Detta protokoll visar genomförandet av en optimerad N-metyl-D-glucamine (NMDG) skyddande återhämtning framställningsmetod hjärnan slice. En enda media formulering används för att på ett tillförlitligt sätt få friska hjärnan skivor från djur i alla åldrar och för olika experimentella tillämpningar.
Detta protokoll är en praktisk guide till N-metyl-D-glucamine (NMDG) skyddande återhämtning framställningsmetod hjärnan slice. Många senare studier har validerat nyttan av denna metod för att öka neuronal bevarande och övergripande hjärnan slice livskraft. Genomförandet av denna teknik av tidiga användare har underlättat detaljerade utredningar av hjärnans funktion med hjälp av experimentell applikationsmöjligheter och som spänner över ett brett utbud av djur åldrar, regioner i hjärnan och celltyper. Stegen beskrivs för att utföra den skyddande återhämtning hjärna slice tekniken använder en optimerad NMDG konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) media formulering och förbättrade förfarandet att på ett tillförlitligt sätt få friska hjärnan skivor för patch clamp elektrofysiologi. Med detta uppdaterade synsätt, en betydande förbättring observeras i hastigheten och tillförlitligheten hos gigaohm försegla bildandet under riktade patch clamp inspelning experiment bibehållen utmärkt neuronala konservering, därigenom underlätta utmanande experimentella program. Representativa resultat tillhandahålls från flera neuron patch clamp inspelning experiment till assay synaptic anslutning i hjärnbarkens hjärnan skivor tillagad av unga vuxna transgena möss och mogna vuxna människors Neurokirurgiska exemplar. Metoden optimerad NMDG skyddande återhämtning för hjärnan skivning är dessutom kompatibel med både juvenila och vuxna djur, alltså lösa en begränsning av den ursprungliga metoden. Sammanfattningsvis, kan en enda media formulering och hjärnan skivning förfarandet genomföras över olika arter och åldrar att uppnå utmärkta livskraft och vävnad bevarande.
Akut hjärnskada slice beredningen är en grundläggande experimentellt modellsystem i neurovetenskap. För ungefär hälften av ett sekel, har denna plattform aktiverad dynamiska funktionella studier av hjärnan levande över en mängd olika anatomiska hjärnregioner och djurarter. Om den avsedda användningen är biokemi, funktionell avbildning, morfologi eller elektrofysiologi, är det av yttersta vikt att säkerställa optimal integritet och lönsamhet av skivad vävnad. Det är anledningen till att mycket flexibel juvenil gnagare hjärnan slice beredning (dvs.yngre än postnatal dag 30 för möss) har varit de mest föredragna hittills. Svårigheten att erhålla tillräckligt frisk hjärna skivor från mogna vuxna och åldrande djur har visat sig vara en stor utmaning för de flesta och har infört stränga begränsningar för att studera hjärnans mogna funktionella arkitektur. Detta är särskilt sant för patch clamp inspelning, en teknik som kräver utmärkta morfologiska och funktionella bevarande och är oumbärlig för att karaktärisera detaljerade inneboende och synaptic egenskaper av identifierade enda nervceller. För de senaste decennierna, den stora majoriteten av patch clamp Elektrofysiologer har förlitat sig på en ”skyddande skära’ metod där sackaros-substituerade låg Na+ aCSF1 för att förbereda friska hjärnan skivor från juvenil, och i långt mindre utsträckning, unga vuxna djur. Denna metod bygger på förutsättningen att passiv Na+ tillströmning och efterföljande vatten inresa och cell svullnad under slice styckning steg är den dominerande förolämpning som leder till dålig överlevnad av nervceller, särskilt för de nervcellerna som ligger i den ytliga lager som är mest sannolikt att upprätthålla direkt trauma från bladet rörelsen. Men lämnar metoden skyddande skärande fortfarande mycket att önska för hjärnan slice förberedelse från mogna vuxna djur oavsett särskilt aCSF utformningen genomförs.
