Summary
Dette håndskrift beskriver en detaljeret protokol for indsamling af pres-volume data fra musen.
Abstract
Forståelse af årsagerne og progression af hjertesygdom udgør en stor udfordring for den biomedicinske samfund. Den genetiske fleksibilitet af musen giver store muligheder for at udforske hjertefunktionen på det molekylære niveau. Musen lille størrelse gør præsentere nogle udfordringer i forhold til at udføre detaljerede hjerte-fænotypebestemmelse. Miniaturisering og andre fremskridt inden for teknologi har gjort mange metoder til mulige vurdering af hjertefunktionen i musen. Af disse samtidig samling af tryk og volumen data giver et detaljeret billede af hjertefunktionen, der ikke er tilgængelige via andre aktiviteter. Her en detaljeret procedure for indsamling af loop data tryk-volumen er beskrevet. Inkluderet er en diskussion af principperne bag målingerne og de potentielle fejlkilder. Bedøvelsesmiddel ledelse og kirurgiske metoder diskuteres i detaljer, da de er både afgørende for at opnå høj kvalitet hæmodynamisk målings. Principperne for hæmodynamisk protokol udvikling og relevante aspekter af dataanalyse er ligeledes omfattet.
Introduction
Hjerte-kar-sygdom fortsætter med at være en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed i hele verden 1. Sygdomme i hjerte præsentere særligt vanskelige udfordringer i udviklingen af nye behandlingsformer. Fremskridt i genetik giver mulighed for at identificere et væld af potentielle genetiske bidragydere til udviklingen af hjertesygdomme. Den integrerende karakter af det kardiovaskulære system kræver, at disse genetiske mål valideres i intakte dyremodeller. De genetiske fleksibilitet og lav boligudgifter af muse har bragt det til spidsen for vurdering af den fysiologiske rolle af et givet gen. Den lille størrelse af musen præsenterer nogle unikke udfordringer for vurdering af hjertefunktionen. Der er flere modaliteter, der kan give oplysninger om hjertefunktion, men kun den samtidige måling af ventrikulær tryk og volumen tillader tryk-volumen (PV) sløjfe analyse af ventrikulær funktion. PV loops alleow hjertefunktion skal analyseres uafhængigt af dets forbindelse til vaskulaturen; en vigtig faktor for funktionelle rolle af en bestemt genetisk element.
Vurderingen af tryk-volumen loops er blevet brugt både eksperimentelt og klinisk i mange år og omfattende litteratur eksisterer vedrørende analysen af disse datasæt 2,3. Tilpasningen af PV loop teknologi til musen har været en vigtig fremgang for forståelsen af murine hjerte-fysiologi 4-6. Kateter baseret PV loop teknologier par en tryktransducer og brugen af konduktans at estimere ventrikulær volumen. Den ventrikulære volumen bestemmes ved at undersøge ændringer i et elektrisk felt genereret af kateteret. Denne metode modeller ventriklen som en cylinder, er hvis højde er defineret af afstanden mellem elektroderne på kateteret og radius beregnes fra ledning af et elektrisk felt gennem blod iventriklen 7-9. Konduktanssignalet målt ved kateteret har to komponenter. Den første er den ledning gennem blodet; dette varierer med volumenet af ventriklen og udgør det primære signal anvendes til at bestemme ventrikulær volumen. Den anden komponent skyldes ledning gennem og langs væggen af ventriklen. Dette kaldes parallel konduktans og skal fjernes, for at bestemme den absolutte ventrikulære volumen. Der er to kommercielt tilgængelige systemer til indsamling af pres-volume data i forskningslaboratorium og den anvendte metode til at beregne og fjern parallelkonduktansen er den primære forskel mellem dem 6,10,11. Konduktans katetre kræver injektion af hypertonisk saltvand til beregning af parallelkonduktansen. Denne injektion transient ændrer ledningsevnen af blod i ventriklen, medens ledningsevnen af væggen forbliver konstant. Ud fra disse data er det muligt at bestemme denkomponent af konduktanssignalet, der stammer fra blodet og hvad der kommer fra den ventrikulære væg. Denne fremgangsmåde forudsætter, at parallelkonduktans ikke varierer i løbet af hjertecyklussen. Optagelse Metoden bygger på ændringer fase i det elektriske felt til at vurdere bidraget af den ventrikulære væg til den samlede mængde signal. Denne metode bygger på en række forudbestemte konstanter for konduktiviteten af blodet og myocardium at bestemme det endelige rumfang, men gør kontinuerlige målinger af parallelkonduktans under hjertecyklussen. Begge disse systemer giver gode estimater af venstre ventrikel volumen og forskellene mellem dem er ikke sandsynligt, at være fysiologisk signifikant. Den cylindriske model af ventriklen og andre forudsætninger gøre disse kateter tilgange ikke så nøjagtige som andre modaliteter, men disse data er tilvejebragt på et beat-by-beat grundlag, der er afgørende for vurderingen af belastning uafhængige målinger af hjertefunktion.
Fremgangsmåden er skitseret her, bruges i mit laboratorium og har leveret data for en lang række undersøgelser der undersøger de grundlæggende patofysiologiske mekanismer dystrofisk kardiomyopati 12-18. Den ovenfor skitserede procedure er en af to, der kan anvendes til opnåelse af PV loop data. Mens mange af de principper, der gælder for begge tilgang, vil denne protokol fokusere på en åben kiste apikal tilgang; en lukket kiste protokol er blevet beskrevet andetsteds 19,20. Mens proceduren vil blive beskrevet detaljeret, de vigtige overordnede principper er at blotlægge hjertet med minimal skade på enten hjertet eller lungerne. Hele protokollen er det vigtigt at huske, at dette er et ikke-overlevelse procedure, og at have en god eksponering af hjertet er kritisk vigtigt for den korrekte placering af katetret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Inden du udfører nogen af procedurerne i denne protokol, opnå godkendelse af den lokale institutionelle dyr pleje og brug udvalg.
