Summary
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for oppsamling av trykk-volum data fra musen.
Abstract
Forstå årsaker og progresjon av hjertesykdom presenterer en betydelig utfordring for biomedisinsk samfunnet. Den genetiske Fleksibiliteten i mus gir et stort potensiale for å utforske hjertefunksjonen på molekylært nivå. Musen er liten størrelse gjør presentere noen utfordringer i forhold til å utføre detaljert hjerte fenotyping. Miniatyrisering og andre fremskritt i teknologi har gjort mange metoder for hjertemålinger mulig i musen. Av disse samtidig samling av trykk og volum data gir et detaljert bilde av hjertefunksjon som ikke er tilgjengelig gjennom noen annen modalitet. Her en detaljert fremgangsmåte for innsamling av trykk-volum sløyfedata er beskrevet. Inkludert er en diskusjon av prinsippene målingene og de potensielle feilkilder. Bedøvelse ledelse og kirurgiske tilnærminger blir diskutert i stor detalj som de er begge kritiske til å oppnå høy kvalitet hemodynamisk målings. Prinsippene for hemodynamisk protokoll utvikling og relevante aspekter ved dataanalyse er også adressert.
Introduction
Hjerte- og karsykdommer fortsetter å være en viktig årsak til dødelighet og sykelighet i hele verden en. Sykdommer i hjertet presentere spesielt vanskelige utfordringer i å utvikle nye behandlingsformer. Fremskritt i genetikk for muligheten til å identifisere en rekke potensielle genetiske bidragsytere til utvikling av hjertesykdom. Den integrerende natur av det kardiovaskulære systemet krever at disse genetiske mål valideres i intakte dyremodeller. De genetiske fleksibilitet og lave bokostnader av musen har brakt den til teten for vurdering av den fysiologiske rollen til et gitt gen. Den lille størrelsen på mus viser noen spesielle utfordringer for vurdering av hjertefunksjonen. Det er flere modaliteter som kan gi informasjon om hjertefunksjon, men bare den samtidige måling av ventrikulære trykk og volum gjør det mulig for trykk-volum (PV) sløyfe analyse av ventrikulær funksjon. PV-buerow hjertefunksjonen som skal bli analysert uavhengig av dens forbindelse til blodkar; en viktig faktor for å bestemme den funksjonelle rolle av en spesiell genetisk element.
Vurderingen av trykk-volum sløyfer er blitt brukt både eksperimentelt og klinisk i mange år, og omfattende litteratur eksisterer når det gjelder analyse av disse datasett 2,3. Tilpasningen av PV sløyfe teknologi til musen har vært et viktig fremskritt for forståelsen av murine hjertefysiologi 4-6. Kateterbasert PV sløyfe teknologier par en trykktransduser og bruken av konduktansen til å estimere ventrikulær volum. Den ventrikulære volum bestemmes ved å undersøke forandringer i et elektrisk felt som genereres av kateteret. Denne metoden modeller ventrikkelen som en sylinder, er den høyde som er definert ved avstanden mellom elektrodene på kateteret og radius blir beregnet fra ledning av et elektrisk felt gjennom blod iventrikkelen 7-9. Ledningsevnesignalet målt av kateteret har to komponenter. Den første er conduction gjennom blod; dette varierer med volumet av ventrikkelen og utgjør primærsignalet brukes til å bestemme ventrikulær volum. Den andre komponenten er et resultat av ledning gjennom og langs veggen av ventrikkelen. Dette kalles parallelle konduktans og må fjernes for å bestemme den absolutte ventrikulært volum. Det er to kommersielt tilgjengelige systemer for innsamling av trykk-volum data i forskningslaboratorium og hvilken metode som brukes for å beregne og fjerne parallell konduktans er den primære forskjellen mellom dem 6,10,11. Konduktans katetre krever injeksjon av hypertonisk saltløsning for beregning av parallelle konduktans. Denne injeksjon forbigående endrer ledningsevnen i blodet i ventrikkelen, mens ledningsevnen i veggen forblir konstant. Fra disse data er det mulig å bestemmekomponent av ledningsevnesignalet som stammer fra blodet og det som kommer fra den ventrikulære veggen. Denne tilnærmingen forutsetter at parallell konduktans ikke varierer i løpet av hjertesyklusen. Adgang metoden er avhengig av faseendringer i det elektriske felt for å vurdere bidraget fra den ventrikulære veggen til det samlede volum signal. Denne fremgangsmåten er avhengig av en rekke forutbestemte konstanter for ledningsevnen i blodet og myokardium for å bestemme den endelige volum, men gjør kontinuerlige målinger av parallelle konduktans under hjertesyklusen. Begge disse systemene gir gode estimater av venstre ventrikkel volum og forskjellene mellom dem er ikke sannsynlig å være fysiologisk signifikant. Den sylindriske modell av ventrikkel og andre forutsetninger gjengi disse kateterbaserte tilnærminger ikke så nøyaktige som andre modaliteter, men disse dataene er gitt på en beat-for-beat basis som er avgjørende for vurderingen av last uavhengige målinger av hjertefunksjon.
Fremgangsmåten beskrevet her er brukt i laboratoriet min og har gitt data for et stort antall studier som undersøker de grunnleggende mekanismer for patofysiologiske dystrofiske kardiomyopati 12-18. Fremgangsmåten beskrevet nedenfor er en av to som kan bli anvendt for å oppnå PV sløyfedata. Mens mange av prinsippene gjelder for enten tilnærming, vil denne protokollen fokusere på en åpen kiste apikal tilnærming; en lukket kiste protokollen er beskrevet andre steder 19,20. Selv om fremgangsmåten vil bli beskrevet i detalj, de viktige overordnede prinsipper er å blottlegge hjertet med minimal skade på enten hjerte eller lunger. Gjennom hele-protokollen er det viktig å huske på at dette er et ikke-overlevelse prosedyre og at det å ha en god eksponering av hjertet er kritisk viktig for riktig plassering av kateteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før du utfører noen av prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen, få godkjenning av den lokale institusjonelle dyr omsorg og bruk komité.
