boucle pression-volume est décrit. Inclus est une discussion sur les principes qui sous-tendent les mesures et les sources potentielles d'erreur. la gestion Anesthetic et approches chirurgicales sont discutées en détail car ils sont à la fois critique pour obtenir la mesure hémodynamique de haute qualités. Les principes du développement du protocole hémodynamique et les aspects pertinents de l'analyse des données sont également abordées.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires continue d'être une cause importante de mortalité et de morbidité dans le monde entier 1. Les maladies du cœur présentent des défis particulièrement difficiles dans le développement de nouvelles thérapies. Les progrès en génétique prévoient la possibilité d'identifier une multitude de contributeurs potentiels génétiques au développement de maladies cardiaques. Le caractère intégrateur du système cardio-vasculaire exige que ces cibles génétiques validés dans des modèles animaux intacts. La flexibilité et le faible coût du logement génétiques de la souris ont apporté à l'avant-garde pour l'évaluation du rôle physiologique d'un gène donné. La petite taille de la souris présente des défis uniques pour l'évaluation de la fonction cardiaque. Il existe plusieurs modalités qui peuvent fournir des informations sur la fonction cardiaque, mais seule la mesure simultanée de la pression et du volume ventriculaire permet pression-volume (PV) d'analyse de la boucle de la fonction ventriculaire. PV boucles toutoe la fonction cardiaque devant être analysé indépendamment de sa connexion au système vasculaire; un facteur important pour déterminer le rôle fonctionnel d'un élément génétique particulier.
L'évaluation des boucles pression-volume a été utilisé expérimentalement et cliniquement depuis de nombreuses années et abondante littérature existe en ce qui concerne l'analyse de ces ensembles de données 2,3. L'adaptation de la technologie de boucle PV à la souris a été un progrès important pour la compréhension de la physiologie cardiaque murin 4-6. Cathéter à base couplent technologies de boucle PV un capteur de pression et l'utilisation de conductance pour estimer le volume ventriculaire. Le volume ventriculaire est déterminée en examinant les variations d'un champ électrique généré par le cathéter. Cette méthode modélise le ventricule d'un cylindre, dont la hauteur est définie par la distance entre les électrodes sur le cathéter et le rayon est calculé à partir de conduction d'un champ électrique à travers le sangle ventricule 7-9. Le signal de conductance mesuré par le cathéter comporte deux volets. Le premier est la conduction à travers le sang; celle-ci varie avec le volume du ventricule et constitue le signal principal utilisé pour déterminer le volume ventriculaire. Le second composant résulte de la conduction à travers et le long de la paroi du ventricule. Ceci est appelé conductance parallèle et doit être retiré afin de déterminer le volume ventriculaire absolue. Il existe deux systèmes disponibles dans le commerce pour la collecte de données pression-volume dans le laboratoire de recherche et la méthode utilisée pour calculer et retirer la conductance parallèle est la principale différence entre les 6,10,11. cathéters de conductance nécessitent l'injection d'une solution saline hypertonique pour le calcul de la conductance parallèle. Cette injection modifie transitoirement la conductivité du sang dans le ventricule, tandis que la conductivité de la paroi reste constante. A partir de ces données, il est possible de déterminer lacomposante du signal de conductance qui provient du sang et provient de ce que la paroi ventriculaire. Cette approche suppose que la conductance parallèle ne varie pas au cours du cycle cardiaque. La méthode d'admission repose sur des changements de phase dans le champ électrique pour évaluer la contribution de la paroi ventriculaire au signal de volume global. Cette méthode repose sur une série de constantes prédéterminées pour la conductivité du sang et du myocarde afin de déterminer le volume final, mais permet des mesures en continu de la conductance parallèle au cours du cycle cardiaque. Ces deux systèmes fournissent de bonnes estimations du volume ventriculaire gauche et les différences entre eux ne sont pas susceptibles d'être physiologiquement significative. Le modèle cylindrique du ventricule et d'autres hypothèses rendent ces approches à base de cathéter pas aussi précis que d'autres modalités, mais ces données sont fournies sur une base battement par battement qui est essentiel pour l'évaluation de la charge des mesures indépendantes de la fonction cardiaque.
La procédure décrite ici est utilisée dans mon laboratoire et a fourni des données pour un grand nombre d'études portant sur les mécanismes physiopathologiques de base de dystrophique cardiomyopathie 12-18. La procédure décrite ci-dessous est l'un des deux qui peut être utilisé pour obtenir des données de boucle PV. Bien que bon nombre des principes sont applicables pour les deux approches, ce protocole mettra l'accent sur une approche apical à thorax ouvert; un protocole de poitrine fermée a été détaillée ailleurs 19,20. Alors que la procédure sera décrite en détail, les principes généraux importants pour exposer le cœur avec un minimum de dommages, soit le cœur ou les poumons. Tout au long du protocole, il est important de se rappeler que c'est une procédure non-survie et que d'avoir une bonne exposition du cœur est d'une importance cruciale pour la bonne mise en place du cathéter.
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Protocol
Avant d'effectuer les procédures décrites dans ce protocole, obtenir l'approbation par le comité local de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle.
1. Configuration du Rig expérimental
Remarque: Cette procédure est réalisée sur des animaux anesthésiés et la qualité des données est proportionnelle à la qualité de l'appui offert à l' anesthésie de l'animal. Ce premier détail section volonté de l'équipement et les procédures nécessaires pour fournir une anesthésie à la souris tout en effectuant ce protocole.