En enkel men effektiv lösning på problemet har varit beskrivs2,3,4,5,6 och kallas metoden ‘skyddande återhämtning’ hjärna slice. Den ursprungliga versionen av denna metod använder en NMDG-substituerade aCSF, som NMDG identifierades som den mest mångsidiga och effektiva bland olika andra kandidat natrium ion substitut (inklusive sackaros, glycerol, kolin och Tris). Media formuleringen var ytterligare förbättras genom tillägg av HEPES att motstå hjärnan slice ödem och ge starkare pH buffert7, samt tillägg av tillskott för att motverka de skadliga effekterna av oxidativ stress (tabell 1). Det bestämdes empiriskt att en inledande återhämtning inkubation steg i låg Na+, låg Ca2 +, och hög Mg2 + NMDG aCSF omedelbart efter vuxna hjärnan vävnad skivning var både nödvändig och tillräcklig för bättre neuronala bevarande över ett brett spektrum av områden i hjärnan, celltyper och djur åldrar3,5,6.
Särskilt, kan tidigare inkarnationer av vad nu dubbas de skyddande återställningsmetoden hittas i litteraturen1,8,9,10,11,12, 13, även om den fulla potentialen för mogen vuxen och åldrande djur hjärnan skiva och patch clamp inspelning var inte erkännas eller visat i dessa tidigare arbeten. Dessutom fortsätta nyanserad procedurmässiga variationer växa fram för att stödja specifik experimentella program4,14,15,16. Kollektiva kroppen av arbete av dessa många forskargrupper förmedlar högt förtroende i robustheten i de skyddande återställningsmetoden för förbättrad vävnad bevarande. Metoden NMDG skyddande återhämtning har nu allmänt antagits och genomförts i många publicerade studier utnyttjar vuxna djur hjärnan slice preparat. Dessa akuta slice studier span hjärnbarkens3,17,18, Hippocampus15,19,20,21, striatum22 , 23 , 24, mellanhjärnan25,26,27,28,29och hindbrain30,31,32, 33 , 34 regioner, och en mängd signalsubstans och neuromodulator typer inklusive glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 ,36, dopaminerga24,29,37,38, kolinerga14,37,38, 39, noradrenerga40och serotonerga27,28 neurotransmission. Metoden lämpar sig också väl för optogenetic kontroll av neuronal aktivitet i skivor som härrör från transgena djur3,39 eller efter i vivo viral injektioner17,27, 28,40,41,42,43, som väl så funktionell Ca2 + avbildning av neuronal aktivitet2,44 ,45,46. Analyser av både kortsiktiga plasticitet4,47,48 och varierande formerna av långsiktiga plasticitet16,35,48 har varit rapporterade. En nyligen genomförd studie tillämpas metoden NMDG skyddande återhämtning för att underlätta omfattande och systematisk sondering av synaptic anslutning i syncentrum i mogen vuxen mus hjärnan skivor med hjälp av den octopatch inspelning konfiguration49 — en kraftfull demonstration av verktyget och robusthet av denna metod. Den skyddande återställningsmetoden har även tillämpats i tidigare oförutsedda experimentella sammanhang, såsom, förbättrad bevarandet av kärlsystemet och pericyter i vuxna kortikala hjärnan skivor50, patch clamp inspelning från transplanterade interneuron populationer i 1-1,5 år gammal Alzheimers sjukdom mus modeller20och en vuxen hjärna slice receptor människohandel assay51.
Följande protokoll beskriver stegvisa procedurer för att genomföra en optimerad NMDG skyddande återställningsmetod hjärnan slice förberedelser att förbättra lönsamheten för akut hjärnskada skivor. Principerna för förbättrad neuronala bevarande diskuteras, samt demonstration av de tydliga fördelarna med denna metod för komplexa multi neuron patch clamp inspelning experiment i både unga vuxna transgena möss hjärnan skivor och mogna vuxna Neurokirurgiska människohjärnan skivor. Följande protokoll har validerats för möss från 21 dagar gamla till mer än ett år gamla, samt när det gäller mänskliga Neurokirurgiska prover från vuxna patienter.
Na + Spike-i förbättrar Gigaohm förseglar bildandet och Patch Clamp inspelning framgång
Den första versionen av metoden NMDG skyddande återhämtning utformades specifikt för vuxen och åldrande djur2,5. Vissa tidiga användare har också försökt att tillämpa denna metod på juvenila djur hjärnan skivning (dvs, möss < 30 dagar gammal). Det har dock noterats att i motsats till utestående visuellt-bekräftade neuronala bevarandet med metoden NMDG skyddande återhämtning i detta åldersintervall, gigaohm förseglar bildandet kan ofta stall ut, vilket leder till misslyckade patch clamp inspelning försök. En hypotes är att NMDG kationer lättare fastnar i juvenil hjärnan skivor i förhållande till vuxna hjärnan skivor och kan hindra förseglar bildandet; dock gigaohm tätningar kan lätt bilda medan juvenil hjärnan skivor är helt nedsänkt i NMDG aCSF (inga data anges), vilket indikerar att NMDG aCSF i sig hindrar inte gigaohm förseglar bildandet.