1. Opsætning af Experimental Rig
Bemærk: Denne procedure udføres på bedøvede dyr og kvaliteten af dataene er proportional med kvaliteten af den anæstetiske støtte, der tilbydes til dyret. Denne første afsnit vil detaljer udstyr og procedurer er nødvendige for at give bedøvelse til musen, mens de udfører denne protokol.
- Vælg et bedøvelsesmiddel protokol. Inhalant bedøvelsesmidler har mange gavnlige egenskaber til udførelse PV-sløjfe analysen, selv om nogle injicerbare protokoller er blevet anvendt som godt. Se diskussionen for mere information om at vælge en bedøvelsesmiddel regime.
- Sikker komprimerede ilt tanke på det kirurgiske bord eller væg nær operationsstedet.
- Hvis du bruger inhalant bedøvelsesmidler, bruge en vaporizer at forsikrekorrekt dosering. Kalibrer vandfordampningsapparater årligt for at sikre, at de leverer den passende dosis af bedøvelsesmiddel gas. Tilslut vandfordampningsapparater til et flowmeter, der tillader styring af den hastighed, hvormed gas kommer ind anæstesikredsløbet. Sat til 0,5 - 1,0 l / min.
- Brug en manifold til at tillade strømning af anæstesigas til 1) induktion kammeret, 2) en maske, og 3) ventilatoren. Fjernende bedøvende gas er kritisk vigtigt og skal udføres af et aktivt system, som enten udluftninger i et stinkskab (eller anden lignende opbygning af infrastruktur) eller gennem en beholder beregnet til at fjerne anæstesigasser.
Bemærk: Check med de lokale erhvervsmæssig sundhed embedsmænd for at sikre overholdelse af alle lokale regler. - Oprethold kroppens kernetemperatur ved at bruge varmepuder og / eller opvarmning lamper. Løbende overvåge kropstemperaturen med en rektal termometer. Dette vil give mulighed for proaktive stigninger eller fald i opvarmning for at sikre en fysiologisk kropstemperatur (ͭ6; 37 ° C) under indsamlingen af hæmodynamiske data.
- Giv væske støtte til at modvirke blodtab og følelsesløse tab volumen.
- Der fremstilles en 10% opløsning af albumin i 0,9% NaCl ved at tage 1 ml 25% albumin og tilsætning 1,5 ml 0,9% NaCl i en sprøjte.
- Forbered en lav residual volumen intravaskulær kateter.
- Brug en tang til at knuse plast knudepunkt for en 0,5 tommer 30 gauge nål. Ved hjælp af nål indehavere, tage fat i nål og fjern navet. Skrabe de resterende klæbemiddel fra nålen ved anvendelse af en hæmostat. Sæt den stumpe ende af nålen i en længde på mikrobore slange. Brug mindre end 20 inches af længde for slangen.
- Anvend en sprøjtepumpe for at tillade præcise mængder, der skal leveres.
- Sikre en ordentlig ventilation til indsamling af PV data af høj kvalitet. Der er en række af muse ventilatorer kan købes. Trykstyret ventilatorer giver det lukkede miljø, som kræves for inhalant ennesthetic gasser og give bedre styring af ventilationen under proceduren.
- Sørg for, at inspiratoriske tryk er begrænset til <15 cm H2O for at forhindre barotraume. Indstil ventilatoren til at levere den inspiratoriske puls under 35% af det respiratoriske cyklus. Brugen af positive sluteksspiratoriske tryk (PEEP) på et niveau af 4 - 5 cm, H2O vil forbedre ventilationen af musen, ved at forhindre atelektase af lungen og støtte gasudveksling.
- Begrænse døde rum distalt for Y-samlingen i ventilatorisk kredsløb. Dette er kritisk, fordi musens respirationsvolumen er meget lille og enhver dødrum trækker fra levering af frisk indåndingsluften.
- Opret en mus størrelse endotracheal (ET) rør ved at skære spidsen ud af en 20 gauge indlagt intravaskulært kateter. Dette tilvejebringer en tilspidset punkt for lettere indføring. Den overskårne ende i Y-samlingen af anæstesikredsløbet.
- Brug fleksibel slange i luftvejenekredsløb. Alle strukturelle hukommelse i slangen vil skabe eksterne kræfter, der har potentiale til at trække det endotracheale rør ud af musen luftveje.
- Lad musen bestemme respirationsfrekvens ved at bruge den laveste sats, der undertrykker den endogene respiratoriske drev. Start med en forholdsvis langsom respirationsfrekvens på omkring 60 vejrtrækninger per minut.
Bemærk: Med passende ventilation musen bør gøre meget lidt for at trække vejret. Men ved utilstrækkelig udluftning, vil opbygningen af CO 2 i blodet initiere respiratoriske indsats fra musen. Hvis dette observeres, øge respirationsfrekvens er en ligefrem måde at øge alveolær ventilation. Det er ofte nødvendigt at øge respirationsfrekvens som reaktion på stigninger i hjertets arbejdsbyrde i forbindelse med beta-adrenerg receptor stimulation. - Når det respiratoriske kredsløb fremstilles, tryk teste systemet ved at sætte spidsen af det endotrakeale (ET) rørmed en finger. Sikre en luftvejstryk af ≈10 CMH 2 O. Denne test skal udføres før hver procedure.
2. Kirurgisk Approach
- Brug små pincet og saks og andet udstyr fra tabel 1. Alle instrumenter er ganske små til at give mulighed for nem brug i det forstørrede kirurgiske område. Brug en kirurgisk stereomikroskop at give tilstrækkelig forstørrelse for flere aspekter af den kirurgiske procedure.
- Brug en cautery at maksimere hæmostase under proceduren.
Bemærk: Der er et par brede klasser af cautery. Thermocautery opvarmer en tynd metal element, der vil skære igennem muskelvæv og stoppe blødninger. Disse systemer er i første omgang relativt billig; men det er vigtigt at bemærke, at tråden tip er både skrøbelige og relativt kostbar. Elektrokauterisation systemer er dyrere at købe i første omgang, men spidserne er meget robust og vil ikke være nødvendigt at erstatted. - Induktion og Kirurgisk Forberedelse
- Finde legemsvægt af musen.