1. Sette opp Experimental Rig
Merk: Denne prosedyren blir utført på bedøvede dyr og kvaliteten på dataene er proporsjonal med kvaliteten av narkosen støtte som tilbys til dyret. Denne første delen vil detalj utstyr og prosedyrer er nødvendig for å gi anestesi til musen mens du utfører denne protokollen.
- Velg en bedøvelse protokoll. Inhalant bedøvelsesmidler har mange fordelaktige egenskaper for utførelse av PV-sløyfe analyse, selv om noen injiserbare protokoller er blitt benyttet i tillegg. Se diskusjonen for mer informasjon om hvordan du velger en bedøvelse regime.
- Sikre komprimert oksygen tanker til det kirurgiske bord eller vegg nær operasjonsstedet.
- Hvis du bruker inhalant bedøvelse, bruker en vaporizer å forsikreriktig dosering. Kalibrere vaporizers årlig for å sikre at de leverer riktig dose av anestesigass. Koble fordampere til en strømningsmåler som tillater kontroll av den hastighet med hvilken gassen kommer inn i anestesikretsen. Satt til 0,5 til 1,0 l / min.
- Bruker en manifold for å tillate rettet strøm av anestesigass til en) induksjonskammeret 2) en maske, og 3) respiratoren. Scavenging bedøvende gass er kritisk viktig og bør utføres av et aktivt system som enten vents i et avtrekksskap (eller andre lignende bygningen infrastruktur) eller gjennom en beholder laget for å fjerne anestesigasser.
Merk: Sjekk med lokale yrkeshelsemyndigheter for å sikre samsvar med alle lokale forskrifter. - Oppretthold kjernen kroppstemperatur ved å bruke varmeputer og / eller oppvarming lamper. Kontinuerlig overvåke kroppstemperatur med en rektal termometer. Dette vil gi rom for proaktiv økning eller reduksjon i oppvarming for å sikre en fysiologisk kroppstemperatur (ͭ6; 37 ° C) under innsamlingen av hemodynamiske data.
- Gi væske støtte for å motvirke blodtap og følelsesløs volumtap.
- Fremstille en 10% løsning av albumin i 0,9% NaCl ved å ta 1 ml av 25% albumin og tilsetning av 1,5 ml 0,9% NaCl i en sprøyte.
- Forbered en lav restvolum intra kateter.
- Bruk tang til å knuse plast hub av en 0,5 tommers 30 gauge nål. Ved hjelp av nål holdere, ta tak i nål og fjern hub. Skrap de resterende limet fra nålen ved hjelp av en pinsetten. Sett den butte enden av nålen inn i en lengde av microbore slangen. Bruke mindre enn 20 inches av lengde for røret.
- Bruk av en sprøytepumpe for å tillate nøyaktige volum som skal leveres.
- Sørg for tilstrekkelig ventilasjon for innsamling av høy kvalitet PV data. Det finnes en rekke mus vifter tilgjengelig for kjøp. Trykkstyrte ventiler gir det lukkede miljø som kreves for en inhalantnesthetic gasser og gi bedre kontroll av ventilasjons under prosedyren.
- Sørg for at inspiratoriske trykk er begrenset til <15 cm H 2 O for å forhindre barotraume. Still ventilator for å levere den inspiratoriske puls i løpet av 35% av respirasjonssyklusen. Bruken av positive ende-ekspiratorisk trykk (PEEP) i en mengde av 4 - 5 cm H 2 O vil gi betraktelig bedre ventilasjon av mus, ved å hindre atelektase av lungen og bæregassutveksling.
- Begrens dead space distal til Y-leddet i ventilasjonskretsen. Dette er kritisk fordi musens tidevolum er svært liten, og noen dead space trekker fra levering av fersk inspirert luft.
- Lag en mus størrelse endotrakeal (ET) rør ved å kutte spissen ut av en 20 gauge inneliggende intra kateter. Dette tilveiebringer en konisk spiss for å lette innsettingen. Plasser den avskårne enden inn i den Y-skjøt av anestesikretsen.
- Bruk fleksible rør i luftkrets. Enhver konstruksjons minne i røret vil skape ytre krefter som har potensial til å trekke endotrakealtuben ut av musen luftveier.
- La musen bestemme respirasjonsfrekvens ved å bruke laveste sats som undertrykker endogene respirasjonen. Start med en relativt langsom respirasjonsfrekvens på rundt 60 pust per minutt.
Merk: Med riktig ventilasjon musen bør gjøre svært lite for å puste. Men hvis ventilasjonen er utilstrekkelig, vil opphoping av CO 2 i blodet initiere respiratoriske innsats av musen. Hvis dette overholdes, øker lufthastigheten er en rett frem måte å øke alveolær ventilasjon. Det er ofte nødvendig å øke lufthastigheten i respons til økninger i kardial arbeidsbelastning i forbindelse med beta-adrenerg reseptor-stimulering. - Når luftkretsen blir fremstilt, trykk teste systemet ved å koble enden av det endotrakeale (ET) tubemed en finger. Sørg for frie luftveier trykk på ≈10 CMH 2 O. Denne testen bør utføres før hver prosedyre.
2. Kirurgisk Approach
- Bruk små tenger og sakser og annet utstyr fra tabell 1. Alle instrumentene er ganske liten til å tillate for enkel bruk i det forstørrede kirurgiske feltet. Bruk en kirurgisk stereo å gi tilstrekkelig forstørrelse for flere aspekter ved den kirurgiske prosedyren.
- Bruk en kirurgi for å maksimere hemostase under inngrepet.
Merk: Det er et par av brede klasser av kirurgi. Thermocautery varmer en tynn metallelement som vil skjære gjennom muskelvev og stoppe blødninger. Disse systemene er i utgangspunktet relativt billig; imidlertid er det viktig å merke seg at lednings tips er både skjør og forholdsvis kostbare. Elektrokauterisering systemer er mer kostbart å kjøpe i utgangspunktet, men tipsene er svært solid, og trenger ikke å bli erstatted. - Induksjon og Kirurgisk Forberedelse
- Skaff kroppsvekt av musen.