- Sélectionnez un protocole anesthésique. Les anesthésiques inhalés ont de nombreuses propriétés bénéfiques pour la réalisation d'une analyse en boucle PV, bien que certains protocoles injectables ont été utilisés aussi bien. Voir la discussion pour plus d'informations sur le choix d'un régime anesthésique.
- Fixer des réservoirs comprimés d'oxygène à la table chirurgicale ou d'un mur à proximité du site chirurgical.
- Si l'utilisation d'anesthésiques inhalés, utiliser un vaporisateur pour assurerdosage approprié. Calibrer vaporisateurs annuellement afin d'assurer qu'ils fournissent la dose appropriée de gaz anesthésique. Connectez vaporisateurs à un débitmètre qui permet de contrôler la vitesse à laquelle le gaz pénètre dans le circuit d'anesthésie. Situé à 0,5 à 1,0 L / min.
- Utiliser un collecteur pour permettre un écoulement dirigé de gaz anesthésiant à 1) la chambre d'admission, 2) un masque, et 3) le ventilateur. Scavenging gaz anesthésique est très important et doit être effectuée par un système actif qui soit évents dans une hotte (ou d'autres infrastructures de construction similaire) ou par l'intermédiaire d'une cartouche destinée à éliminer les gaz anesthésiques.
Remarque: Vérifiez auprès de responsables de la santé au travail locaux pour assurer la conformité à toutes les réglementations locales. - Maintenir la température du corps en utilisant les coussins chauffants et / ou des lampes chauffantes. surveiller en continu la température du corps avec un thermomètre rectal. Cela permettra à des augmentations ou des diminutions proactives dans le chauffage pour assurer une température physiologique du corps (ͭ6; 37 ° C) pendant la collecte des données hémodynamiques.
- Fournir un soutien fluide pour contrer la perte de sang et la perte de volume insensible.
- Préparer une solution à 10% d'albumine dans 0,9% de NaCl en prenant 1 ml de 25% d'albumine et en ajoutant 1,5 ml de NaCl à 0,9% dans une seringue.
- Préparer un faible volume résiduel intravasculaire.
- Utilisez des pinces pour écraser le moyeu en plastique d'une aiguille de calibre 30 de 0,5 pouce. Utilisation de supports d'aiguille, saisir l'aiguille et retirer le moyeu. Gratter la colle restante de l'aiguille à l'aide d'une pince hémostatique. Insérer l'extrémité émoussée de l'aiguille dans une longueur de tubulure microbore. Utilisez moins de 20 pouces de longueur pour le tube.
- Utilisez une pompe à seringue pour permettre des volumes précis à livrer.
- Assurer une ventilation adéquate pour la collecte de données PV de haute qualité. Il existe une variété de ventilateurs de souris disponibles à l'achat. ventilateurs de pression contrôlée fournissent l'environnement fermé nécessaire pour inhalant unegaz nesthetic et fournissent un meilleur contrôle de la ventilation pendant la procédure.
- Veiller à ce que les pressions inspiratoires sont limitées à <15 cm H 2 O pour empêcher barotraumatisme. Fixer le ventilateur pour délivrer l'impulsion inspiratoire pendant 35% du cycle respiratoire. L'utilisation de la pression expiratoire positive (PEEP) à un niveau de 4 - 5 cm H 2 O va grandement améliorer la ventilation de la souris, en empêchant l' atélectasie du poumon et de soutenir les échanges gazeux.
- Limitez l'espace mort distale à la Y-conjointe dans le circuit ventilatoire. Ceci est important car le volume courant de la souris est très faible et tout espace mort soustrait de la livraison de l'air inspiré frais.
- Créer un endotrachéale de taille (ET) tube de souris en coupant la pointe hors d'un calibre 20 inhabitation intravasculaire. Cela fournit un point conique pour une insertion plus facile. Placez l'extrémité coupée dans le Y-joint du circuit anesthésique.
- Utiliser un tube flexible dans les voies respiratoirescircuit. Toute mémoire de structure dans le tube crée des forces externes qui ont le potentiel pour tirer le tube endotracheal sur les voies respiratoires de la souris.
- Laissez la souris déterminer la fréquence respiratoire en utilisant le taux le plus bas qui supprime l'entraînement respiratoire endogène. Commencez à une fréquence respiratoire relativement lente d'environ 60 respirations par minute.
Remarque: Avec une ventilation appropriée de la souris devrait faire très peu d' efforts pour respirer. Toutefois, si la ventilation est inadéquate, l'accumulation de CO 2 dans le sang va initier l' effort respiratoire par la souris. Si cela est observé, l'augmentation de la fréquence respiratoire est un moyen simple pour augmenter la ventilation alvéolaire. Il est souvent nécessaire d'augmenter la fréquence respiratoire en réponse à des élévations de la charge de travail cardiaque associée à la stimulation des récepteurs bêta-adrénergiques. - Une fois que le circuit respiratoire est préparé, la pression tester le système en branchant la pointe de l'intubation (ET) Tubeavec un doigt. Veiller à une pression des voies aériennes de ≈10 cmH 2 O. Ce test doit être effectué avant chaque procédure.