Den snabba övergången från låg till hög Na+ lösning vid slutförandet av det inledande hjärnan slice återhämtning steget orsakar skador på neuronala membran och perturbs förseglar bildandet processen. Detta är intuitiv eftersom övergången från låg till hög Na+, kall-till-varm temperatur och dramatisk höjning av de Ca2 + Mg2 + förhållande till kollektivt leda till en massiv återkomsten av spontana synaptisk aktivitet. Denna hämmande rebound fas i hjärnan skivning förfarandet sannolikt att spegla reperfusionsskada efter en ischemisk förolämpning. Därmed ytterligare mildra neuronala membran skador i inledande återhämtningsfasen en gradvis Na+ spike-i förfarandet har införlivats som höjden av Na+ koncentration i NMDG skyddande återhämtning inkubation kammaren är långsamt och reproducibly förhöjda med exakt timing. Liksom i den ursprungliga skyddande indrivningsförfarandet är temporal dissociationen av Na+ höjd från temperatur och Ca2 +/Mg2 + baserat höjd fördelaktigt. Men dessutom Na+ spike-i förfarandet leder till små stegvisa ökningar extracellulära Na+ koncentration över tidiga tidpunkter och stora ökningar mot slutet tidpunkter, därmed ger hjärnvävnaden en möjlighet att bättre tillgodose till de stigande nivåerna som Na+ . Detta förfarande är ett alternativ till gradvis lösning exchange kontrolleras av en perfusion pump eller gravity dropp linjer som leder till ständiga ökningar i Na+ nivåer och kräver uppmärksamhet på både in- och utflöde till undvika överflöde av slice kammaren. Noterbart i denna Na+ stiger spike-i förfarandet osmolalitet av lösningen i slice kammaren gradvis under flera minuter innan skivor returneras till normal osmolalitet lösning, men detta påverkade inte negativt slice hälsa eller patch clamp inspelning framgång. En hög osmolalitet skärande lösning har tidigare använts för mellanhjärnan slice preparat för att bättre bevara dopaminneuron för patch clamp inspelningar57,58, vilket visar att detta tillfälliga hyperosmolality kan vara fördelaktigt i vissa sammanhang.
Genom att implementera en optimerad förfarande att kombinera NMDG skyddande återställningsmetod och gradvis Na+ utökats spike-i steg nyttan av hjärnan slice metoden för att täcka juvenil genom mogna vuxna djur åldrar. Detta uppdaterade protokoll är nu lämplig för ett brett utbud av djur åldrar använder en enda optimal NMDG aCSF formulering och förfarande. Om det behövs, Na+ spike-i förfarandet kan tillämpas med ett successivt längre dröjsmål eller långsammare tid kursen att förbättra lönsamheten för hjärnan skivor från äldre djur och vi har gett en grundläggande guide Rekommenderad spike-i scheman enligt till djur ålder (se tabell 2). Medan vi har gett en grundläggande ram som är lämplig för ett brett spektrum av applikationer, kan ytterligare avancerade steg utforskas för att ytterligare förbättra lönsamhet och livslängd av hjärnan skivor från vuxna och åldrande djur. Exempelvis strategier för återställande av glutation är särskilt effektiv i detta avseende och kan genomföras som beskrivs på andra ställen2,6.