- Plassere musen i en induksjons kammer som er fylt med 5% isofluran.
Merk: Musen kan ikke overleve mer enn noen få minutter i dette miljøet. Bare 45 - 60 sek kreves for musen for å miste sine rettende refleks (innsats for å snu når den plasseres på ryggen eller på siden). - Når stabiliseringsrefleks er tapt, reduserer isofluran konsentrasjon til 2% og åpne anestesigass til masken.
- overføre raskt musen til operasjonsbordet og legg den i ryggleie, med snuten i masken.
- Hvis du bruker elektrokauterisering, bruke saltvann gjennomvåt gasbind til elektrisk par muse til jordingsplaten av elektrokirurgisystem.
- Fest lemmer med kirurgisk tape. Dette båndet gir klebende egenskaper selv når det er vått.
- Sett inn en rektal thermoprobe for overvåking kjernen kroppstemperatur. Fest med tape.
- Påfør en hårfjerningskrem til halsen og brystet av musen. Vent 2-3 min for hårfjerningskrem til å arbeide, og deretter fjerne pels fra disse områdene ved hjelp av en bomulls-tipped applikator og / eller laboratorie våtservietter.
Merk: Drapering av operasjonsområdet er ikke nødvendig, da dette er en ikke-overlevelse prosedyre, men kan være ønskelig å begrense kirurgens eksponering for kirurgi jording pad, hvis de brukes. - Når musen er preparert for kirurgi, vurdere kirurgisk plan av musen ved å utføre en tå-klemme. Når sikret en passende anestesidybde musen er klar for første snittet.
- Oppnå kontroll av luftveiene ved oral intubering eller trakeotomi. Trakeotomi er en praktisk tilnærming som er forholdsvis enkel å utføre.
Merk: I denne saksbehandlings beskrivelse alle retninger og orienteringer vil være i forhold til kirurgen.- Lag et snitt i leVEL av sternummarkering som strekker seg fra ≈ 5 mm til høyre for midtlinjen til À 5 mm til venstre for midtlinjen.
- Foreta en andre snitt som strekker seg langs den høyre kant av den første innsnitt, som strekker seg rostrally til et nivå ≈ 2 mm kaudalt for enden av kjeven.
- Foreta en tredje innsnitt som strekker seg fra den rostrale enden av den andre innsnitt over til ≈ 5 mm til venstre for midtlinjen. Trekk den resulterende huden klaffen til venstre for å avdekke de underliggende vev.
- Skill ørespytt og submandibular spyttkjertler på midtlinjen ved stump disseksjon. Dette vil utsette de underliggende muskulaturen liggende luftrøret.
- Rett ut skille høyre og venstre sternohyoideus muskler for å avsløre luftrøret.
- Passere en ≈10 cm stykke 3-0 silke sutur under luftrøret, ta vare å ikke inkludere spiserøret.
- Identifisere stedet for trakeotomi: bare kaudal til strupehodet er det et gap før den første tracheal ring, er dette en idél stedet for å utføre trakeotomi.
- Juster manifold for å gi bedøvelse gass til ventilator og slå på ventilatoren.
- Sjekk for lekkasjer ved å plugge tuppen av endotrakeal (ET) rør med en finger. Sørg for frie luftveier trykk på ≈10 cm H2O.
- Ved hjelp av en 20 gauge nål som en skalpell, langsgående snitt i luftrøret. Gjør snittet relativt bred, som ET tube vil fylle mye av tracheal lumen.
- Beveger seg raskt, fjerne masken og nøye sette ET slangen inn i luftrøret. Ikke tving det som vev er svært skjør og bryte gjennom veggen av luftrøret kan resultere i en pneumothorax.
Merk: Umiddelbart etter innsetting, bør bryst utflukter bli avdekket. - Fest ventilasjonskretsen med tape for å hindre at ET tube fra å bli trukket ut.
- Binde en enkelt halvstikk-knute i 3-0 sutur for å danne en tetning rundt ET røret.
Merk: På dette punktet brystet excursions bør være tydelig. Hvis ikke det er vanligvis plassering av ET rør inne i luftrøret som er problemet. Trekk ET tube tilbake og prøve å flytte den, med fokus på orientering av luftrøret som en veiledning.
- Utarbeidelse av halsvenen nettstedet
- Kjør til venstre spyttkjertlene rostralt-lateralt utsette ytre halsvenen.
- Halvere den tynne muskelen (sternomastoideus) som dekker venen med stump disseksjon. Dette vil utsette den ytre overflaten til halsvenen.
- Nøye klare av noen store biter av vev, men forsiktighet må brukes som veggene i blodåren er svært tynn. Når denne oppgaven er fullført, dekke halsvenen med spyttkjertlene til å bevare den for kanylering senere.
- torakotomi; inn i pleural plass uten å skade hjertet eller lungene
- Fjerne mye av den hud som dekker brystet forløpende den høyre kant avopprinnelige hud snitt ned til nivået for xiphoid prosessen, deretter på tvers av midtlinjen til ≈ 1,5 cm til venstre for midtlinjen.
Merk: Det må utvises forsiktighet når du skjærer gjennom eksterne melke fartøy, som kan være en betydelig kilde til blødning. Cauterizing disse fartøyene før du skjærer dem i stor grad vil forhindre dette blødning. - Ved hjelp av stump disseksjon, trekke huden klaff sidelengs for å avdekke underliggende muskulatur.
- Isolere innsetting av pectoralis major på høyre side nær hale aspekt av sternum ved hjelp kardilaterende tang. Cauterize og kuttet muskelen.
- Skjær gjennom pectoralis major langs sin tilknytning til brystbenet. Cauterize kuttet kantene for å sikre hemostase.