2. Approche Surgical
- Utilisez de petites pinces et ciseaux et d' autres équipements dans le tableau 1. Tous les instruments sont assez petites pour permettre une utilisation facile dans le domaine chirurgical agrandi. Utilisez un stéréomicroscope chirurgicale pour fournir un grossissement suffisant pour plusieurs aspects de la procédure chirurgicale.
- Utiliser un cautère pour maximiser l'hémostase pendant la procédure.
Remarque: Il y a deux ou trois grandes catégories de cautérisation. Thermocautère chauffe un élément métallique mince qui coupe à travers le tissu musculaire et arrêter le saignement. Ces systèmes sont d'abord relativement peu coûteux; cependant, il est important de noter que les pointes de fil sont à la fois fragiles et relativement coûteux. systèmes d'électrocoagulation sont plus coûteux à l'achat au départ, mais les conseils sont très robustes et ne devront pas être remplacerré. - Induction et Préparation chirurgicale
- Obtenir le poids corporel de la souris.
- Placer la souris dans une chambre d'induction qui est rempli avec 5% d'isoflurane.
Remarque: La souris ne peut pas survivre plus de quelques minutes dans cet environnement. Seulement 45 - 60 sec sont nécessaires pour la souris à perdre ses réflexe de redressement (efforts pour retourner sur lorsqu'elle est placée sur le dos ou sur le côté). - Une fois que le réflexe de redressement est perdu, réduire la concentration d'isoflurane à 2% et ouvrir le gaz anesthésique au masque.
- transférer rapidement la souris vers la table d'opération et le placer en décubitus dorsal avec son nez dans le masque.
- Si vous utilisez électrocoagulation, utiliser une solution saline gaze imbibée pour coupler électriquement la souris pour le tampon de mise à la terre du système de électrocoagulation.
- Fixer les membres avec du ruban adhésif chirurgical. Cette bande fournit des propriétés adhésives, même lorsqu'il est mouillé.
- Insérez une thermosonde rectale pour le corps central de surveillancetempérature. Fixer avec du ruban adhésif.
- Appliquer un dépilatoire au cou et à la poitrine de la souris. Attendre 2 - 3 min pour le épilatoire à travailler, puis retirer la fourrure de ces zones à l'aide d'un coton-tige et / ou des lingettes de laboratoire.
Note: drapage du champ opératoire est pas nécessaire, car cela est une procédure non-survie, mais peut être souhaitable de limiter l'exposition du chirurgien au plot de mise à la terre de cautérisation, si elle est utilisée. - Une fois que la souris est préparée pour la chirurgie, évaluer le plan chirurgical de la souris en effectuant un orteil-pincement. Une fois assuré d'une profondeur d'anesthésie appropriée de la souris est prête pour la première incision.
- Obtenir le contrôle des voies aériennes par intubation orale ou trachéotomie. La trachéotomie est une approche pratique qui est relativement simple à réaliser.
Note: Tout au long de cette description de la procédure toutes les directions et orientations seront par rapport au chirurgien.- Faire une incision au level de l'encoche sternale s'étendant de ≈ 5 mm à droite de la ligne médiane à ≈ 5 mm à gauche de la ligne médiane.
- Effectuer une deuxième incision prolongeant le long du bord droit de la première incision, l'extension rostrale à un niveau ≈ 2 mm caudale à l'extrémité de la mandibule.
- Effectuer une troisième incision partant de l'extrémité rostrale du deuxième incision vers ≈ 5 mm à gauche de la ligne médiane. Rentrez le lambeau de peau résultant de la gauche pour exposer les tissus sous-jacents.
- Séparer les glandes salivaires parotides et sous-maxillaires sur la ligne médiane par dissection. Cela permettra d'exposer les muscles sous-jacents recouvrant la trachée.
- Carrément séparer le droit et les muscles sternohyoideus gauche pour exposer la trachée.
- Passez un morceau de 3-0 suture de soie ≈10 cm sous la trachée, en prenant soin de ne pas inclure l'œsophage.
- Identifier l'emplacement du trachéotomie: juste caudale au larynx il y a un écart avant le premier anneau trachéal, ceci est une idéel emplacement pour effectuer la trachéotomie.
- Régler le collecteur pour fournir du gaz anesthésique au ventilateur et allumez le ventilateur.
- Vérifier les fuites en branchant l'extrémité du tube endotrachéal (ET) avec un doigt. Veiller à une pression des voies aériennes de ≈10 cmH2O.
- En utilisant une aiguille de calibre 20, en tant que bistouri, inciser la trachée. Faire l'incision relativement large, comme le tube ET remplira une grande partie de la lumière trachéale.
- Passons rapidement, retirer le masque et soigneusement insérer le tube ET dans la trachée. Ne forcez pas que les tissus sont très fragiles et briser le mur de la trachée peuvent entraîner un pneumothorax.
Remarque: Immédiatement après l' insertion, les excursions de la poitrine devraient se manifester. - Fixer le circuit ventilatoire avec du ruban adhésif pour empêcher le tube ET d'être sorti.
- Attachez un seul nœud dans la suture 3-0 pour former un joint autour du tube ET.
Remarque: À ce stade , la poitrine Excursions devrait être clairement. Dans le cas contraire, il est généralement le positionnement de la sonde endotrachéale dans la trachée qui est le problème. Tirez le tube ET arrière et essayer de le repositionner, en se concentrant sur l'orientation de la trachée comme un guide.