Att förbättra genomströmning för utmanande experiment
Analysen av synaptic anslutning av patch clamp inspelning är ett krävande program som kräver utmärkt konservering av både neuronala struktur och funktion för att uppnå en hög tillförlitlighet av framgång. Som antalet neuroner registreras samtidigt går upp linjärt, teknisk svårighetsgrad går upp supra-linjärt. Det finns många felmoder, och en av de vanligaste orsakerna till misslyckanden är oförmågan att formuläret adekvat gigaohm tätningar på en eller flera av de rikta cellerna. Detta kan dramatiskt långsamma framsteg, särskilt när tre eller fler nervceller måste registreras samtidigt. Överensstämmer med konstaterandet av snabbare gigaohm försegla bildandet tid med den optimera NMDG skyddande återvinning metoden, det var en markant förbättring i framgång och genomströmning av flera neuron patch clamp inspelning experiment med båda vuxen transgena mus hjärnan skivor och vuxna människohjärnan Neurokirurgiska skivor. Förbättrad effektivitet är nästan säkert kan tillskrivas både snabb och pålitlig gigaohm förseglar bildandet och förbättrad neuronala bevarandet av skivor med detta protokoll. Även om detta protokoll fokuserar på fördelarna uttryckligen för patch-clamp inspelning program, förväntas liknande vinster för andra utmanande experimentella tillämpningar där hjärnan slice lönsamhet är avgörande.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Allen Institute for Brain Science. Författarna vill tacka Allen Institute grundarna Paul G. Allen och Jody Allen, för deras vision, uppmuntran och stöd. Vi tackar också Allen Institute teknisk supportpersonal för att utföra Djurvård, djurskötsel och genotypning.
Compresstome VF-200 | Precisionary Instruments | VF-200 | Vibrating tissue slicer (recommended) |
N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF constituent |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | aCSF constituent |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5405 | aCSF constituent |
Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71505 | aCSF constituent |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | aCSF constituent |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | aCSF constituent |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | aCSF constituent |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | aCSF constituent |
Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | aCSF constituent |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P5280 | aCSF constituent |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | aCSF constituent |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | aCSF constituent |
2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Anesthetic component 1 |
2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | Anesthetic component 2 |
Curved blunt forceps | Fine Science Tools | 11065-07 | Brain dissection tools |
Fine dissecting scissors (supercut) | Fine Science Tools | 14058-09 | Brain dissection tools |
Large heavy duty scissors 7'' | Fine Science Tools | 14000-18 | Brain dissection tools |
Metal spatula | Sigma Aldrich | Z511455-1PAK | Brain dissection tools |
Razor blades | VWR | 89031-954 | Brain dissection tools |
Brain Slice Keeper-4 | Automate Scientific | S-BSK4 | brain slice holding chamber |
nylon netting | Warner Instruments | 64-0198 | For building small slice recovery chambers |
Pyrex glass beakers (250 mL) | VWR | 89090-434 | For building small slice recovery chambers |
35 mm plastic dish, round | VWR | 100488-376 | For building small slice recovery chambers |
Gas diffuser stones (10 µm) | Sigma Aldrich | 59277 | For constant carbogenation (fine bubbles) |
Agarose Type I-B | Sigma Aldrich | A0576 | For embedding brain specimens |
Micro loader tips | Eppendorf | 22491229 | For filling patch clamp electrodes |
Sylgard | VWR | 102092-312 | For making a custom dissecting platform |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758-100ML | For pH adjustment of media |
Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221465-25G | For pH adjustment of media |
Potassium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221473 | For pH adjustment of media |
Plastic transfer pipets 3 mL graduated | VWR | 89497-676 | For slice transfer |
Zirconium ceramic injector blades | Cadence Specialty Blades | EF-INZ10 | http://cadenceinc.com/ |
KG-33 borosilicate glass capillary w/filament | King Glass Company | custom quote | ID: 0.87mm, OD 1.50mm |
Biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | Intern pipette solution |
Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | Intern pipette solution |
Potassium Gluconate | Sigma Aldrich | G4500-100G | Intern pipette solution |
EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Intern pipette solution |
Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | Intern pipette solution |
Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | Intern pipette solution |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | Intern pipette solution |
Heated water bath (2.5L) | VWR | 13491-060 | Miscellaneous |
Filter paper rounds | VWR | 28456-022 | Miscellaneous |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B000BQRBO6 | Miscellaneous |
Glass petri dish | VWR | 89000-326 | Miscellaneous |
10X Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | Miscellaneous |
30 mL syringes | VWR | BD302832 | Miscellaneous |
1 mL syringes | VWR | BD-309628 | Miscellaneous |
25 5/8 gauge needles | VWR | 89219-292 | Miscellaneous |
Thermomixer (w/1.5 mL tube block) | VWR | 89232-908 | To keep agarose molten |