- Neste undergrave latissimus dorsi på den samme side, noe som er et stort ark av muskelen som dekker den laterale aspekt av mus. Cauterize og kutte denne muskelen, og deretter trekke den avskårne enden kranialt. Dette kan kreve litt sløvdisseksjon.
Merk: Ribbeina er nå tydelig og hjertet kan også være synlig i noen musestammer. I de fleste mus vil inn i brystet i hale halvdel av fjerde interkostalrom gir god tilgang til hjertet. Den fjerde interkostalrom er den nest mest hale plass. - Å gå inn i brystet, bruke et par skarpe tang å nøye dissekere ned gjennom intercostalmuskler lag.
- Når pleurahulen er åpnet, nøye sette inn stump-tipped fartøyet dilators. Ved hjelp av fartøyet dilators å gi mild oppadgående kraft på brystveggen, kan du bruke den butte enden våren saks til å nøye innsnittet resten av interkostalrom muskler.
- Først kuttet sideveis, være forsiktig med å kutte lungelapp under. Neste forlenge innsnitt medialt, men bor med 3 - 4 mm sideveis av midtlinjen for å unngå den indre brystarterie.
Merk: De interne mammary fartøy drevet parallelt med sternumog kan resultere i betydelig blodtap hvis kuttet ved et uhell. - cauterize nøye klippekanten av interkostalrom muskler, ved hjelp av en liten bomulls tippet applikator for å rulle vevet oppover for å tillate kirurgi kontakt med snitt vev uten å komme i kontakt med lungene eller hjertet.
- Plasser en saltvanns gjennomvåt lite bomull tippet applikator gjennom snittet peker mot midtlinjen. Gi en svak oppadgående trekkraft til å trekke brystveggen bort fra de underliggende strukturer. Begynn cauterizing brystveggen på den mediale kanten av snittet og slutter ≈ 1 cm sideveis av midtlinjen på venstre side.
- Advance applikatoren til venstre, slik at det er kontinuerlig under kirurgi spissen.
- Når vevet er grundig cauterized, bruke saks til å nøye skjære gjennom brystbenet. Toppunktet av hjertet skal være godt synlig på dette punktet.
- Ved hjelp av stump disseksjon, forstyrre hjerteposen og identifisere hale vena cava.
- Se etter tegn til blødning og cauterize det nå. Når all blødning har blitt adressert, fjerner du forsiktig drapering, kirurgi jording pad, og saltvann gjennomvåt gasbind.
- Fjerne mye av den hud som dekker brystet forløpende den høyre kant avopprinnelige hud snitt ned til nivået for xiphoid prosessen, deretter på tvers av midtlinjen til ≈ 1,5 cm til venstre for midtlinjen.
- Plassering av vena venekateter
- Koble kateteret i trinn 1.6.2 til sprøyten inneholdende 10% albumin ved forsiktig gli røret i løpet av en 30 gauge nål.
- Begynn infusjonen albumin gjennom kateteret.
- Orientere kateteret slik at nålen ligger på halsvenen på egen hånd, med nålen skrå opp. Om nødvendig, bruk en nål holder å rotere nålen i slangen for å flytte skrå til riktig retning.
- Når kateteret er fullstendig spylt stoppe infusjonen.
- Ta tak i kateteret nål med en tang. Med den annen side bruker en vev tang for å trekke tilbake spyttkjertelen for å tillate visualisering av halsvenen. Påfør forsiktig trekkraft til vev rundt distal venavene skape spenning på karveggen. Ved hjelp av en grunne innfallsvinkel, sett nøye nålen inn i venen. Advance tuppen av nålen med 3 - 4 mm inn i beholderen.
- Før frigjøring av kateteret nålen feste kateteret røret med et stykke av båndet, vil dette begrense en eventuell bevegelse av nålen når det slippes.
- Slipp nål og forsiktig trekke tilbake på sprøytestemplet for å bekrefte at kateteret er i lumen av fartøyet, ved å visualisere blodet i linjen.
- Når plassert riktig feste kateteret med kirurgisk lim for å feste nålen til de underliggende spyttkjertlene.
- Beregn det totale volumet som skal infunderes. Hvis det ikke var betydelig blodtap et volum på 5 ul / g kroppsvekt vil være tilstrekkelig. Hvis det var betydelig blodtap infusjonen 6-6,5 ul / g kan være nødvendig. Angi strømningshastigheten slik at hele infusjonen vil bli fullført i 10 - 15 min.
- PV kateteriseringen ivenstre ventrikkel
- I løpet av den kirurgiske prosedyren som beskrevet ovenfor, plassere PV kateteret i en sprøyte inneholdende en saltoppløsning for å tillate det å stabilisere seg.
- Like før den plasseres, bevege sprøyten og kateteret ved siden av musen. Med kateterspissen på omtrent samme høyde som hjertet, null trykkavlesningen.
- Ved hjelp av en saltløsning gjennomvåt lite bomull tippet applikator, manøvrere hjerte til å tillate visualisering av apex.
- Ved hjelp av en 25 gauge nål, lage en stikk innsnitt som nær midten av apeks som mulig.
- Etter fjerning av nålen, raskt føre inn katetret gjennom snittet. Det tar ikke mye kraft for å sette inn kateteret, så viser tilbakeholdenhet når fremme kateter inn i ventrikkelen. Av og til er det nødvendig å utføre en ytterligere stikke innsnitt. Dersom dette er nødvendig, forsøke å utføre den etterfølgende innsnitt nær den første sted for å minimere skade på hjertet.
Ikkee: Når kateteret er ført inn i ventrikkelen den endelige plassering er kritisk viktig. Den ventrikulære trykket tracing vil være tydelig ved en lav diastolisk trykk (<10 mm Hg) og et høyt systolisk trykk (> 80 mmHg ved dette punkt). Ideelt sett vil kateteret være sentrert i ventrikkelen med de ytre elektrodene bare i ventrikkelen. Finjusteringer i kateterposisjon kan utføres ved å observere PV-loop-data, på jakt etter en boks-formet tracing med ≈ 90 ° vinkel mellom sidene.