- Préparation de la veine jugulaire du site
- Rentrez les glandes salivaires laissés exposer rostrale latéralement la veine jugulaire externe.
- Bissecter le muscle mince (sternomastoideus) recouvrant la veine avec dissection. Cela permettra d'exposer la surface externe de la veine jugulaire.
- effacer avec précaution toutes les pièces majeures de tissu, bien que la prudence doit être utilisé comme les parois de la veine sont très minces. Une fois cette tâche terminée, couvrir la veine jugulaire avec les glandes salivaires de la préserver pour canulation plus tard.
- thoracotomie; entrant dans l'espace pleural sans endommager le cœur ou les poumons
- Retirer une grande partie de la peau qui recouvre la poitrine prolongeant le bord droit de laincision de la peau d'origine vers le bas au niveau du processus xiphoïde, puis à travers la ligne médiane à ≈ 1,5 cm à gauche de la ligne médiane.
Note: Il faut prendre soin lors de la coupe à travers les vaisseaux mammaires externes, qui peuvent être une source importante de saignement. Cautérisation ces navires avant de les couper en grande partie éviter ce saignement. - Utilisation de dissection, rétracter le lambeau de peau latéralement pour exposer la musculature sous-jacente.
- Isoler l'insertion du grand pectoral sur le côté droit près de la partie caudale du sternum en utilisant navire dilatant forceps. Cauterize et couper le muscle.
- Couper à travers le pectoral le long de son attachement au sternum. Cautériser les bords de coupe pour garantir l'hémostase.
- Suivant miner le grand dorsal sur le même côté, ce qui est une grande feuille de muscle recouvrant la face latérale de la souris. Cauterize et couper ce muscle, puis retirer l'extrémité coupée céphalique. Cela peut nécessiter un peu émousséedissection.
Note: Les côtes sont maintenant clairement et le coeur peuvent également être visibles dans certaines souches de souris. Dans la plupart des souris, entrer dans la poitrine dans la moitié caudale du quatrième espace intercostal fournira un bon accès au cœur. Le quatrième espace intercostal est le deuxième plus grand espace caudale. - Pour entrer dans la poitrine, utilisez une paire de pinces acérées pour disséquer soigneusement à travers les couches musculaires intercostales.
- Une fois l'espace pleural a été ouvert, insérez avec précaution les dilatateurs des vaisseaux épointées. En utilisant les dilatateurs des vaisseaux pour fournir la force douce vers le haut sur la paroi thoracique, utilisez les contondants ciseaux à ressort de fin d'inciser soigneusement le reste des muscles intercostaux.
- Première coupe latéralement, en faisant attention de ne pas couper le lobe du poumon en dessous. étendre ensuite l'incision médiane, mais rester 3 - 4 mm latéral de la ligne médiane pour éviter l'artère mammaire interne.
Nota: Les vaisseaux mammaires internes sont parallèles au sternumet peut entraîner une importante perte de sang si une coupure accidentelle. - cautériser avec précaution le bord coupé des muscles intercostaux, en utilisant un petit applicateur de coton pressenti pour rouler le tissu vers le haut pour permettre le contact de cautérisation avec le tissu de coupe sans entrer en contact avec les poumons ou le cœur.
- Placer une solution saline imbibé petit coton-tige à travers l'incision pointant vers la ligne médiane. Fournir une traction vers le haut en douceur pour tirer la paroi thoracique à l'écart des structures sous-jacentes. Commencer à cautériser la paroi thoracique au niveau du bord interne de l'incision et se terminant ≈ 1 cm de la ligne médiane latérale du côté gauche.
- Faire avancer l'applicateur vers la gauche afin qu'il soit en permanence sous la pointe de cautérisation.
- Une fois que le tissu est complètement cautérise, utiliser des ciseaux pour couper soigneusement à travers le sternum. La pointe du cœur doit être clairement visible à ce stade.
- Utilisation de dissection, perturber le péricarde et identifier la veine cave caudale.
- Vérifiez la preuve de saignement et cautériser maintenant. Une fois que tout le saignement a été résolu, retirez soigneusement toute drapage, le tampon cautérisation de mise à la terre, et la solution saline gaze imbibée.
- Retirer une grande partie de la peau qui recouvre la poitrine prolongeant le bord droit de laincision de la peau d'origine vers le bas au niveau du processus xiphoïde, puis à travers la ligne médiane à ≈ 1,5 cm à gauche de la ligne médiane.
- Mise en place du cathéter Veine jugulaire
- Connecter le cathéter fait à l'étape 1.6.2 à la seringue contenant 10% d'albumine en glissant avec précaution le tube sur une aiguille de calibre 30.
- Commencer à perfuser l'albumine à travers le cathéter.
- Orienter le cathéter de sorte que l'aiguille se trouve sur la veine jugulaire lui-même, avec l'aiguille biseau vers le haut. Si nécessaire, utilisez un porte-aiguille pour faire tourner l'aiguille dans le tube pour déplacer le biseau à la bonne orientation.
- Lorsque le cathéter est complètement rincé arrêter la perfusion.
- Saisir l'aiguille du cathéter avec une pince. Avec l'autre main, utilisez une pince de tissu pour rétracter la glande salivaire pour permettre la visualisation de la veine jugulaire. Appliquer une légère traction sur les tissus entourant la jugulaire distaleveine créant une tension sur la paroi du vaisseau. L'utilisation d'un angle faible de l'approche, insérer délicatement l'aiguille dans la veine. Faire avancer la pointe de l'aiguille 3 - 4 mm dans le récipient.