- Placer musen i en induktion kammer, der er fyldt med 5% isofluran.
Bemærk: Musen kan ikke overleve mere end et par minutter i dette miljø. Kun 45-60 sek er nødvendige for musen til at miste sine oprettende refleks (bestræbelser på at flip over, når anbragt på ryggen eller siden). - Når stabilitetsrefleks er tabt, reducere isofluran koncentration til 2% og åbn bedøvende gas til masken.
- Hurtigt overføre musen til operationsbordet og placere den liggende på ryggen med sin næse i masken.
- Hvis du bruger elektrokauterisation, bruge saltvand gennemblødt gaze til elektrisk par musen til grundstødningen pad af elektrokauterisation system.
- Skaf lemmerne med kirurgisk tape. Denne tape giver adhæsive egenskaber selv i våd tilstand.
- Indsæt en rektal thermoprobe til overvågning kerne kroptemperatur. Fastgør med tape.
- Påfør en rigtige spørgsmål til halsen og brystet af musen. Vent 2 - 3 i min for rigtige spørgsmål for at arbejde, og derefter fjerne skind fra disse områder ved hjælp af en bomuld tippes applikator og / eller laboratorium klude.
Bemærk: Drapering af den kirurgiske felt er ikke påkrævet, da dette er et ikke-overlevelse procedure, men kan ønskes at begrænse kirurgens eksponering for cautery jordforbindelse pad, hvis de anvendes. - Når musen er prepped for kirurgi, vurdere den kirurgiske plan af musen ved at udføre en tå-pinch. Når sikret en passende anæstetisk dybde musen er klar til den første indsnit.
- Få kontrol over luftvejene ved oral intubering eller tracheotomi. Tracheotomi er en praktisk fremgangsmåde, som er relativt enkel at udføre.
Bemærk: I hele denne proceduremæssige beskrivelse alle retninger og orienteringer vil være i forhold til kirurgen.- Lave et snit i level af brystbenet hak strækker sig fra ≈ 5 mm højre for midterlinjen til ≈ 5 mm til venstre for midterlinien.
- Foretag en anden indsnit strækker sig langs den højre kant af det første indsnit, der strækker rostrally til et niveau ≈ 2 mm kaudalt for enden af underkæben.
- Foretag en tredje snit strækker sig fra rostralt ende af den anden incision over til ≈ 5 mm tilbage af midterlinjen. Tilbagetrække resulterende hudlap til venstre for at blotlægge det underliggende væv.
- Adskil parotideale og submandibulære spytkirtlerne på midterlinjen ved stump dissektion. Dette vil udsætte de underliggende muskulatur overliggende luftrøret.
- Ligeud adskille højre og venstre sternohyoideus muskler at blotlægge trachea.
- Pass en ≈10 cm stykke 3-0 silke sutur under luftrøret, idet man ikke omfatte spiserøret.
- Identificer placering til tracheotomi: lige kaudalt for strubehovedet der er et hul før den første luftrør ring, det er en idel placering at udføre trakeostomi.
- Juster manifolden at tilvejebringe bedøvende gas til ventilatoren og tænd for ventilatoren.
- Check for utætheder ved at sætte spidsen af endotracheal (ET) rør med en finger. Sikre en luftvejstryk af ≈10 cmH2O.
- Anvendelse af en 20 gauge nål som en skalpel, incise luftrøret. Gør snittet relativt bredt, idet ET tuben vil fylde meget af tracheale lumen.
- Flytning hurtigt, fjerne masken og omhyggeligt indsætte ET tuben ind i luftrøret. Tving ikke det som væv er meget skrøbelige og bryde gennem væggen af luftrøret kan resultere i en pneumothorax.
Bemærk: Umiddelbart efter indsættelse, bør bryst ekskursioner blive tydelige. - Fastgør ventilatorisk kredsløb med tape for at forhindre ET røret i at blive trukket ud.
- Bind en enkelt overhånd knude i 3-0 sutur for at danne en tætning omkring ET røret.
Bemærk: På dette tidspunkt brystet excursions burde være tydeligt. Hvis ikke det er normalt positioneringen af ET røret i luftrøret, der er problemet. Træk ET tuben tilbage og forsøge at flytte det med fokus på orientering af luftrøret som en vejledning.
- Forberedelse af halsvenen websted
- Træk den venstre spytkirtler rostralt-lateralt udsætter den eksterne halsvene.
- Gennemskære den tynde muskel (sternomastoideus), der dækker venen med stump dissektion. Dette vil udsætte den ydre overflade af halsvenen.
- Omhyggeligt rydde ud nogen større stykker af væv, selv om der skal udvises forsigtighed, da væggene i venen er meget tynde. Når denne opgave er fuldført, dække halsvenen med spytkirtlerne at bevare det for kanylering senere.
- torakotomi; indtaste det pleurale rum uden at beskadige hjertet eller lungerne
- Fjern meget af huden, der dækker brystet strækker den højre kant af denoprindelige hudincision ned til niveauet for den formet som et sværd proces, derfra over midterlinjen til ≈ 1,5 cm tilbage af midterlinjen.
Bemærk: Der skal udvises forsigtighed, når der skæres gennem de eksterne brystkirtler fartøjer, som kan være en væsentlig kilde til blødning. Ætsende disse fartøjer før opskæring dem vil i høj grad forhindre denne blødning. - Ved stump dissektion, trække hudlap lateralt for at eksponere underliggende muskulatur.
- Isoler indsættelsen af pectoralis major på højre side nær caudale aspekt af brystbenet ved hjælp fartøjets dilating pincet. Ætse og skære musklen.
- Skær gennem pectoralis major langs dens tilknytning til brystbenet. Ætse de afskårne kanter for at sikre hæmostase.