3. Saksbehandlings Detaljer
Merk: Når kateteret er på plass en kort stabiliseringsperiode (10-15 min) er nødvendig for at dyret å komme seg fra noen av akutt kirurgisk stress og for å gi tid for infusjon av væsker. Etter denne stabiliseringsperioden selve protokollen kan begynne.
- Når PV kateteret er plassert og kirurgisk manipulasjon er opphørt,skru ned isofluran til ≈ 1% som behovet for en dyp kirurgisk plan anestesi blir dårligere.
- I løpet av denne perioden, overvåke nøye musen for å sikre at et passende nivå av anestesi opprettholdes. vurdere nøye enhver bevegelse; bevegelse av respirasjonsmuskulaturen antyder et nivå på underventilering og kan løses ved å øke lufthastigheten av respiratoren. Bevegelse av lemmer eller rykninger av værhår er tegn på at musen blir for lys og krever mer bedøvelse.
Merk: Det finnes en rekke forskjellige permutasjoner av behandlinger som kan anvendes i kombinasjon med denne protokoll. Mange av disse behandlingene vil kreve tilførsel av medikamenter. Det er viktig å håndtere de døde-space volum effektivt. Løsnings brytere kan oppnås ved å skyve kateterslangen fra nålen av en sprøytepumpe til den andre. Å gjøre dette like før slutten av den tidligere infusjons tillater kateteret produksjonsrøret til å bli lastetmed den neste stoffet. Det er nødvendig å kjenne volumet inne i kateterrøret for å bestemme tidspunktet for oppløsningen bryteren. Innføring av en liten luftboble i ledningen gjør det mulig presis timing av infusjons bryteren som skal bestemmes; denne boblen infused inn i venesirkulasjonen er godt tolerert.
- I løpet av denne perioden, overvåke nøye musen for å sikre at et passende nivå av anestesi opprettholdes. vurdere nøye enhver bevegelse; bevegelse av respirasjonsmuskulaturen antyder et nivå på underventilering og kan løses ved å øke lufthastigheten av respiratoren. Bevegelse av lemmer eller rykninger av værhår er tegn på at musen blir for lys og krever mer bedøvelse.
- Endre belastningsforhold i hjertet ved å senke forspenning og økende afterload.
- Reduser forspenning ved å blokkere venøs retur til hjertet. I dette preparatet, visualisere og tilstoppe hale vena cava når den passerer fra membranen til hjertet. Utfør denne okklusjon jevnt og relativt raskt, som varer ikke mer enn 2-3 sek. Øk venstre ventrikkel afterload forbigående ved å utføre en mild abdominal kompresjon varig 1-2 sek.
- I løpet av disse endringer i belastning av hjertet, stopper respirasjon for å eliminere en hvilken som helst gjenstand som innføres av respiratoren.
- Kalibrere volum signal ved hjelp the konduktans kateter. Disse prosedyrene er ikke nødvendig med kateter ved hjelp av opptak teknologi.
- Etter at forsøksprotokoll injisere 5 - 10 ul hypertonisk saltløsning (20% NaCl) for å beregne den parallelle konduktans.
- Samle opp blod ved å fjerne kateteret og trekke blod fra venstre ventrikkel inn i en heparinisert sprøyte. Plasser denne blod inn i kyvetter med kjent volum, og bruk kateteret for å måle konduktans.
- Bruk kyvette konduktans tiltak for å omdanne ledningsevnesignalet til volum og den parallelle konduktans er nødvendig for å definere den absolutte volum målt ved hjelp av kateteret.
- Når protokollen er fullført, avlive mus ved å fjerne hjertet følgende tran av vena cava og aorta vedlegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved konvensjonen, er volumet plottet på X-aksen og trykk på Y-aksen som i figur 1. Trykk volum looper som følge av plotting press mot volum skal ligne et rektangel, de vertikale kantene representerer Isovolumisk endringer i trykk (dvs. når både mitral og aorta ventiler er lukket). Den nederste horisontale representerer ventrikulær fylling gjennom mitral ventil og den øvre horisontale del representerer ventrikulær tømming gjennom aorta ventilen. I en sunn villtype mus venstre ventrikkel presset fra 90 - 110 mmHg forventes med maksimal dP / dt fra 8000 - 12 000 mmHg / sek (se tabell 1 for utvalgene av normale hemodynamiske parametre). De normale områder som er gitt i tabellen er basert på verdier hentet fra villtype C57BL / 10 og C57BL / 6 mus; Det er imidlertid viktig å merke seg at det er betydelige forskjeller mellom stammer 21. Fremgangsmåten outlined her fokuserer på bruk av en apikal stikke innsnitt for å posisjonere kateteret i den venstre ventrikkel. En annen populær metode er å føre inn katetret retrograd gjennom aorta-ventilen følgende kateterinnførings i den høyre halspulsåren. Den retrograd måte som den fordel ved at den kan utføres med en lukket bryst, noe som resulterer i opprettholdelse av normal intra thorax trykk; imidlertid, er dyr ofte ventilert under denne prosedyren som begrenser denne fordel. De lukkede bryst tilnærming grenser kontroll over kateteret orientering i ventrikkelen, mens den åpne brystkassen tilnærmingen gir større evne til å manøvrere kateteret inne i ventrikkelen. Et potensielt problem med retrograd innføring av kateteret er potensialet for utstrømningen spor obstruksjon. Diameteren på mus aorta varierer 0,8 til 1,2 mm 22,23, diameteren av kommersielt tilgjengelige trykk-volum katetere i området fra 0,33 (1,0 fransk) til 0,47 mm (1,4 FreNCH). De relative størrelser av disse katetrene i forbindelse med en stor og liten aorta er avbildet i figur 2. Fraksjonen av utløpskanalen blokkert av kateteret krysse aorta kan bli et betydelig problem i mindre hjerter og bør tas i betraktning når man utfører PV sløyfe studier i små hjerter. Det er flere gjenstander av måling som kan komplisere analysen av PV data, en av de mest vanlige er kateter innfanging. Dette er tydelig som en økning i trykket ved enden av systolen sannsynligvis som følge av direkte kompresjon av trykkgiveren med en papillær muskel eller annen dynamisk struktur i ventrikkelen (figur 3). Dette er problematisk, fordi de fleste fremgangsmåter for å bestemme systolisk funksjon bruke maksimalt trykk. Det systoliske trykk og maksimal derivat av trykk (dP / dt) fra datasettene med kateter innesperring må undersøkes nøye, og kan ha behov for analysen må endres for å oppnå meningsfulle data.