- Avant de libérer l'aiguille du cathéter à fixer le tube de cathéter avec un morceau de ruban adhésif, ce qui limite tout mouvement de l'aiguille une fois relâchée.
- Relâchez l'aiguille et tirez doucement sur le piston de la seringue pour confirmer que le cathéter est dans la lumière du vaisseau, en visualisant sang dans la ligne.
- Une fois positionné correctement fixer le cathéter avec de la colle chirurgicale pour fixer l'aiguille vers les glandes salivaires sous-jacentes.
- Calculer le volume total à perfuser. S'il n'y avait pas une perte de sang d'un volume de 5 ul / g de poids corporel sera suffisant. S'il y avait une perte de sang infusant 6 à 6,5 ul / g peut être nécessaire. Régler le débit de telle sorte que l'ensemble de perfusion sera terminée en 10 à 15 min.
- PV Catheter Placement dans laVentricule gauche
- Au cours de la procédure chirurgicale décrite ci-dessus, placer le cathéter PV dans une seringue contenant une solution saline pour lui permettre d'équilibrer.
- Juste avant la mise en place, déplacer la seringue et le cathéter à côté de la souris. Avec la pointe du cathéter à peu près la même hauteur que le cœur, zéro la lecture de la pression.
- En utilisant une solution saline imbibé petit coton-tige, manœuvrer le coeur pour permettre la visualisation de l'apex.
- En utilisant une aiguille de calibre 25, faire une incision au plus près du centre de l'apex que possible.
- À la suite de l'enlèvement de l'aiguille, à insérer rapidement le cathéter à travers l'incision. Il ne prend pas beaucoup de force pour insérer le cathéter, de sorte faire preuve de retenue lors de l'avance du cathéter dans le ventricule. Parfois, il est nécessaire d'effectuer une incision supplémentaire. Si cela est nécessaire, essayez d'effectuer l'incision ultérieure près de l'emplacement initial pour minimiser les dommages au coeur.
ne pase: Une fois que le cathéter est avancé dans le ventricule le placement final est d'une importance cruciale. Le tracé de la pression ventriculaire sera évidente par une faible pression diastolique (<10 mmHg) et une pression systolique élevée (> 80 mmHg à ce point). Idéalement, le cathéter sera centré dans le ventricule avec les électrodes externes seulement dans le ventricule. Beaux ajustements dans la position du cathéter peut être effectuée en observant les données PV en boucle, à la recherche d'un tracé en forme de boîte avec ≈ 90 ° angles entre les côtés.
3. Détails de procédure
Remarque: Une fois le cathéter en place une période de stabilisation brève (10-15 min) est nécessaire pour permettre à l'animal de se remettre de certains des stress chirurgical aiguë et pour laisser le temps pour la perfusion de fluides. Après cette période de stabilisation, le protocole proprement dit peut commencer.
- Une fois que le cathéter est placé PV et la manipulation chirurgicale a cessé,baissez le isoflurane à ≈ 1% que la nécessité d'un plan chirurgical de l'anesthésie profonde est diminuée.
- Pendant cette période, surveiller attentivement la souris afin d'assurer un niveau approprié de l'anesthésie est maintenue. Évaluer soigneusement tout mouvement; le mouvement des muscles respiratoires suggère un niveau d'hypoventilation et peut être résolu en augmentant la fréquence respiratoire du ventilateur. Mouvement des membres ou des spasmes des moustaches sont des signes que la souris devient trop léger et nécessite plus d'anesthésie.
Remarque: Il existe une grande variété de permutations de traitements qui peuvent être utilisés en combinaison avec ce protocole. Un grand nombre de ces traitements nécessitent une perfusion de médicaments. Il est essentiel de gérer efficacement le volume mort de l'espace. les commutateurs de la solution peut être accomplie en faisant glisser le tube de cathéter de l'aiguille d'une pompe à seringue à l'autre. Ce faisant, peu avant la fin de la perfusion antérieure permet au tube de cathéter devant être chargéavec le prochain médicament. Il est nécessaire de connaître le volume intérieur du tube de cathéter afin de déterminer le moment où l'interrupteur de la solution. L'introduction d'une petite bulle d'air dans la ligne permet la synchronisation précise de l'interrupteur de perfusion à déterminer; cette bulle infusé dans la circulation veineuse est bien tolérée.
- Pendant cette période, surveiller attentivement la souris afin d'assurer un niveau approprié de l'anesthésie est maintenue. Évaluer soigneusement tout mouvement; le mouvement des muscles respiratoires suggère un niveau d'hypoventilation et peut être résolu en augmentant la fréquence respiratoire du ventilateur. Mouvement des membres ou des spasmes des moustaches sont des signes que la souris devient trop léger et nécessite plus d'anesthésie.
- Modifiez les conditions de chargement du cœur en abaissant précharge et en augmentant la postcharge.
- Réduire la précharge en bloquant le retour veineux vers le coeur. Dans cette préparation, visualiser et occlure la veine cave caudale lorsqu'elle passe du diaphragme vers le cœur. Effectuez cette occlusion en douceur et relativement rapidement, d'une durée ne dépassant pas 2 - 3 sec. Augmenter gauche postcharge ventriculaire transitoirement en effectuant une compression abdominale douce durée 1 - 2 sec.