- Næste underminere latissimus dorsi på samme side, som er et stort ark af muskel dækker laterale side af musen. Ætse og skære denne muskel og derefter trække den afskårne ende kranialt. Dette kan kræve nogle stumpdissektion.
Bemærk: Ribberne er nu tydeligt og hjertet kan også være synlige i nogle musestammer. I de fleste mus, vil indtaste brystet i den kaudale halvdel af den fjerde interkostale mellemrum giver god adgang til hjertet. Den fjerde interkostale mellemrum er den anden mest caudale plads. - For at indtaste brystet, bruge et par skarpe pincet til forsigtigt dissekere ned gennem interkostale muskel lag.
- Når det pleurale rum er blevet åbnet, forsigtigt indsætte stumpe spids fartøj dilatatorer. Brug af fartøjet dilatatorer at give blid opadgående kraft på brystvæggen, bruge stumpe ende foråret saks til omhyggeligt incise resten af mellemsiddende muskler.
- Først skæres sideværts, og pas på ikke at skære lunge lap nedenunder. Næste forlænge snittet medialt, men ophold 3 - 4 mm lateralt af midterlinjen for at undgå den interne brystarterie.
Bemærk: De interne mammary fartøjer løber parallelt med brystbenetog kan resultere i betydelige tab blod, hvis skæres et uheld. - cauterize omhyggeligt den afskårne kant af den interkostale muskler ved hjælp af en lille bomuld applikator til at rulle vævet opad for at tillade cautery kontakt med skåret væv uden at komme i kontakt med lungerne eller hjertet.
- Placer en saltvand gennemblødt lille bomuld tippes applikator gennem snittet peger mod midterlinjen. Tilvejebringe en blid opadgående trækkraft til at trække brystvæggen væk fra de underliggende strukturer. Begynd ætsende brystvæggen ved den mediale kant af snittet og slutter ≈ 1 cm lateral af midterlinjen i venstre side.
- Advance applikatoren til venstre, således at det er kontinuerligt under kautering spids.
- Når vævet er grundigt ætses, bruge en saks til omhyggeligt skære gennem brystbenet. Toppunktet af hjertet bør være klart synlig på dette punkt.
- Ved stump dissektion, forstyrre hjertesækken og identificere den caudale vena cava.
- Check for tegn på blødning og ætse det nu. Når alle blødningen er blevet behandlet, forsigtigt fjerne draperinger, den cautery jordforbindelse pad, og saltvand gennemblødt gaze.
- Fjern meget af huden, der dækker brystet strækker den højre kant af denoprindelige hudincision ned til niveauet for den formet som et sværd proces, derfra over midterlinjen til ≈ 1,5 cm tilbage af midterlinjen.
- Placere halsvenen Kateter
- Tilslut kateteret foretaget i trin 1.6.2 til sprøjten indeholdende 10% albumin ved omhyggeligt glider slangen over en 30 gauge nål.
- Begynd infusion albuminet gennem kateteret.
- Orientere kateteret, således at nålen ligger på halsvenen alene, med nåleaffasningen op. Brug om nødvendigt en nåleholder at rotere nålen i slangen for at flytte facet til den korrekte retning.
- Når kateteret er helt skyllet stoppe infusionen.
- Tag fat kateteret nål med en pincet. Med den anden hånd, og i et væv pincet til at tilbagetrække spytkirtlen for at tillade visualisering af halsvenen. Forsigtigt trækkraft til væv omkring den distale jugularisvene skabe spænding på karvæggen. Ved hjælp af en flad indfaldsvinkel, indsæt forsigtigt kanylen i venen. Advance spidsen af nålen 3 - 4 mm ind i beholderen.
- Før frigivelsen kateteret nålen fastgøre kateterrøret med et stykke tape, vil dette begrænse enhver bevægelse af nålen når frigivet.
- Slip nålen og træk forsigtigt tilbage på sprøjtens stempel for at bekræfte, at kateteret er i lumen af fartøjet, ved at visualisere blod i linjen.
- Når placeret korrekt fastgøre kateteret med kirurgisk lim til at fastgøre nålen til de underliggende spytkirtler.
- Beregn det samlede volumen, som skal infuseres. Hvis der ikke var betydeligt blodtab et volumen på 5 gl / g legemsvægt vil være tilstrækkelig. Hvis der var betydeligt blodtab infusion 6-6,5 pl / g kan være påkrævet. Indstil strømningshastigheden, således at hele infusion vil være komplet i 10 - 15 min.
- PV kateter placering ivenstre ventrikel
- Under den kirurgiske procedure er beskrevet ovenfor, anbringes PV kateter i en sprøjte indeholdende en saltvandsopløsning, så den kan komme i ligevægt.
- Lige før anbringelsen, flytte sprøjten og kateteret ved siden af musen. Med kateterspidsen på nogenlunde samme højde som hjertet, nulstille trykmåling.
- Ved hjælp af en saltopløsning gennemvædet lille bomuld applikator, manøvrere hjertet for at tillade visualisering af spidsen.
- Anvendelse af en 25 gauge nål, Lav et snit så tæt på centrum af toppunktet som muligt.
- Efter fjernelse af nålen, hurtigt at indsætte kateteret gennem snittet. Det tager ikke meget kraft til at indsætte kateteret, så udvise tilbageholdenhed, når fremføre kateteret ind i ventrikel. Indimellem er det nødvendigt at foretage en yderligere stab snit. Hvis dette er nødvendigt, forsøger at udføre den efterfølgende indsnit nær den oprindelige placering for at minimere skade på hjertet.
Ikkee: Når kateteret fremføres i ventriklen den endelige placering er kritisk vigtigt. Den ventrikulære tryk opsporing vil være indlysende ved en lav diastoliske tryk (<10 mmHg) og et højt systolisk tryk (> 80 mmHg på dette tidspunkt). Ideelt vil kateteret blive centreret i ventriklen med de ydre elektroder lige inden ventriklen. Fine justeringer i kateterposition kan udføres ved at overholde PV-loop data, leder efter en kasseformet sporing med ≈ 90 ° vinkler mellem siderne.