Trykkvolum sløyfer kan anvendes i en rekke forskjellige protokoller for å vurdere hjertefunksjonen. Disse inkluderer vurderinger av hjertefunksjon via β-adrenerge stimulering 12,14,16,17. En rekke forskjellige medikamenter kan bli tilført for å vurdere eventuelle akutte virkninger på hjertets fysiologi. Kontroll av luftveier gjør også for administrasjonen av endrede gassblandinger slik at effekten av hypoksi og / eller acidose på hjertets funksjon rettes direkte 24-27. Videre kan analyse av disse PV data også gi en detaljert vurdering av de passive egenskapene til venstre ventrikkel, som kan endres betydelig i ulike sykdomstilstander 12.
| Parameter | Normal Range |
| systoletrykk | 90-110 mmHg |
| diastoliske trykket | 4 - 10 mmHg |
| Maksimal dP / dt | 8000 - 12 000 mmHg / sek |
| Minimum dP / dt | -8,500 - -12,000 MmHg / sek |
| Tau | 5-6 sek |
| Puls | 550-600 bpm |
| Cardiac Output | 10 - 13 ml / min |
| ejeksjonsfraksjon | 40 - 60% |
Tabell 1. normale verdier for utvalgte hemodynamisk Parametere.
Figur 1: Representative Trykk volum sløyfer fra en villtype C57BL / 10 mus Representative data som ble samlet ved hjelp av de fremgangsmåter som er beskrevet i thi.s manuskript. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av betydningen av Aorta Diameter og potensial Avløp Track Obstruksjon Skjematisk tegning av de relative størrelser av musen aorta og de kommersielt tilgjengelige trykk volum katetre for mus.. Disse dataene understreker viktigheten av å vurdere utbetaling spor hindring når man vurderer mindre mus bruker en retrograd kateterinnleggelse tilnærming. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er tre kritiske trinn i denne fremgangsmåte: 1) plassering av det endotrakeale røret og passende ventilasjon, 2) plassering av vena IV kateter, og 3) den riktige plassering av PV kateter i venstre ventrikkel. Bestemme egnet åndedrettsfrekvensen er en viktig del av å gi ventilasjonsstøtte. Bevisste mus generelt opprettholde alveolær ventilasjon med raske grunne åndedrag. Generelt vil ventilerte mus har mye større tidevolum. Dermed kreves en lavere lufthastighet. Dette er viktig som for lite ventilasjon vil resultere i luftveiene acidose og for mye ventilasjon vil føre til respiratorisk alkalose, begge forhold som vil endre hjertefunksjon. En enkel måte å optimalisere respirasjonsfrekvens er å ta signaler fra musens respirasjon og bruke den laveste lufthastighet som eliminerer respirasjon fra bedøvede mus.
En kritisk funksjon i PV sløyfeanalysen er å opprettholde et tilstrekkelig nivå av anestesi uten betydelig svekkelse av hjertefunksjonen. Det er mange anestesi regimer som kan med hell brukes til å utføre PV sløyfe analyse. Disse kan deles inn i to hovedkategorier: inhalant og injiserbare bedøvelse. Innenfor denne siste gruppen er en rekke blandinger som kan brukes, men mange av disse blandingene har potensielle cardio-depressive effekter 19. Av de injiserbare cocktails, uretan basert anestetika har minst cardio-depressive effekter 4,19. Vær nøye med å begrense eksponering av personell til uretan som det er en mistenkt kreftfremkallende 28. Isofluran og sevofluran er tilgjengelige inhalant anestetika. Begge disse agentene har cardio-depressive effekter ved doser tilstrekkelig for kirurgisk manipulering. Viktigere, kan inhalasjonsanestetika titreres til effekt. Dette tillater en høyere smertestillende dose i løpet av den kirurgiske forberedelse og deretter en lavere sedative dose for måling av hjertefunksjon, og dermed minimere cardio-depressive effekter av disse forbindelsene.
Dersom de hemodynamiske parametre er under de normale nivåer, er det flere vanlige årsaker. Først er lavt blodvolum, sekundært til blodtap eller fordampning. Denne komplikasjonen er vanligvis adressert med væsken administrasjon skissert i avsnitt 2.7. Som nevnt i punkt 1.5, vedlikehold av kroppens kjernetemperatur er også svært viktig for vurderingen av hemodynamisk funksjon. Dermed nøye overvåking er viktig, kan en digital feedback system være nyttig for å opprettholde kroppens kjernetemperatur under opptak. Sikre at bedøvelsesmidlet har blitt skikkelig redusert i løpet av målefasen er også et viktig aspekt ved forbedring av hjerteytelse.