- Au cours de ces changements dans la charge du coeur, mettre en pause la respiration afin d'éliminer tout artefact introduit par le ventilateur.
- Calibrer le signal de volume à l'aide ee conductance cathéters. Ces procédures ne sont pas nécessaires avec des cathéters en utilisant la technologie d'admission.
- Une fois le protocole expérimental injecter 5 - 10 pi d'une solution saline hypertonique (20% de NaCl) pour calculer la conductance parallèle.
- Collecter le sang en retirant le cathéter et le prélèvement de sang du ventricule gauche dans une seringue héparinée. Placez ce sang dans des cuvettes de volume connu et utiliser le cathéter pour mesurer la conductance.
- Utiliser les mesures de conductance cuvette pour convertir le signal de conductance de volume et de la conductance parallèle est nécessaire de définir le volume absolu mesuré par le cathéter.
- Une fois le protocole terminé, euthanize la souris en enlevant le coeur suivant la transection de la veine cave et des pièces jointes aortiques.
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Representative Results
Par convention, le volume est tracée sur l'axe X et la pression sur l'axe des Y comme dans la figure 1. Les boucles pression-volume résultant d' une pression de traçage en fonction du volume doit ressembler à un rectangle dont les arêtes verticales représentant la variation isovolumiques de la pression ( à savoir, lorsque les deux valves mitrale et aortique sont fermés). L 'horizontale inférieure représente le remplissage du ventricule à travers la valve mitrale et la partie supérieure horizontale représente la vidange du ventricule à travers la valve aortique. Dans une saine type sauvage souris gauche pressions ventriculaires de 90 - 110 mmHg sont attendus avec maximale dP / dt de 8.000 - 12.000 mmHg / sec (voir le tableau 1 pour les gammes de paramètres hémodynamiques normaux). Les plages normales fournies dans le tableau sont basés sur des valeurs obtenues à partir de type sauvage C57BL / 10 et C57BL / 6 souris; cependant, il est important de noter qu'il existe des différences significatives entre les souches 21. La procédure outlined ici se concentre sur l'utilisation d'un couteau incision apicale pour positionner le cathéter dans le ventricule gauche. Une autre approche populaire consiste à insérer le cathéter rétrograde à travers la valve aortique après l'insertion du cathéter dans l'artère carotide droite. L'approche rétrograde comme avantage en ce sens qu'elle peut être réalisée avec un coffre fermé, ce qui entraîne le maintien de la pression intra-thoracique normale; Cependant, les animaux sont souvent ventilés au cours de cette procédure qui limite cet avantage. Les limites de l'approche de la poitrine fermées contrôle sur l'orientation du cathéter dans le ventricule, tandis que l'approche de la poitrine ouverte offre une plus grande capacité à manoeuvrer le cathéter dans le ventricule. Un problème potentiel avec l'insertion rétrograde du cathéter est la possibilité d'obstruction de la voie d'écoulement. Le diamètre de l'aorte de souris varie entre 0,8 et 1,2 mm , 22,23, le diamètre des cathéters disponibles dans le commerce pression-volume est compris entre 0,33 (1,0 français) à 0,47 mm (1,4 French). Les tailles relatives de ces cathéters dans le contexte d'une grande et une petite aorte sont représentées sur la figure 2. La fraction de la voie d'éjection bloqué par le cathéter traversant l'aorte peut devenir un problème important dans les petits coeurs et doivent être pris en compte lors de l' exécution études de boucle PV en petits coeurs. Il y a plusieurs artefacts de mesure qui peut compliquer l'analyse des données PV, l'un des plus commun est un cathéter piégeage. Ceci est évident en tant que pic de pression à la fin de la systole probable résultant de la compression directe du transducteur de pression par un muscle papillaire ou une autre structure dynamique dans le ventricule (Figure 3). Cette situation est problématique, car la plupart des méthodes de détermination de la fonction systolique utilisent la pression maximale. La pression systolique et dérivée maximum de pression (dP / dt) à partir d'ensembles de données avec cathéter piégeage doivent être examinés de près et l'analyse peut être nécessaire de modifier pour obtenir des données significatives.
boucles pression-volume peuvent être utilisés dans une grande variété de protocoles pour évaluer la fonction cardiaque. Ceux - ci comprennent des évaluations de la réserve cardiaque via β-adrénergiques stimulation 12,14,16,17. Une grande variété de médicaments peut être perfusé pour évaluer les effets aigus sur la physiologie cardiaque. Le contrôle des voies aériennes permet également l'administration de mélanges gazeux modifiés permettant aux effets de l' hypoxie et / ou une acidose sur la fonction cardiaque devant être adressée directement 24-27. En outre, l' analyse de ces données PV peut également fournir une évaluation détaillée des propriétés passives du ventricule gauche, qui peuvent être modifiés de manière significative dans divers états pathologiques 12.
| Paramètre | Plage normale |
| Pression systolique | 90-110 mmHg |
| Pression diastolique | 4 - 10 mm de Hg |
| dP maximum / dt | 8000 - 12 000 mm Hg / s |
| Minimum dP / dt | -8,500 - -12.000 MmHg / sec |
| Tau | 5-6 sec |
| Rythme cardiaque | 550-600 bpm |
| Débit cardiaque | 10 - 13 ml / min |
| La fraction d'éjection | 40 - 60% |
Tableau 1. Valeurs normales pour hémodynamique sélectionné Paramètres.