3. Processuelle Detaljer
Bemærk: Når kateteret er på plads en kort stabilisering periode (10 - 15 min) er nødvendig for at gøre det muligt for dyret kan komme fra nogle af de akutte kirurgiske stress og for at give tid til infusion af væsker. Efter denne stabiliseringsperiode selve protokol kan begynde.
- Når PV kateteret placeres og kirurgisk manipulation er ophørt,skrue ned for isofluran til ≈ 1% som behovet for en dyb kirurgisk plan anæstesi mindskes.
- I denne periode, omhyggeligt overvåge musen for at sikre, at en passende grad af anæstesi opretholdes. vurdere enhver bevægelse forsigtigt; bevægelse af de respiratoriske muskler antyder et niveau af hypoventilation og kan behandles ved at øge respirationsfrekvens af ventilatoren. Bevægelse af lemmer eller trækninger i whiskers er tegn på, at musen bliver for let og kræver mere bedøvelse.
Bemærk: Der er en bred vifte af permutationer af behandlinger, der kan anvendes i kombination med denne protokol. Mange af disse behandlinger vil kræve infusion af lægemidler. Det er vigtigt at styre dead-space volumen effektivt. Solution afbrydere kan opnås ved at skubbe kateterrøret fra nålen af en sprøjtepumpe til den anden. At gøre dette kort før udløbet af den tidligere infusion tillader kateterrøret, der skal lastesmed den næste lægemiddel. Det er nødvendigt at kende mængden inden kateterrøret at bestemme tidspunktet for opløsningen switch. Indførelsen af en lille luftboble i den linje giver den præcise timing af infusionen kontakten skal bestemmes; denne boble infunderes i den venøse cirkulation er veltolereret.
- I denne periode, omhyggeligt overvåge musen for at sikre, at en passende grad af anæstesi opretholdes. vurdere enhver bevægelse forsigtigt; bevægelse af de respiratoriske muskler antyder et niveau af hypoventilation og kan behandles ved at øge respirationsfrekvens af ventilatoren. Bevægelse af lemmer eller trækninger i whiskers er tegn på, at musen bliver for let og kræver mere bedøvelse.
- Alter de belastningsforhold i hjertet ved at sænke preload og stigende afterload.
- Reducer forbelastning ved at blokere venøst tilbageløb til hjertet. I dette præparat, visualisere og okkludere caudale vena cava, når den passerer fra membranen til hjertet. Udfør denne okklusion glat og relativt hurtigt, varer højst 2 - 3 i sek. Øge venstre ventrikel afterload transient ved at udføre en blid abdominal kompression varig 1 - 2 ud sek.
- Under disse ændringer i belastning af hjertet, pause respirations at fjerne enhver artefakt indført ved ventilatoren.
- Kalibrer volumen signalet ved hjælp af the ledningsevne katetre. Disse procedurer er ikke nødvendige med katetre bruger adgang teknologi.
- Efter forsøgsprotokollen injicere 5 - 10 pi hypertonisk saltvand (20% NaCl) til at beregne parallelkonduktansen.
- Indsamle blod ved at fjerne kateteret og udtagning af blod fra den venstre ventrikel i et hepariniseret sprøjte. Placer dette blod ind kuvetter med kendt volumen og anvende kateteret til at måle ledningsevnen.
- Brug kuvette konduktans foranstaltninger til at konvertere ledningsevne signal til volumen og den parallelle ledningsevne er nødvendigt at definere den absolutte volumen målt ved kateteret.
- Når protokollen er færdig, aflive musen ved at fjerne hjertet efter overskæring af vena cava og aorta vedhæftede filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konventionelt er volumen plottet på X-aksen og tryk på Y-aksen som i figur 1. Tryk- volumen sløjfer følger plotte tryk mod volumen skal ligne et rektangel, lodrette kanter, der repræsenterer iso-volumetrisk ændringer i tryk (dvs., når både mitral og aorta ventiler er lukket). Den nederste vandrette repræsenterer ventrikulær fyldning gennem mitralklappen og den øverste vandrette del repræsenterer ventrikulær tømning gennem aortaklappen. I et sundt vildtype mus venstre ventrikel tryk på 90 - 110 mmHg forventes med maksimal dP / dt af 8000 - 12.000 mmHg / sek (se tabel 1 for områder af normale hæmodynamiske parametre). Normalområdet tilvejebragt i tabellen er baseret på værdier opnået fra vildtype C57BL / 10 og C57BL / 6-mus; det er imidlertid vigtigt at bemærke, at der er betydelige forskelle mellem stammerne 21. Proceduren outlined her fokuserer på anvendelsen af en apikal stab indsnit at positionere kateteret inden den venstre ventrikel. En anden populær metode er at indsætte kateteret retrograd gennem aortaklappen følgende kateter indføring i den højre halspulsåre. Retrograd tilgang som fordel, at den kan udføres med et lukket bryst, hvilket resulterer i opretholdelse af normale intra-thorax tryk; imidlertid dyrene ofte ventileret under denne procedure, der begrænser denne fordel. De lukkede brystet anflyvningsgrænserne kontrol over katetret orientering inden i ventriklen, medens åben bryst tilgang giver større evne til at manøvrere kateteret i ventriklen. Et potentielt problem med retrograd indføring af kateteret er potentialet for udstrømning spor obstruktion. Diameteren af muse aorta varierer fra 0,8 til 1,2 mm 22,23, diameteren af kommercielt tilgængelige tryk-volumen katetre varierer fra 0,33 (1,0 French) til 0,47 mm (1,4 FreNCH). De relative størrelser af disse katetre i forbindelse med en stor og lille aorta er afbildet i figur 2. Fraktionen af udstrømning tarmkanalen blokeret af kateteret krydser aorta kan blive et væsentligt problem i mindre hjerter og bør tages i betragtning ved udførelse af PV loop studier i små hjerter. Der er flere artefakter for måling, der kan komplicere analysen af PV data, en af de mest almindelige er kateter fastklemning. Dette er tydelig, idet en stigning i trykket ved udgangen af systolen sandsynligvis som følge af direkte kompression af tryktransduceren af en papillær muskel eller anden dynamisk struktur i ventriklen (figur 3). Dette er problematisk, fordi de fleste metoder til bestemmelse af systolisk funktion bruge det maksimale tryk. Det systoliske tryk og maksimal derivat af tryk (dP / dt) fra datasæt med kateter fastklemning skal undersøges nøje og skal muligvis ændres for at opnå meningsfuld data analysen.