Måling av lastuavhengige parametere av kontraktilitet er en av de viktigste fordelene med PV sløyfe analyse. Sanntids samtidig samling av trykk og volumUme data gir den unike evnen til å måle de hemodynamiske endringer i respons til varierende belastningsforhold på hjertet. Denne analysen tillater den kontraktile funksjon av hjertet for å bli isolert fra handlingene til fartøyene. Reduksjoner i forspenning gjennom okklusjon av venøs retur har blitt brukt til å vurdere lastuavhengige tiltak av kontraktilitet i mange dyremodeller og mennesker 4,7,12-16,18,29-32. I små gnagere, resulterer denne prosedyren i en buet ende-systolisk trykk-volum forhold 4,31,33. Denne sannsynlige resultatene fra reduksjon i koronar perfusjon som dramatisk akselererer nedgangen i systolisk funksjon 34. I mus, 2 - 3 sekunder av milde abdominal komprimering resulterer i en høyrerettet forskyvning av PV sløyfene. Dette skyldes både en økning i afterload og forhåndslaste 12. Langvarig økninger i afterload resultere i en økning i kontraktile funksjon, et fenomen som kalles Anrep effekt 35. Menkort varighet av den abdominale kompresjons brukt i disse studiene indikerer at Anrep virkning ikke påvirker hjertefunksjonen med denne fremgangsmåten. I andre studier, ble akutt aorta innsnevring i hunder vist seg å øke kontraktile funksjon, men dette ble antatt å skyldes virkningene av redusert systemisk perfusjon 36. Igjen varigheten og alvorlighetsgraden av den forstyrrelse av aorta-strømnings som følge av abdominal kompresjon, slik det er beskrevet her, er ikke tilstrekkelig til å vesentlig øke kontraktile funksjon sekundært til hypo-perfusjon av systemiske vev. Analyse av PV looper innhentet av abdominal kompresjon justere godt med PV sløyfer innhentet kort tid etter at hale vena cava okklusjon. Sammen utgjør disse observasjonene demonstrerer at den transiente abdominal kompresjon som er beskrevet her, ikke signifikant påvirker den kontraktilitet av hjertet. Dessuten gir denne fremgangsmåten en viktig metode for å vurdere de passive egenskaper av hjertet over et bredere løpge av slutt-diastolisk volum.
Analysen av lastuavhengig tiltak krever valg av spesifikke PV løkker som skal inkluderes i analysen. Det er kritisk viktig at dette gjøres konsekvent på tvers av en eksperimentell datasett. Overtrykksventilasjon skaper en hemodynamisk gjenstand gjennom pusteavhengige endringer av forspenning til venstre ventrikkel 37. For å unngå dette gjenstand, bør PV løkker skal samles i løpet av korte perioder med apné (3-4 sek). Pauser i respirasjon er spesielt nyttig som de gir bedre kontroll med eksperimentelle endringer i lasting på hjertet. Det er viktig å holde disse perioder med apnea korte for å unngå hypoventilasjon. Prosedyrene er beskrevet i dette manuskriptet samle lastuavhengig data fra to forskjellige prosedyrer, hale vena cava okklusjon og abdominal kompresjon, samlet på omtrent samme tid. Sløyfene isolert fra disse to prosedyrene bør kombineres og analyseres together de begge måle funksjon av det samme dette under, omtrent de samme betingelser. Det er flere prinsipper for å vurdere når du velger sløyfer for analyse. Unngå arytmisk beats. Valdet etter en falt beat er alltid unormalt store og premature slag er unormalt liten; begge vil forstyrre analysen av dataene. Unngå slag hvor trykket avtar, men volumet er konstant. Disse er vanlig i mus etter okklusjon av hale vena cava, og er sannsynligvis sekundær til dårlig perfusjon av hjertemuskelen. Endelig omfatter bare data fra beats direkte etter endringen i lasting; beats under utvinning perioden er trolig påvirket av endringer i sympatisk nerveaktivitet sekundært til endringer i systemisk blodtrykk som følge av manipulering av belastningsforhold i hjertet.
PV sløyfe analysen gir en svært detaljert vurdering av hjertefunksjon. Når anvendt i forbindelse med den genetiske flexbilitet og lave bokostnader med musen det kan gi en hensiktsmessig å vurdere hjertefysiologi på molekylært nivå. Det er flere viktige begrensninger som må vurderes når de bestemmer seg for å utføre disse analysene. For det første er dette en invasiv prosedyre hvori mus ble bedøvet, noe som kan påvirke viktige aspekter av hjertefunksjonen. Videre er tolkningen av PV sløyfe data krever en detaljert forståelse av hjerte fysiologi både for å identifisere mønstre innenfor de data og eventuelle ledsagende variabler. I tillegg, fordi disse analysene er terminal kan de ikke brukes til å vurdere den samme musen gjentatte ganger. De ventrikulære volumer avledet fra PV katetre tendens til å være mindre nøyaktig enn de anatomiske ventrikulære volumene som tilbys av MR. Dette er ikke overraskende som PV katetre model ventrikkelen som en sylinder, som er helt klart et estimat av det samlede volumet av ventrikkelen. Den virkelige styrke er evnen til å samle dette volumet informasjon på et høyt frefrekvens, og dermed gir beat-to-beat analyse av endringer i ventrikkel volum.
Innsamling og analyse av PV data fra mus kan være utfordrende, men metoden gir informasjon om hjertefunksjon som ikke er tilgjengelig gjennom noen annen metode. Denne prosedyren gir best bilde av hjertefunksjonen tilgjengelig og dens utnyttelse i murine modellen vil gi en viktig plattform for bestemmelse av de molekylære grunnlaget for komplekse hjertesykdomstilstander som hjertesvikt og arvet cardiomyopathies. Dette manuskriptet gir detaljert informasjon om de mest kritiske aspekter ved å utføre denne prosedyren. Men som alle kompliserte prosedyrer, krever denne praksis å bygge mikro ferdigheter som er nødvendig for å kunne utføre disse eksperimentene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatteren ønsker å erkjenne finansiering fra NHLBI (K08 HL102066 og R01 HL114832).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont 5/45 (2) | Fine Science Tools | 11251-33 | |
| Vessel Dilating Forceps | Fine Science Tools | 18153-11 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissor | Roboz Instruments | RS-5668 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Curved | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Straight | Fine Science Tools | 11040-08 | |
| Dissector Scissors- Heavy Blade | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| 3-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| TOPO Ventilator | Kent Scientific | TOPO | |
| Martin ME 102 Electrosurgical Unit | Harvard Apparatus | PY2 72-2484 | |
| Syringe Pump | Lucca Technologies | GenieTouch | |
| Stereomicroscope with boom stand | Nikon | SMZ-800N | |
| Thermocouple Thermometer | Cole Parmer | EW-91100-40 | |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Data Acquision and Analysis | DSI | Ponemah ACQ-16 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), e29-e322 (2015).