Figure 1: Representative Loops pression-volume d'un type sauvage C57BL / 10 Souris données représentant qui ont été recueillies en utilisant les procédures décrites dans thi.manuscrit s. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Représentation schématique de l'importance du diamètre aortique et potentiel Outflow piste Obstruction dessin schématique de la taille relative de l'aorte de la souris et les cathéters de pression de volume disponibles dans le commerce pour les souris.. Ces données soulignent l'importance de considérer l' obstruction de la voie de sortie lors de l' évaluation des souris plus petites en utilisant une approche d'insertion du cathéter rétrograde. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Il y a trois étapes critiques dans cette procédure: 1) la mise en place du tube d'intubation et une ventilation appropriée, 2) mise en place du cathéter IV jugulaire, et 3) la mise en place correcte du cathéter de PV dans le ventricule gauche. Détermination de la fréquence respiratoire appropriée est une partie importante de fournir une assistance ventilatoire. souris conscientes maintiennent généralement la ventilation alvéolaire avec peu profondes respirations rapides. En général, les souris ventilées auront beaucoup de plus grands volumes de marée. Ainsi, une fréquence respiratoire plus lent est nécessaire. Ceci est important car trop peu de ventilation entraîne une acidose respiratoire et une ventilation trop conduira à une alcalose respiratoire, les deux conditions qui modifient la fonction cardiaque. Une façon simple d'optimiser la fréquence respiratoire est de prendre des repères de l'effort respiratoire de la souris et utiliser la fréquence respiratoire plus bas qui élimine l'effort respiratoire de la souris anesthésiée.
Une caractéristique essentielle de la boucle PVl'analyse consiste à maintenir un niveau suffisant d'anesthésie, sans diminution significative de la fonction cardiaque. Il y a beaucoup de régimes anesthésiques qui peuvent être appliquées avec succès pour effectuer une analyse de la boucle PV. Ceux-ci peuvent être divisés en deux grandes catégories: les anesthésiques inhalés et injectables. Dans ce dernier groupe sont une variété de mélanges qui peuvent être utilisés, cependant, beaucoup de ces mélanges ont des effets cardio-dépressifs potentiels 19. Des cocktails injectables, uréthane à base d' anesthésiques ont le moins d' effets cardio-dépressifs 4,19. Prenez soin de limiter l' exposition du personnel à l' uréthane comme il est un cancérogène suspecté 28. Isoflurane et le sévoflurane sont les agents anesthésiques inhalés actuellement disponibles. Ces deux agents ont des effets cardio-dépressifs à des doses suffisantes pour la manipulation chirurgicale. Fait important, les agents anesthésiques inhalés peuvent être titrés à effet. Cela permet à une dose analgésique plus élevée au cours de la préparation chirurgicale, puis une sedat inférieuredose ive pour la mesure de la fonction cardiaque, minimisant ainsi les effets cardio-dépressif de ces composés.
Si les paramètres hémodynamiques sont inférieurs aux niveaux normaux, il existe plusieurs causes communes. Le premier est faible volume sanguin, secondaire à la perte de sang ou de l'évaporation. Cette complication est généralement traitée avec l'administration de fluide décrit dans la section 2.7. Comme il est indiqué dans la section 1.5, maintien de la température centrale du corps est également très important pour l'évaluation de la fonction hémodynamique. Ainsi une surveillance attentive est essentielle, un système de rétroaction numérique peut être utile pour maintenir la température du corps pendant l'enregistrement. Veiller à ce que l'anesthésique a été correctement réduite pendant la phase de mesure est également un aspect important de l'amélioration de la performance cardiaque.
Mesurer les paramètres indépendants de la charge de la contractilité est l'un des principaux avantages de l'analyse en boucle PV. La collecte en temps réel simultanée de la pression et de volume données fournit la capacité unique de mesurer les changements hémodynamiques en réponse aux conditions de chargement variant sur le cœur. Cette analyse permet la fonction contractile du cœur à être isolé des actions des navires. La réduction de la précharge par occlusion du retour veineux ont été utilisés pour évaluer les mesures de contractilité indépendants de la charge dans de nombreux modèles et homme 4,7,12-16,18,29-32 animaux. Dans les petits rongeurs, cette procédure conduit à une fin systolique relation pression-volume curviligne 4,31,33. Ce résultats probables de la réduction de la perfusion coronaire qui accélère considérablement le déclin de la fonction systolique 34. Chez la souris, 2 - 3 sec de douces résultats de compression abdominale dans un déplacement vers la droite du PV boucles. Il en résulte à la fois une augmentation de la précharge et la postcharge 12. L' augmentation des résultats de la postcharge prolongée par une augmentation de la fonction contractile, un phénomène appelé l'effet Anrep 35. Cependant, lecourte durée de la compression abdominale utilisée dans ces études indiquent que l'effet Anrep n'a aucune incidence sur la fonction cardiaque avec cette procédure. Dans d' autres études, la constriction aortique aiguë chez les chiens a été démontré pour augmenter la fonction contractile, mais cela a été émis l' hypothèse d'entraîner des effets de la perfusion systémique réduite 36. Là encore, la durée et la gravité de la perturbation de l'écoulement résultant de la compression de l'aorte abdominale, comme décrit ici, ne suffit pas d'augmenter significativement la fonction contractile secondaire à une hypoperfusion des tissus systémiques. Analyse des boucles PV obtenues par compression abdominale aligner bien avec des boucles PV obtenues peu après vena cava caudale occlusion. Ensemble, ces observations démontrent que la compression abdominale transitoire décrite ici ne modifie pas significativement la contractilité du coeur. En outre, cette procédure prévoit une méthode importante pour évaluer les propriétés passives du cœur sur une ran plus largege des volumes de fin de diastole.