Trykvolumen sløjfer kan anvendes i en lang række forskellige protokoller til at vurdere hjertefunktionen. Disse omfatter vurderinger af kardiel via β-adrenerg stimulation 12,14,16,17. En lang række lægemidler kan indgives til vurdering ingen akutte virkning på hjertets fysiologi. Kontrol af luftvejene giver også mulighed for administration af ændrede gasblandinger tillader virkningerne af hypoxi og / eller acidose på hjertets funktion, der skal rettes direkte 24-27. Endvidere kan analyse af disse PV data også give en detaljeret vurdering af de passive egenskaber af venstre hjertekammer, som kan ændres betydeligt i forskellige sygdomstilstande 12.
| Parameter | normal Range |
| systoliske tryk | 90 - 110 mmHg |
| diastolisk tryk | 4 - 10 mmHg |
| Maksimale dP / dt | 8.000 - 12.000 mmHg / sec |
| Minimum dP / dt | -8,500 - -12,000 MmHg / sek |
| Tau | 5 - 6 sek |
| Hjerterytme | 550-600 bpm |
| Cardiac output | 10 - 13 ml / min |
| Uddrivningsfraktion | I 40 - 60% |
Tabel 1. Normale Værdier for Selected Hæmodynamiske parametre.
Figur 1: Repræsentative Pressure volumen Loops fra en vildtype C57BL / 10 Mus repræsentant data, der blev indsamlet ved brug af fremgangsmåderne beskrevet i thi.s manuskript. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk repræsentation betydningen af aorta diameter og Potentiel Udstrømning Track Obstruktion Skematisk tegning af de relative størrelser af musen aorta og de kommercielt tilgængelige pres volumen katetre til mus.. Disse data understreger betydningen af at overveje udstrømning track obstruktion ved vurderingen mindre mus ved hjælp af et tilbageskridt kateter indsættelse tilgang. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er tre kritiske trin i denne procedure: 1) anbringelse af endotrachealrøret og passende ventilation, 2) placering af jugular IV-kateter, og 3) den korrekte placering af PV-kateter i den venstre ventrikel. Fastsættelse af passende åndedrætsværn sats er en vigtig del af at yde ventilatorisk støtte. Bevidste mus generelt opretholde alveolær ventilation med hurtige lavvandede vejrtrækninger. Generelt vil ventilerede mus har meget større tidalvolumener. Således kræves der en langsommere respirationsfrekvens. Dette er vigtigt som for lidt ventilation vil resultere i respiratorisk acidose og for meget ventilation vil føre til respiratorisk alkalose, begge betingelser, der vil ændre hjertefunktion. En simpel måde at optimere den respirationshastighed er at tage stikord fra musens respiratorisk anstrengelse og bruge den laveste respirationsfrekvens der eliminerer respiratorisk anstrengelse fra den bedøvede mus.
En kritisk træk ved PV loopanalyse er at opretholde et tilstrækkeligt niveau af anæstesi uden signifikant depression af hjertefunktionen. Der er mange anæstetiske regimer, der med held kan anvendes til at udføre PV sløjfe analyse. Disse kan inddeles i to brede kategorier: inhalant og injicerbare anæstetika. Inden for denne sidstnævnte gruppe er en række forskellige blandinger, der kan anvendes, men mange af disse blandinger har potentielle hjerte-depressive virkninger 19. Af de injicerbare cocktails, urethan baseret bedøvelsesmidler har de mindst cardio-depressive virkninger 4,19. Pas på at begrænse eksponeringen af personale til urethan, da det er et mistænkt carcinogen 28. Isofluran og sevofluran er de for tiden tilgængelige inhalant bedøvelsesmidler. Begge disse midler har cardio-depressive virkninger ved doser tilstrækkelige til kirurgisk manipulation. Vigtigt er det, kan inhalerede anæstetika titreres til effekt. Dette giver en højere analgetisk dosis under den kirurgiske forberedelse og derefter en lavere Sedative dosis for måling af hjertefunktion, hvilket minimerer cardio-depressive virkninger af disse forbindelser.
Hvis de hæmodynamiske parametre er under det normale niveau, der er flere almindelige årsager. Første er lavt blodvolumen, sekundært til blodtab eller fordampning. Denne komplikation er generelt behandlet med væske administration skitseret i afsnit 2.7. Som nævnt i afsnit 1.5, vedligeholdelse af kroppens kernetemperatur er også meget vigtigt for vurderingen af hæmodynamiske funktion. Således omhyggelig overvågning er afgørende, kan en digital feedback-system være nyttigt for at opretholde kropstemperaturen under optagelse. Sikre, at bedøvelsesmidlet er blevet korrekt reduceret under målingen fase er også et vigtigt element i forbedringen hjertefunktion.