- Katz, A. M. Influence of altered inotropy and lusitropy on ventricular pressure-volume loops. J Am Coll Cardiol. 11 (2), 438-445 (1988).
- Kass, D. A., Maughan, W. L. From "Emax" to pressure-volume relations: a broader view. Circulation. 77 (6), 1203-1212 (1988).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 274 (4 Pt 2), H1416-H1422 (1998).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Feldman, M. D., et al. Validation of a mouse conductance system to determine LV volume: comparison to echocardiography and crystals. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279 (4), H1698-H1707 (2000).
- Baan, J., et al. Continuous measurement of left ventricular volume in animals and humans by conductance catheter. Circulation. 70 (5), 812-823 (1984).
- Salo, R. W., Wallner, T. G., Pederson, B. D. Measurement of ventricular volume by intracardiac impedance: theoretical and empirical approaches. IEEE Trans Biomed Eng. 33 (2), 189-195 (1986).
- Wei, C. L., et al. Volume catheter parallel conductance varies between end-systole and end-diastole. IEEE Trans Biomed Eng. 54 (8), 1480-1489 (2007).
- Kutty, S., et al. Validation of admittance computed left ventricular volumes against real-time three-dimensional echocardiography in the porcine heart. Exp Physiol. 98 (6), 1092-1101 (2013).
- Kottam, A., Dubois, J., McElligott, A., Henderson, K. K. Novel approach to admittance to volume conversion for ventricular volume measurement. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2514-2517 (2011).
- Meyers, T. A., Townsend, D. Early right ventricular fibrosis and reduction in biventricular cardiac reserve in the dystrophin-deficient mdx heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (4), H303-H315 (2015).
- Townsend, D., Yasuda, S., Li, S., Chamberlain, J. S., Metzger, J. M. Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther. 16 (5), 832-835 (2008).
- Townsend, D., et al. Systemic administration of micro-dystrophin restores cardiac geometry and prevents dobutamine-induced cardiac pump failure. Mol Ther. 15 (6), 1086-1092 (2007).
- Strakova, J., et al. Dystrobrevin increases dystrophin's binding to the dystrophin-glycoprotein complex and provides protection during cardiac stress. J Mol Cell Cardiol. 76, 106-115 (2014).
- Yasuda, S., et al. Dystrophic heart failure blocked by membrane sealant poloxamer. Nature. 436 (7053), 1025-1029 (2005).
- Townsend, D., Daly, M., Chamberlain, J. S., Metzger, J. M. Age-dependent dystrophin loss and genetic reconstitution establish a molecular link between dystrophin and heart performance during aging. Mol Ther. 19 (10), 1821-1825 (2011).
- Townsend, D., Yasuda, S., McNally, E., Metzger, J. M. Distinct pathophysiological mechanisms of cardiomyopathy in hearts lacking dystrophin or the sarcoglycan complex. FASEB J. 25 (9), 3106-3114 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect. J Vis Exp. (100), e52618-e52618 (2015).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiol Genomics. 42A (2), 103-113 (2010).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (5), H1829-H1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
- Palpant, N. J., Day, S. M., Herron, T. J., Converso, K. L., Metzger, J. M. Single histidine-substituted cardiac troponin I confers protection from age-related systolic and diastolic dysfunction. Cardiovasc Res. 80 (2), 209-218 (2008).
- Palpant, N. J., D'Alecy, L. G., Metzger, J. M. Single histidine button in cardiac troponin I sustains heart performance in response to severe hypercapnic respiratory acidosis in vivo. FASEB J. 23 (5), 1529-1540 (2009).
- Palpant, N. J., et al. Cardiac disease in mucopolysaccharidosis type I attributed to catecholaminergic and hemodynamic deficiencies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H356-H365 (2011).
- Townsend, D. Diastolic dysfunction precedes hypoxia-induced mortality in dystrophic mice. Physiol Rep. 3 (8), e12513 (2015).
- Schmähl, D., Port, R., Wahrendorf, J. A dose-response study on urethane carcinogenesis in rats and mice. Int J Cancer. 19 (1), 77-80 (1977).
- Freeman, G. L., Little, W. C., O'Rourke, R. A. The effect of vasoactive agents on the left ventricular end-systolic pressure-volume relation in closed-chest dogs. Circulation. 74 (5), 1107-1113 (1986).
- Reyes, M., et al. Enhancement of contractility with sustained afterload in the intact murine heart: blunting of length-dependent activation. Circulation. 107 (23), 2962-2968 (2003).
- Segers, P., et al. Conductance catheter-based assessment of arterial input impedance, arterial function, and ventricular-vascular interaction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (3), H1157-H1164 (2005).
- Townsend, D., et al. Chronic administration of membrane sealant prevents severe cardiac injury and ventricular dilatation in dystrophic dogs. J Clin Invest. 120 (4), 1140-1150 (2010).
- Sato, T., Shishido, T., et al. ESPVR of in situ rat left ventricle shows contractility-dependent curvilinearity. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 274 (5 Pt 2), H1429-H1434 (1998).
- Sunagawa, K., et al. Effects of coronary arterial pressure on left ventricular end-systolic pressure-volume relation of isolated canine heart. Circ Res. 50 (5), 727-734 (1982).
- Cingolani, H. E., Pérez, N. G., Cingolani, O. H., Ennis, I. L. The Anrep effect: 100 years later. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H175-H182 (2013).
- Baan, J., van der Velde, E. T. Sensitivity of left ventricular end-systolic pressure-volume relation to type of loading intervention in dogs. Circ Res. 62 (6), 1247-1258 (1988).
- Rankin, J. S., Olsen, C. O., et al. The effects of airway pressure on cardiac function in intact dogs. Circulation. 66 (1), 108-120 (1982).