L'analyse des mesures indépendantes de la charge nécessite la sélection des PV spécifiques des boucles pour être inclus dans l'analyse. Il est très important que cela soit fait de façon uniforme dans un ensemble de données expérimentales. Ventilation sous pression positive crée un artefact hémodynamique par des altérations respiratoires dépendantes de la précontrainte dans le ventricule gauche 37. Pour éviter cet artefact, boucles PV doivent être recueillies pendant de courtes périodes d'apnée (3 - 4 sec). Pauses dans la respiration sont particulièrement utiles car ils fournissent un meilleur contrôle des changements expérimentaux dans le chargement sur le cœur. Il est important de garder ces périodes d'apnée courtes pour éviter hypoventilation. Les procédures décrites dans ce manuscrit recueillent des données indépendants de la charge de deux procédures distinctes, caudale occlusion de la veine cave et de la compression abdominale, recueillies à peu près au même moment. Les boucles isolées à partir de ces deux procédures doivent être combinées et analysées ensemer que les deux mesurent la fonction du même cœur sous, à peu près, les mêmes conditions. Il y a plusieurs principes à prendre en compte lors de la sélection des boucles pour l'analyse. Évitez les battements arythmiques. Le temps suivant un rythme chuté est toujours anormalement élevé et battements prématurés sont anormalement petite; les deux vont perturber l'analyse des données. Évitez beats où la pression est en baisse, mais le volume est constant. Ceux-ci sont fréquentes chez la souris suite à l'occlusion de la veine cave caudale et sont probablement secondaire à une mauvaise perfusion du myocarde. Enfin, inclure uniquement les données de beats directement après le changement de chargement; les battements pendant la période de récupération sont probablement affectés par des altérations de l'activité nerveuse sympathique secondaire aux changements de la pression artérielle systémique résultant de la manipulation des conditions de chargement du cœur.
l'analyse de la boucle PV fournit une évaluation très détaillée de la fonction cardiaque. Lorsqu'il est appliqué en conjonction avec le flex génétiquebilité et de faibles coûts de logement de la souris, il peut fournir un moyen pratique d'évaluer la physiologie cardiaque au niveau moléculaire. Il existe plusieurs limites importantes qui doivent être pris en considération au moment de décider d'effectuer ces essais. Tout d'abord, il existe une procédure invasive dans laquelle les souris sont anesthésiées, ce qui peut affecter les aspects importants de la fonction cardiaque. En outre, l'interprétation des données de boucle PV nécessite une compréhension détaillée de la physiologie cardiaque à la fois pour identifier les tendances dans les données et les variables de confusion potentiels. En outre, parce que ces dosages sont terminales ils ne peuvent pas être utilisés pour évaluer de façon répétée la même souris. Les volumes ventriculaires provenant de cathéters PV ont tendance à être moins précis que les volumes ventriculaires anatomiques fournies par l'IRM. Ce n'est pas surprenant que des cathéters PV modélisent le ventricule comme un cylindre, ce qui est clairement une estimation du volume global du ventricule. La vraie force est la capacité de recueillir ces informations de volume à haute frequence, permettant ainsi l'analyse de battement à battement des variations du volume ventriculaire.
La collecte et l'analyse des données de PV de la souris peut être difficile, mais la méthode fournit des informations sur la fonction cardiaque qui ne sont pas disponibles par le biais de toute autre méthode. Cette procédure offre l'image la plus complète de la fonction cardiaque disponible et son utilisation dans le modèle murin fournira une plate-forme importante pour la détermination des fondements moléculaires des états pathologiques cardiaques complexes, tels que l'insuffisance cardiaque et cardiomyopathies héritées. Ce manuscrit fournit des informations détaillées sur les aspects les plus critiques de cette procédure. Cependant, comme toutes les procédures compliquées, cela nécessite la pratique de renforcer les compétences de microchirurgie qui sont nécessaires pour réaliser avec succès ces expériences.
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Acknowledgments
L'auteur aimerait remercier le financement du NHLBI (K08 HL102066 et R01 HL114832).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont 5/45 (2) | Fine Science Tools | 11251-33 | |
| Vessel Dilating Forceps | Fine Science Tools | 18153-11 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissor | Roboz Instruments | RS-5668 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Curved | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Straight | Fine Science Tools | 11040-08 | |
| Dissector Scissors- Heavy Blade | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| 3-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| TOPO Ventilator | Kent Scientific | TOPO | |
| Martin ME 102 Electrosurgical Unit | Harvard Apparatus | PY2 72-2484 | |
| Syringe Pump | Lucca Technologies | GenieTouch | |
| Stereomicroscope with boom stand | Nikon | SMZ-800N | |
| Thermocouple Thermometer | Cole Parmer | EW-91100-40 | |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Data Acquision and Analysis | DSI | Ponemah ACQ-16 |
References
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