Måling load-uafhængige parametre af kontraktilitet er en af de primære fordele ved PV sløjfe analyse. Den tidstro samtidig indsamling af tryk og volumenume data giver den unikke evne til at måle de hæmodynamiske ændringer i reaktion på varierende belastningsforhold på hjertet. Denne analyse gør det muligt kontraktile funktion af hjertet til isoleres fra handlinger skibene. Reduktioner i preload gennem okklusion af venøs tilbagevenden er blevet anvendt til at vurdere load-uafhængige målinger af kontraktilitet i mange dyremodeller og mennesker 4,7,12-16,18,29-32. I små gnavere, denne procedure resulterer i en krum ende-systoliske tryk-volumen-forhold 4,31,33. Denne sandsynlige resultater fra reduktionen i koronar perfusion, der dramatisk accelererer faldet i systolisk funktion 34. I mus 2 - 3 sek af blide abdominale komprimering resulterer i en højregående forskydning af PV loops. Dette skyldes både en stigning i afterload og preload 12. Langvarig stigninger i afterload resultat i en stigning i kontraktil funktion, et fænomen kaldet Anrep effekt 35. dogkort varighed af den abdominale kompression anvendes i disse undersøgelser viser, at Anrep effekten ikke påvirker hjertefunktionen med denne procedure. I andre undersøgelser blev akut aorta konstriktion hos hunde påvist at øge kontraktile funktion, men dette blev hypotese at skyldes virkningerne af reduceret systemisk perfusion 36. Igen varigheden og sværhedsgraden af afbrydelse af aorta strømning som følge af abdominal kompression, som beskrevet her, er ikke tilstrækkelig til at øge kontraktionsfunktion sekundært til hypo-perfusion af systemiske væv. Analyse af PV loops opnået ved abdominal kompression bringe godt med PV sløjfer opnået kort tid efter caudale vena cava okklusion. Samlet set viser disse observationer viser, at den transiente abdominal kompression beskrevet her ikke væsentligt ændrer kontraktilitet af hjertet. Desuden er denne fremgangsmåde giver en vigtig metode til at vurdere de passive egenskaber af hjertet over et bredere RANge af end-diastoliske mængder.
Analysen af load-uafhængige foranstaltninger kræver udvælgelsen af specifikke PV loops skal indgå i analysen. Det er kritisk vigtigt, at dette gøres konsekvent på tværs af en eksperimentel datasæt. Positivt tryk ventilation skaber en hæmodynamisk artefakt gennem respiratoriske afhængige ændringer af forbelastning til venstre ventrikel 37. For at undgå dette artefakt, bør PV loops indsamles i korte perioder af apnø (3 - 4 sek). Pauser i respiration er især nyttige, da de giver bedre kontrol med eksperimentelle ændringer i belastning på hjertet. Det er vigtigt at holde disse perioder med apnø korte at undgå hypoventilation. Beskrevet i dette manuskript procedurer indsamle load-uafhængige data fra to forskellige procedurer, caudale vena cava okklusion og abdominal kompression, indsamlet på nogenlunde samme tid. De sløjfer isoleret fra disse to procedurer bør kombineres og analyseres om døris da de begge måle funktionen af samme hjertet under, groft, de samme betingelser. Der er flere principper at overveje, når du vælger sløjfer til analyse. Undgå arytmiske beats. Takten efter en droppet beat er altid unormalt stort og præmature beats er unormalt små; begge vil forstyrre analysen af dataene. Undgå beats hvor trykket falder, men volumen er konstant. Disse er almindelige i musen efter okklusion af den kaudale vena cava og sandsynligvis sekundær til dårlig perfusion af myokardiet. Endelig omfatter kun data fra beats direkte efter ændringen i læsning; beats i løbet af tilbagebetalingsperioden er sandsynligvis påvirket af ændringer i sympatisk nerveaktivitet sekundært til ændringer i det systemiske blodtryk som følge af manipulation af belastningsforhold i hjertet.
PV loop analyse giver en meget detaljeret vurdering af hjertefunktionen. Anvendt sammen med den genetiske flexlitet og lave omkostninger med musen boliger det kan give et praktisk middel til at vurdere hjertefunktionen fysiologi på det molekylære niveau. Der er flere vigtige begrænsninger, som skal overvejes, når det besluttes at udføre disse analyser. Første er dette en invasiv procedure, hvor mus bedøves, hvilket kan påvirke vigtige aspekter af hjertefunktion. Endvidere fortolkning af PV loop data kræver en detaljeret forståelse af hjerte- fysiologi både at identificere mønstre i dataene og potentielle forstyrrende variable. Desuden, fordi disse assays er terminal kan de ikke anvendes til at vurdere den samme mus gentagne gange. De ventrikulære mængder stammer fra PV katetre tendens til at være mindre nøjagtige end de anatomiske ventrikulære mængder, som MRI. Dette er ikke overraskende, da PV katetre modellere ventriklen som en cylinder, der er helt klart et skøn over den samlede mængde af ventriklen. Den virkelige styrke er evnen til at indsamle denne mængde information på en høj frekvens, således at beat-to-beat analyse af udviklingen i ventrikel volumen.
Indsamling og analyse af PV data fra musen kan være udfordrende, men metoden giver oplysninger om hjertefunktionen, der ikke er tilgængelig via et andet metodologi. Denne procedure giver den mest komplette billede af hjertefunktionen til rådighed, og den anvendes det murine model vil give en vigtig platform til bestemmelse af de molekylære fundament for komplekse hjerte- sygdomstilstande såsom hjertesvigt og nedarvede cardiomyopathier. Dette håndskrift indeholder detaljerede oplysninger om de mest kritiske aspekter af denne procedure. Men ligesom alle komplicerede procedurer, det kræver, praksis at bygge de mikrokirurgiske færdigheder, som er nødvendige for at kunne udføre disse eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatteren vil gerne anerkende finansiering fra NHLBI (K08 HL102066 og R01 HL114832).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont 5/45 (2) | Fine Science Tools | 11251-33 | |
| Vessel Dilating Forceps | Fine Science Tools | 18153-11 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissor | Roboz Instruments | RS-5668 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Curved | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Straight | Fine Science Tools | 11040-08 | |
| Dissector Scissors- Heavy Blade | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| 3-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| TOPO Ventilator | Kent Scientific | TOPO | |
| Martin ME 102 Electrosurgical Unit | Harvard Apparatus | PY2 72-2484 | |
| Syringe Pump | Lucca Technologies | GenieTouch | |
| Stereomicroscope with boom stand | Nikon | SMZ-800N | |
| Thermocouple Thermometer | Cole Parmer | EW-91100-40 | |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Data Acquision and Analysis | DSI | Ponemah ACQ-16 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), e29-e322 (2015).
- Katz, A. M. Influence of altered inotropy and lusitropy on ventricular pressure-volume loops. J Am Coll Cardiol. 11 (2), 438-445 (1988).
- Kass, D. A., Maughan, W. L. From "Emax" to pressure-volume relations: a broader view. Circulation. 77 (6), 1203-1212 (1988).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 274 (4 Pt 2), H1416-H1422 (1998).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Feldman, M. D., et al. Validation of a mouse conductance system to determine LV volume: comparison to echocardiography and crystals. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279 (4), H1698-H1707 (2000).
- Baan, J., et al. Continuous measurement of left ventricular volume in animals and humans by conductance catheter. Circulation. 70 (5), 812-823 (1984).
- Salo, R. W., Wallner, T. G., Pederson, B. D. Measurement of ventricular volume by intracardiac impedance: theoretical and empirical approaches. IEEE Trans Biomed Eng. 33 (2), 189-195 (1986).
- Wei, C. L., et al. Volume catheter parallel conductance varies between end-systole and end-diastole. IEEE Trans Biomed Eng. 54 (8), 1480-1489 (2007).
- Kutty, S., et al. Validation of admittance computed left ventricular volumes against real-time three-dimensional echocardiography in the porcine heart. Exp Physiol. 98 (6), 1092-1101 (2013).
- Kottam, A., Dubois, J., McElligott, A., Henderson, K. K. Novel approach to admittance to volume conversion for ventricular volume measurement. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2514-2517 (2011).
- Meyers, T. A., Townsend, D. Early right ventricular fibrosis and reduction in biventricular cardiac reserve in the dystrophin-deficient mdx heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (4), H303-H315 (2015).
- Townsend, D., Yasuda, S., Li, S., Chamberlain, J. S., Metzger, J. M. Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther. 16 (5), 832-835 (2008).
- Townsend, D., et al. Systemic administration of micro-dystrophin restores cardiac geometry and prevents dobutamine-induced cardiac pump failure. Mol Ther. 15 (6), 1086-1092 (2007).
- Strakova, J., et al. Dystrobrevin increases dystrophin's binding to the dystrophin-glycoprotein complex and provides protection during cardiac stress. J Mol Cell Cardiol. 76, 106-115 (2014).
- Yasuda, S., et al. Dystrophic heart failure blocked by membrane sealant poloxamer. Nature. 436 (7053), 1025-1029 (2005).
- Townsend, D., Daly, M., Chamberlain, J. S., Metzger, J. M. Age-dependent dystrophin loss and genetic reconstitution establish a molecular link between dystrophin and heart performance during aging. Mol Ther. 19 (10), 1821-1825 (2011).
- Townsend, D., Yasuda, S., McNally, E., Metzger, J. M. Distinct pathophysiological mechanisms of cardiomyopathy in hearts lacking dystrophin or the sarcoglycan complex. FASEB J. 25 (9), 3106-3114 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect. J Vis Exp. (100), e52618-e52618 (2015).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiol Genomics. 42A (2), 103-113 (2010).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (5), H1829-H1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
- Palpant, N. J., Day, S. M., Herron, T. J., Converso, K. L., Metzger, J. M. Single histidine-substituted cardiac troponin I confers protection from age-related systolic and diastolic dysfunction. Cardiovasc Res. 80 (2), 209-218 (2008).
- Palpant, N. J., D'Alecy, L. G., Metzger, J. M. Single histidine button in cardiac troponin I sustains heart performance in response to severe hypercapnic respiratory acidosis in vivo. FASEB J. 23 (5), 1529-1540 (2009).
- Palpant, N. J., et al. Cardiac disease in mucopolysaccharidosis type I attributed to catecholaminergic and hemodynamic deficiencies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H356-H365 (2011).
- Townsend, D. Diastolic dysfunction precedes hypoxia-induced mortality in dystrophic mice. Physiol Rep. 3 (8), e12513 (2015).
- Schmähl, D., Port, R., Wahrendorf, J. A dose-response study on urethane carcinogenesis in rats and mice. Int J Cancer. 19 (1), 77-80 (1977).
- Freeman, G. L., Little, W. C., O'Rourke, R. A. The effect of vasoactive agents on the left ventricular end-systolic pressure-volume relation in closed-chest dogs. Circulation. 74 (5), 1107-1113 (1986).
- Reyes, M., et al. Enhancement of contractility with sustained afterload in the intact murine heart: blunting of length-dependent activation. Circulation. 107 (23), 2962-2968 (2003).
- Segers, P., et al. Conductance catheter-based assessment of arterial input impedance, arterial function, and ventricular-vascular interaction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (3), H1157-H1164 (2005).
- Townsend, D., et al. Chronic administration of membrane sealant prevents severe cardiac injury and ventricular dilatation in dystrophic dogs. J Clin Invest. 120 (4), 1140-1150 (2010).
- Sato, T., Shishido, T., et al. ESPVR of in situ rat left ventricle shows contractility-dependent curvilinearity. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 274 (5 Pt 2), H1429-H1434 (1998).
- Sunagawa, K., et al. Effects of coronary arterial pressure on left ventricular end-systolic pressure-volume relation of isolated canine heart. Circ Res. 50 (5), 727-734 (1982).
- Cingolani, H. E., Pérez, N. G., Cingolani, O. H., Ennis, I. L. The Anrep effect: 100 years later. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H175-H182 (2013).
- Baan, J., van der Velde, E. T. Sensitivity of left ventricular end-systolic pressure-volume relation to type of loading intervention in dogs. Circ Res. 62 (6), 1247-1258 (1988).
- Rankin, J. S., Olsen, C. O., et al. The effects of airway pressure on cardiac function in intact dogs. Circulation. 66 (1), 108-120 (1982).
